La investigación de la función de Coronin A en la temprana respuesta del hambre de Dictyostelium discoideum Los ensayos de agregación por

El objetivo general de este procedimiento experimental es investigar la respuesta temprana de inanición dependiente de Coronin-A de Dictyostelium discoideum. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como la identificación de las vías de señalización y los factores implicados en el desarrollo temprano de Dictyostelium discoideum. La principal ventaja de esta técnica es que tiene el potencial de proporcionar una herramienta para el cribado automatizado y de alto rendimiento de los factores inductores del desarrollo y las proteínas implicadas en la señalización temprana del desarrollo.

Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades debido a múltiples variables inherentes al ensayo, como las densidades celulares, el tiempo de adherencia y el tiempo de desarrollo. Para comenzar este procedimiento, cultive células DH1.10 o células deficientes en corA en un matraz Erlenmeyer que contenga medio HL-5, a 22 grados Celsius, en una incubadora agitadora a 160 rpm. Mantenga las celdas a una densidad entre una vez 10 a cuatro y dos veces 10 a seis celdas por mililitro.

Para examinar la agregación celular, coseche de 10 a 50 mililitros de células DH1.10 en crecimiento en fase logarítmica o células deficientes en corA generadas en el fondo DH1.10. Centrifugarlos durante tres minutos a 400 veces g. Luego estaban las celdas dos veces en BSS.

Después, cuente las células con un hemocitómetro. Posteriormente, coloque las celdas en una placa de 24 pocillos. Dejar que se adhieran durante una hora a 22 grados centígrados en BSS.

Luego, visualice la agregación celular con microscopía de lapso de tiempo y tome imágenes cada 135 segundos. Para examinar el efecto de los pulsos cíclicos de AMP aplicados externamente en el desarrollo de células DH1.10, o células deficientes en DH1.10 corA, recoja de 10 a 50 mililitros de las células y centrifuérrelas durante tres minutos a 400 veces g. Después de eso, lávelos dos veces en BSS.

Cuente las células con un hemocitómetro. Posteriormente, vuelva a suspender las células a una densidad de uno por 10 a las siete células por mililitro en BSS. A continuación, agitar los cultivos a 22 grados centígrados durante dos horas a 160 rpm antes de aplicar las pulsaciones.

A continuación, aplique pulsos AMP cíclicos utilizando una bomba peristáltica controlada por temporizador. Programe la bomba para que suministre un pulso de cinco segundos de amperaje cíclico cada seis minutos y medio durante un período de cinco horas. Un paso crítico es asegurarse de que la punta de la inyección cíclica de AMP no esté continuamente sumergida en la solución, sino que solo se sumerja periódicamente en las ondas generadas por el agitador.

Después de la aplicación cíclica de AMP, vuelva a contar las células con un hemocitómetro. Luego, coloque las células en una placa de 24 pocillos y deje que se adhieran durante una hora en BSS. Después de 16 horas, visualice la agregación celular a 22 grados centígrados, con microscopía de campo claro utilizando un subjetivo de cinco veces.

En este procedimiento, prepare el medio acondicionado fresco, recolectando células DH1.10 en fase logarítmica o células deficientes en corA DH1.10 de los cultivos agitados con medio HL5, a 22 grados Celsius. Centrifugar las células durante tres minutos a 400 veces g. Después de eso, lávelos tres veces en PBM.

Posteriormente, cuente las células con un hemocitómetro, luego vuelva a suspenderlas en PBM a una densidad de uno por 10 a las siete células por mililitro y agite durante 20 horas a 22 grados centígrados a 110 rpm. A continuación, centrifugar las células a 400 veces g durante tres minutos, seguido de la recogida del medio acondicionado. A continuación, clarificar el medio por centrifugación a 8.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, filtre el medio acondicionado a través de un filtro de 0,45 micrómetros y dilúyalo tres veces en PBM. Cuente las células con un hemocitómetro, colóquelas en una placa de 24 pocillos y deje que se adhieran durante una hora a 22 grados centígrados. A continuación, intercambie el sobrenadante de las células por un medio acondicionado previamente preparado.

Después de 16 horas, visualice la agregación celular con microscopía de campo claro utilizando un subjetivo de cinco veces. Aquí, las células deficientes en Coronina-A muestran un defecto en el desarrollo temprano y no pudieron formar agregados multicelulares, que es el paso inicial durante el ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum. En esta figura, las células vegetativas de tipo salvaje y deficientes en corA se lavaron y se dejaron morir de hambre durante dos horas antes de ser pulsadas con, o sin, 15 AMP animales o cíclicos, cada seis minutos y medio durante cinco horas en suspensión.

La aplicación de pulsos AMP cíclicos exógenos, restauró completamente el fenotipo de tipo salvaje. En esta figura, las células de tipo salvaje y deficientes en corA que crecían exponencialmente, se lavaron en PBM, se sembraron en placas de pocillos múltiples y se incubaron en medio acondicionado obtenido de células de tipo salvaje o de inanición con deficiencia de corA. Las imágenes se tomaron 16 horas después de sembrar las células.

Dictyostelium discoideum, deficientes en corA, fueron capaces de producir todos los factores necesarios para la inducción del desarrollo, pero no pudieron responder a ellos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 20 horas, incluido el tiempo de incubación, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, para diferentes cepas, será necesario ajustar múltiples variables del ensayo, como las densidades celulares, el tiempo de adherencia y el tiempo de desarrollo.

Siguiendo este procedimiento, se puede realizar un fraccionamiento bioquímico y un posterior análisis proteómico con el fin de identificar los factores implicados en la respuesta temprana a la inanición de Dictyostelium discoideum. Después de ver este video, uno debería tener una buena comprensión de cómo inducir el desarrollo temprano en Dictyostelium discoideum en condiciones sumergidas, utilizando medios condicionados, así como pulsos AMP cíclicos.