La investigación de la función de Coronin A en la temprana respuesta del hambre de

El objetivo general de este procedimiento experimental es investigar la respuesta temprana a la privación de nutrientes dependiente de Coronina-A en Dictyostelium discoideum. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Biología del Desarrollo, como la identificación de vías de señalización y factores implicados en el desarrollo temprano de Dictyostelium discoideum. La principal ventaja de esta técnica es que tiene el potencial de proporcionar una herramienta para el cribado automatizado y de alto rendimiento de factores inductores del desarrollo y proteínas involucradas en la señalización del desarrollo temprano.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a las múltiples variables inherentes al ensayo, como las densidades celulares, el tiempo de adherencia y el tiempo de desarrollo. Para comenzar este procedimiento, cultive células DH1.10 o células deficientes en corA en un matraz Erlenmeyer que contenga medio HL-5, a 22 grados Celsius, en un incubador con agitación a 160 rpm. Mantenga las células a una densidad entre uno por diez a la cuatro y dos por diez a la seis células por mililitro.

Para examinar la agregación celular, recoger 10 a 50 mililitros de células DH1.10 en fase logarítmica o células deficientes en corA generadas en el fondo genético DH1.10. Centrifugarlas durante tres minutos a 400 ×g. Luego lavar las células dos veces en BSS.

Posteriormente, cuente las células utilizando un hemocitómetro. A continuación, siembre las células en una placa de 24 pocillos. Deje que se adhieran durante una hora a 22 grados Celsuis en BSS.

Luego, visualice la agregación celular mediante microscopía de lapso de tiempo y tome imágenes cada 135 segundos. Para examinar el efecto de los pulsos de AMP cíclico aplicados externamente sobre el desarrollo de las células DH1.10, o de las células deficientes en corA DH1.10, recolecte de 10 a 50 mililitros de las células y centrifúgelos durante tres minutos a 400 ×g. Después, lávelas dos veces en BSS.

Cuente las células utilizando un hemocitómetro. Posteriormente, re-suspenda las células a una densidad de uno por diez a la siete células por mililitro en BSS. A continuación, agite los cultivos a 22 grados Celsius durante dos horas a 160 rpm antes de aplicar los pulsos.

A continuación, aplique pulsos de AMP cíclico utilizando una bomba peristáltica controlada por un temporizador. Programe la bomba para que entregue un pulso de cinco segundos de AMP cíclico cada seis minutos y medio durante un período de cinco horas. Un paso crítico consiste en asegurar que la punta de inyección de AMP cíclico no permanezca continuamente sumergida en la solución, sino que solo se sumerja periódicamente en las ondas generadas por el agitador.

Después de la aplicación de AMP cíclico, cuente nuevamente las células utilizando un hemocitómetro. Luego, siembre las células en una placa de 24 pocillos y permita que se adhieran durante una hora en BSS. Después de 16 horas, visualice la agregación celular a 22 grados Celsius, mediante microscopía de campo brillante utilizando un objetivo de cinco x.

En este procedimiento, prepare medio condicionado fresco recolectando células en fase logarítmica de DH1.10 o células deficientes en corA de DH1.10 a partir de cultivos agitados en medio HL5, a 22 grados Celsius. Centrifugue las células durante tres minutos a 400 ×g. Posteriormente, lávelas tres veces en PBM.

Posteriormente, cuente las células utilizando un hemocitómetro. Luego, re-suspenda las células en PBM a una densidad de uno por diez a la siete células por mililitro y agítelas durante 20 horas a 22 grados Celsius y 110 rpm. A continuación, centrifugue las células a 400 × g durante tres minutos, seguido de la recolección del medio acondicionado. Posteriormente, clarifique el medio mediante centrifugación a 8.000 × g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.

Luego, filtre el medio condicionado a través de un filtro de 0,45 micrómetros y dilúyalo tres veces en PBM. Cuente las células utilizando un hemocitómetro, siémbrelas en una placa de 24 pocillos y déjelas adherir durante una hora a 22 grados Celsius. A continuación, cambie el sobrenadante de las células por medio condicionado previamente preparado.

Después de 16 horas, visualice la agregación celular mediante microscopía de campo claro utilizando un objetivo de cinco aumentos. Aquí, las células deficientes en Coronina-A presentan un defecto en el desarrollo temprano y son incapaces de formar agregados multicelulares, que es la etapa inicial durante el ciclo de desarrollo de Dictyostelium discoideum. En esta figura, las células silvestres vegetativas y las células deficientes en corA se lavaron y se sometieron a ayuno durante dos horas antes de ser pulsadas, con o sin 15 animal o AMP cíclico, cada seis minutos y medio durante cinco horas en suspensión.

La aplicación de pulsos exógenos de AMP cíclico restauró completamente el fenotipo de tipo salvaje. En esta figura, células de tipo salvaje y células deficientes en corA en crecimiento exponencial se lavaron en PBM, se sembraron en placas de múltiples pozos y se incubaron en medio acondicionado obtenido de células de tipo salvaje o células deficientes en corA en estado de ayuno. Las imágenes se tomaron 16 horas después de sembrar las células.

Dictyostelium discoideum deficiente en corA fueron capaces de producir todos los factores necesarios para la inducción del desarrollo, pero no pudieron responder a ellos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 20 horas, incluido el tiempo de incubación, si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, para diferentes cepas, será necesario ajustar múltiples variables del ensayo, como las densidades celulares, el tiempo de adherencia y el tiempo de desarrollo.

Tras seguir este procedimiento, se puede realizar una fraccionamiento bioquímico y un análisis proteómico posterior para identificar factores implicados en la respuesta temprana al ayuno de Dictyostelium discoideum. Después de ver este video, se deberá tener una buena comprensión de cómo inducir el desarrollo temprano en Dictyostelium discoideum en condiciones sumergidas, utilizando medios acondicionados o pulsos de AMP cíclico.