La combinación de doble fluorescencia In Situ La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

El objetivo general de este experimento es detectar simultáneamente la expresión de tres genes diferentes en secciones del cerebro, utilizando hibridación in situ de doble fluorescencia seguida de inmunotinción. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como ¿qué tipo de célula expresa mi gen de interés? La principal ventaja de esta técnica es que no necesitas un buen anticuerpo para que tu gen de interés pueda localizar su expresión en un tipo de célula específico.

Para resumir este procedimiento, el primer día, se cortan secciones de tejido fijas y se hibridan con dos sondas de ARN marcadas de manera diferente durante la noche. Al segundo día, las secciones se incuban durante la noche con un anticuerpo dirigido a la sonda marcada con FITC. Este anticuerpo se conjuga con la peroxidasa de rábano picante, que cataliza la adición de una tiramida fluorescente al tercer día.

A continuación, se utiliza un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina para dirigirse a la sonda marcada con DIG. En el cuarto día, esta enzima cataliza la formación de precipitado fluorescente cuando se incuba con una solución Fast Red. Luego, las secciones se incuban durante la noche con un anticuerpo primario dirigido a una proteína de interés.

Finalmente, en el quinto día, esta proteína se visualiza con un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos. Para comenzar este procedimiento, elija un clon de ADN que contenga la secuencia de ADNc del gen de interés en un plásmido con promotores de ARN polimerasa. A continuación, cultive el clon de ADN, extraiga el plásmido con un kit de purificación de plásmidos a pequeña escala y señéelo con cebadores universales T7 y SP6.

Digiera de 10 a 20 microgramos de ADN plasmídico con una enzima de restricción que corta en los cinco extremos principales de la cadena sensorial del ADNc. Incubarlo durante 1,5 horas a 37 grados centígrados. A continuación, ejecute una pequeña alícuota en un gel de agarosa para comprobar que el plásmido está completamente linealizado.

Para purificar el plásmido linealizado, agregue 1/10 del volumen de acetato de sodio de tres molares, un volumen de fenol equilabrado de Tris-HCl de 10 milimolares y un volumen de alcohol isoamílico de cloroformo. Centrifugar a 16.000 Gs durante un minuto a temperatura ambiente y extraer la fase acuosa superior. A continuación, añada un volumen de cloroformo IAA.

Centrifugar a 16.000 Gs durante un minuto y extraer la fase acuosa superior. Repita este paso una vez más. Luego, agregue dos volúmenes de etanol y manténgalo a menos 20 grados Celsius durante una hora o toda la noche.

Después de eso, centrifugar a 16, 000 G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con etanol frío al 70%. A continuación, vuelva a suspenderlo en TE a una concentración de un microgramo de ADNc por cada 2,5 microlitros.

Para sintetizar las dos sondas, primero seleccione la ARN polimerasa adecuada. A continuación, prepare la reacción de transcripción in vitro y lleve el volumen final hasta 20 microlitros con agua tratada con DEPC. Incubar a 37 grados centígrados durante 1,5 horas.

A continuación, ejecute un microlitro de la reacción de transcripción en un gel de agarosa al 1% para comprobar si la reacción ha funcionado. El gel debe mostrar la plantilla lineal y una banda brillante de la sonda. En este procedimiento, corte secciones de 15 micrómetros de espesor de tejido congelado en un criostato.

Recoja las secciones en los portaobjetos del microscopio y déjelos secar durante una hora para asegurarse de que los tejidos se adhieran a los portaobjetos. El factor más importante para que este procedimiento funcione bien es la calidad de las secciones. Esto depende en parte de tener tejido bien perfundido y fijado, y en parte de la técnica de corte para obtener secciones planas que estén libres de contaminación por RNasa.

Luego, diluya las dos sondas en un tampón de hibridación precalentado a 65 grados centígrados y mezcle bien. Aplique 300 microlitros de mezcla de hibridación en cada portaobjetos y cúbralo con un cubreobjetos horneado. Posteriormente, incubar los portaobjetos durante la noche a 65 grados centígrados en una cámara humidificada.

Al día siguiente, transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin que contenga tampón de lavado precalentado y lave los portaobjetos durante 30 minutos, dos veces, a 65 grados centígrados. Después de eso, lave los portaobjetos durante 10 minutos tres veces con solución de lavado MABT a temperatura ambiente. En este paso, use un bolígrafo hidrofóbico para dibujar círculos alrededor de las secciones de tejido.

A continuación, incubar los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente con tampón de bloqueo ISH en una cámara humidificada. A continuación, incube los portaobjetos durante la noche a 4 grados centígrados con un anticuerpo anti-fitc conjugado peroxidado con rábano picante. Luego, coloque los portaobjetos en un frasco de coplin que contenga PBST.

Lávelos en PBST tres veces durante 10 minutos cada vez y reemplácelos con PBST nuevo cada vez. Después, añade tiromide fluorescente a los portaobjetos y déjalos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Coloque los portaobjetos en un frasco de coplin y lávelos en PBST durante 10 minutos tres veces.

A continuación, incube los portaobjetos con tampón de bloqueo ISH durante una hora a temperatura ambiente. Luego, incube los portaobjetos durante la noche a cuatro grados centígrados con un anticuerpo anti-dig conjugado con fosfatasa alcalina. Después de eso, lávelos con MABT tres veces durante 10 minutos cada vez.

A continuación, lave los portaobjetos dos veces con 0,1 molar tris HCL a pH 8,2 durante cinco minutos a temperatura ambiente. Filtre la solución de rojo rápido e incube los portaobjetos a 37 grados centígrados con solución de rojo rápido en una cámara humidificada. Dado que el tiempo para el desarrollo óptimo varía, revise los portaobjetos regularmente con un microscopio fluorescente para controlar la formación de precipitado.

Luego, lávelos tres veces con PBST durante 10 minutos cada vez. Para realizar la inmunohistoquímica, incube los portaobjetos con tampón de bloqueo de IHQ durante una hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada. A continuación, incube los portaobjetos en la solución primaria de anticuerpos a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, lave los portaobjetos con PBST durante 10 minutos tres veces. Incubarlos en la solución secundaria de anticuerpos a temperatura ambiente durante una hora. Luego, lávelos con PBST tres veces durante 10 minutos cada vez.

Posteriormente, seque parcialmente los portaobjetos a temperatura ambiente y móntelos con un medio de montaje de fluorescencia. Deje que los portaobjetos se sequen antes de obtener imágenes de ellos en un microscopio confocal. A continuación se muestran las imágenes representativas de ISH para Aspa y Mbp, seguidas de la inmunotinción para OLIG2 combinada con la tinción con gancho.

Aspa se expresó en algunas células positivas para OLIG2 MBP en la corteza y en el cuerpo calloso. Algunas células OLIG2 positivas para Mbp no expresan Aspa. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las rodajas y todas las soluciones libres de contaminación por RNasa.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar los patrones de expresión génica mediante la inhibición de N-citrino y la inmunohistoquímica. Esta técnica se puede adaptar a una variedad de tejidos de diferentes orígenes y etapas de desarrollo.