Name: La combinación de doble fluorescencia In Situ La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprende a detectar simultáneamente tres genes en secciones cerebrales de ratón mediante hibridación in situ de doble fluorescencia combinada con inmunotinción. Este método permite localizar la expresión génica en tipos celulares específicos sin necesidad de anticuerpos para todos los objetivos.

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El trabajo en los laboratorios de los autores fue apoyado por el Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas del Reino Unido (BB/J006602/1 y BB/L003236/1), el Wellcome Trust (WT100269MA) y el Consejo Europeo de Investigación (ERC, Programa "Ideas" 293544). SJ contó con el apoyo de una beca a largo plazo de EMBO. Los autores agradecen a Stephen Grant por su asistencia técnica.

Declaración de Ética: Ratón cría y manejo están en conformidad con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y las directrices del comité de ética de la UCL, el cumplimiento de la Ley de 1986 del Reino Unido y su Reglamento Enmienda 2012 Animales (Procedimientos Científicos). NOTA: Todas las soluciones deben realizarse con pirocarbonato de dietilo (DEPC) - tratado con agua para destruir cualquier RNasa residual. Para el tratamiento DEPC, añadir DEPC (1 ml por litro), agitar vigorosamente hasta que todos los glóbulos DEPC han desaparecido continuación en autoclave para degradar la DEPC. 1. ARN sonda Síntesis <ol><li> PRECAUCIÓN: Al manipular formamida, llevar equipo de protección personal (EPP) y el uso de una cabina de seguridad. Preparar tampón de hibridación: tratada con DEPC agua desionizada con 50% (v / v) de formamida desionizada, NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml tRNA de levadura, 1 x de Denhardt solutien, y 10% w / v de sulfato de dextrano. </li><li> Elija un clon de ADN que contiene la secuencia de ADNc del gen de interés en un plásmido con promotores de ARN polimerasa. Para este ejemplo, utilice un clon pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), con promotores T7 y polimerasa de ARN SP6 para Aspa (Figura 1). </li><li> Preparar ADN de plásmido linealizado como molde. <ol><li> Crecer el clon de ADN, extraer el plásmido con un kit de purificación de plásmido a pequeña escala de acuerdo con el protocolo del fabricante y la secuencia con la T7 y cebadores universales SP6. </li><li> Se digiere el plásmido de ADN 1020 g con una enzima de restricción que corta en el extremo 5 &#39;de la hebra codificante del ADNc. Para este ejemplo, utilice 100 unidad de Sal I para digerir el plásmido pCMV-SPORT6- Aspa. Incubar durante 1,5 horas a 37 ° C. </li><li> Ejecutar una pequeña alícuota en un gel de agarosa para comprobar que el plásmido se linealizó completamente. </li></ol></li><li> Se purifica elplásmido linealizado utilizando fenol-cloroformo. <ol><li> Añadir 1/10 volumen de acetato de sodio 3 M, un volumen de 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - fenol equilibrado y un volumen de cloroformo / alcohol isoamílico (IAA) (24: 1). </li><li> Centrifugar a 16.000 xg durante 1 min a TA (20 - 25 ° C, RT) y se extrae la fase acuosa superior. </li><li> Añadir un volumen de cloroformo / IAA, centrifugar a 16.000 xg durante 1 min y se extrae la fase acuosa superior. </li><li> Repita el paso 1.4.3. </li><li> Añadir 2 volúmenes de etanol y dejar a -20 ° C durante 1 hora u O / N. </li><li> Centrifugar a 16.000 xga 4 ° C durante 10 min. Descartar el sobrenadante. </li><li> Lavar el precipitado con etanol al 70% frío y resuspender en aproximativamente 1 g de ADNc por 2,5 l de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5). </li></ol></li><li> Sintetizar las dos sondas, uno marcado con digoxigenina (DIG) y la otra con isotiocianato de fluoresceína (FITC). <ol><li> Seleccione la ARN polimerasa apropiada para hacer que el anti-SEsonda NSE (complementario al ARNm diana). Para este ejemplo, el uso de T7 ARN polimerasa para hacer sonda Aspa. </li><li> Preparar reacción de transcripción in vitro: añadir al menos 1 g de ADN linealizado, 4,0 l 5 tampón de transcripción x, 6,0 l de DTT 100 mM, 2,0 l de dNTPs que contienen 10 veces más DIG o FITC ARN mezcla de marcaje, 1 l inhibidor de RNasa, y 20 - 40 unidades de la ARN polimerasa; hacer que el volumen final hasta 20 l con agua tratada con DEPC. </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 1,5 horas. </li></ol></li><li> l run1 de la reacción de transcripción en un gel de agarosa al 1,0% para comprobar que la reacción ha funcionado. El gel debe mostrar la plantilla lineal y una banda brillante de la sonda. </li><li> Completar el volumen hasta 100 l con tampón de hibridación y almacenar 10 ml de alícuotas a -80 ° C. </li></ol> 2. Perfusión, Fijación y Recogida de tejido <ol><li> PRECAUCIÓN: Al manipular paraformaldehído (PFA), tanto sólidos comoacuosa, usar el PPE y el uso de una cabina de seguridad. Preparar la solución de formaldehído por disolución de 4% de solución de PFA en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (v w /) usando calor (55 ° C). Se filtra la solución de formaldehído con papel de filtro. </li><li> Preparar la solución de sacarosa disolviendo 20% (w / v) de sacarosa en agua destilada y añadir 0,1% (v / v) de solución de DEPC. Deja O / N a temperatura ambiente con una tapa suelta y luego autoclave. </li><li> Terminal anestesiar un ratón mediante inyección intra-peritoneal de pentobarbital (50 mg / kg). Evaluar la profundidad de la anestesia por pellizco del dedo del pie y la ausencia de reflejo de retirada indica anestesia profunda. </li><li> Una vez que el ratón está bajo anestesia profunda, hacer una incisión debajo de la caja torácica y cortar a través de la caja torácica en ambos lados, levántela para exponer el corazón. </li><li> Inserte una aguja 25-G en el ventrículo izquierdo del corazón. Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón. </li><li> Perfundir el animal con 20 ml de PBS y luego una solución de formaldehído 40 ml. Para P30 y mayoresratones, utilice una velocidad de perfusión de 12 ml / min, pero para los animales más jóvenes utilizan una tasa más baja (7-10 ml / min). </li><li> Diseccionar el cerebro. <ol><li> Cortar la cabeza del ratón con tijeras quirúrgicas, haciendo un corte posterior de las orejas. Hacer una incisión en la línea media en la piel caudal y rostral trabajar para eliminar la piel de cráneo. </li><li> A partir de la parte caudal, cortar a través de la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media y entre los ojos con unas tijeras iris. Retire el parietal y placas óseas frontales por la inclinación de un lado de una placa de hueso cada vez y encajándola con pinzas. </li><li> inclinar suavemente el cerebro hacia arriba desde la parte anterior con pinzas y cortar los nervios ópticos y otros nervios craneales. Levante con cuidado el cerebro fuera del cráneo. </li></ol></li><li> Coloque el cerebro en una matriz coronal del cerebro del ratón. Cortar el cerebro en aproximadamente 4 piezas 3 mm con una cuchilla de afeitar de plumas. </li><li> Transferir las rebanadas en solución PFA 4% e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> transferencia cerebrorebanadas de tratada con DEPC 20% de solución de sacarosa y se incuban O / N a 4 ° C </li><li> Coloque cada corte de cerebro en un cryomould seca, rodear con la temperatura óptima de corte (OCT) medio y la congelación en hielo seco. Almacenar a -80 ° C. </li></ol> 3. cryosectioning <ol><li> Cortar 15 micras secciones de tejido congelado en un criostato y recoger las secciones en portaobjetos de microscopio. Si es necesario, humedecer las secciones con PBS tratada con DEPC y se aplanan con un pincel fino. </li><li> Deja las diapositivas secar durante aproximadamente 1 hr para asegurar que el tejido se adhiere a la diapositiva. </li></ol> 4. La hibridación <ol><li> Preparar 65 ° C tampón de lavado: NaCl 150 mM, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x solución salina de citrato de sodio), 50% (v / v) de formamida y 0,1% (v / v) de Tween- 20. </li><li> Preparar tampón MABT: mM ácido maleico 100, NaCl 150 mM, 0,1% (v / v) de Tween-20, pH 7,5. </li><li> Diluir las dos sondas (DIG-etiquetados y FITC-Labelled) 1 / 1.000 en tampón de hibridación precalentado a 65 ° C y mezclar bien. </li><li> Aplicar alrededor de 300 l de mezcla de hibridación en cada diapositiva, coverslipwith (C 200 o) cubreobjetos al horno y se incuba O / N a 65 ° C en una cámara húmeda. </li><li> Transferir los portaobjetos en una jarra Coplin que contiene tampón de lavado pre-calentado. Se lavan los portas durante 30 minutos dos veces a 65 ° C con tampón de lavado. </li><li> Se lavan los portas durante 10 minutos tres veces con MABT a TA. </li></ol> 5. La visualización de la sonda FITC <ol><li> Preparar tampón de bloqueo ISH: MABT con 2% de reactivo de bloqueo y suero de oveja inactivado por calor 10%. </li><li> Opcional: utilizar una pluma hidrófobo para dibujar círculos alrededor de las secciones de tejido en la diapositiva para reducir el volumen de soluciones de anticuerpos requeridos. </li><li> Incubar los portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente con ISH tampón de bloqueo en una cámara húmeda. </li><li> Incubar el portaobjetos O / N a 4 ° C con una peroxidasa de rábano picante (POD) - conjugadod anticuerpo anti-FITC diluido 1/500 (v / v) de tampón en ISH de bloqueo. </li><li> Colocar los portaobjetos en un tarro Coplin que contenía PBS con 0,1% (v / v) de Tween-20 (PBST). Lavar 3 veces durante 10 minutos en PBST y reemplazar con PBST fresco cada vez. </li><li> Inmediatamente antes de su uso, preparar la tiramida fluorescente mediante la dilución de 100 veces en el diluyente de amplificación. Para este ejemplo, utilizar FITC-tiramida. </li><li> Agregue esto a los portaobjetos y dejar actuar durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Colocar los portaobjetos en una jarra Coplin y lavar 3 veces en PBST durante 10 minutos. </li></ol> 6. La visualización de la sonda DIG <ol><li> Preparar 0,1 M Tris-HCl pH 8,2. </li><li> Incubar los portaobjetos con tampón de bloqueo ISH durante 1 hora a RT. </li><li> Incubar el portaobjetos O / N a 4 ° C con una fosfatasa alcalina (AP) conjugado con anticuerpo anti-DIG diluido 1 / 1.500 (v / v) de tampón en ISH de bloqueo. </li><li> Lavar con MABT durante 10 minutos tres veces. </li><li> Lavar dos veces con 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 durante 5 min a RT. </li><li>Inmediatamente antes de su uso, preparar la solución Fast Red por disolución de las tabletas en Tris 0,1 M pH 8,2. Se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 M. </li><li> Incubar los portaobjetos a 37 ° C con una solución de Fast Red en una cámara húmeda. A medida que el tiempo para el desarrollo óptimo varía, compruebe las diapositivas regularmente con un microscopio de fluorescencia para monitorizar la formación de precipitado. Para este ejemplo, detener la reacción después de 2 - 3 hr. </li><li> Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces. </li></ol> 7. La inmunohistoquímica <ol><li> Preparar el tampón de bloqueo IHC: 10% (v / v) de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario) en PBST. </li><li> Incubar los portaobjetos con IHC tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada. </li><li> Preparar el anticuerpo primario: diluir el anticuerpo primario a una dilución apropiada en PBST con 5% de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario). Para este ejemplo, utilizar un anticuerpo de conejo anti-Olig2 a 1/400 (v / v) de dilución. </li><li>Incubar en la solución de anticuerpo primario a 4 ° CO / N. </li><li> Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces. </li><li> Preparar el anticuerpo secundario: diluir un anticuerpo secundario fluoróforo conjugado a una dilución apropiada en PBST con 5% (v / v) de suero (de una especie diferente a anfitrión anticuerpo primario) y 0,1% (v / v) de Hoechst 33258. Para este ejemplo , utilizar un burro anti-conejo Alexa647 anticuerpo secundario a 1 / 1.000 (v / v) de dilución. </li><li> Incubar en la solución de anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavar con PBST durante 10 minutos tres veces. </li></ol> 8. montaje <ol><li> Parcialmente secar los portaobjetos a TA, y montar con un medio de montaje de fluorescencia. Deja las diapositivas secar y luego la imagen en un microscopio confocal bajo 10X, 20X y 63X objetivos utilizando 4 canales diferentes con las siguientes longitudes de onda de excitación: 570 nm para Fast Red, 488 nm para FITC, 647 nm para Olig2 immunolabelling y 350 nm para Hoechst . </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para un ARN de doble hibridación in situ seguido de inmunotinción. Hemos utilizado este protocolo para confirmar que Aspa se expresa en oligodendrocitos maduros en varias áreas del cerebro. Este procedimiento de múltiples etapas tiene muchos peligros potenciales que pueden afectar a la sensibilidad y debe ser evitado. En primer lugar, todas las soluciones y tampones de almacenamiento para la reacción de transcripción n...

Las células gliales, que son las células más abundantes en el sistema nervioso central (CNS), comprenden los oligodendrocitos (las células mielinizantes de CNS), oligodendrocitos precursores (PO, también conocidos como &quot;células NG2&quot;), astrocitos y microglia. Existe un creciente interés en las funciones de las células gliales y sus posibles funciones en enfermedades neurológicas 1. Por ejemplo, la enfermedad de Canavan (CD) es una enfermedad neurodegenerativa hereditaria a partir de principios en la infancia con leucodistrofia espongiforme y una pérdida progresiva de las neuronas, lo que lleva a la muerte por lo general antes de los 10 años de edad 2,3. Las mutaciones en el gen Aspartoacyclase (ASPA), que conducen a reducir drásticamente la actividad ASPA 4 en CD han sido identificados. ASPA es una enzima que cataliza la desacetilación de la N-acetil aspartato (NAA), una molécula altamente concentrado en el cerebro, acetato de generar y aspartato 5-7. Muchos pacientes con EC presentan mayores niveles de NAA, debido a la falta de ASPA actividad. Algunos estudios especulan que el acetato derivado de NAA podría ser una fuente importante de ácidos grasos / lípidos en el cerebro durante el desarrollo y CD puede resultar de la disminución de la síntesis de mielina durante el desarrollo causada por el fracaso de NAA ser desglosado 3,5,6. ASPA se encuentra predominantemente en el riñón, el hígado y la materia blanca del cerebro, y dado el importante papel de ASPA en CD, la expresión celular de esta enzima en el cerebro ha sido estudiada por varios laboratorios. Al mirar a la actividad enzimática ASPA en el cerebro, los estudios anteriores encontraron que el aumento de la actividad ASPA durante el desarrollo del cerebro es paralela a la evolución temporal de la mielinización 8-10. A nivel celular, los ensayos para la actividad enzimática, así como hibridación in situ (ISH) y la inmunohistoquímica (IHC) análisis sugieren que ASPA se expresa principalmente en oligodendrocitos en el cerebro pero no en las neuronas o astrocitos 11-16. Algunos estudios encontraron que éstos también ASPAexpresarse en microglia en el SNC 12,14. Hasta ahora los datos sobre la expresión de ASPA en OPs son limitadas. Según un estudio reciente en el que transcriptomes de diferentes tipos de células en la corteza cerebral de ratón incluyendo neuronas, astrocitos, PO, oligodendrocitos recién formados, los oligodendrocitos mielinizantes, microglia, células endoteliales, y los pericitos se analizaron mediante secuenciación de RNA 17, ASPA se expresa exclusivamente en oligodendrocitos , en particular en myelinating oligodendrocitos (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). A pesar de estos estudios sobre el patrón de expresión de ASPA en el cerebro, una serie de incertidumbres permanecen. Las diferentes técnicas se pueden utilizar para estudiar los patrones de expresión de genes. IHC es un método comúnmente utilizado para detectar el producto funcional (es decir, proteína) de un gen de expresión en secciones de tejido. A pesar de su gran utilidad, esta técnica tiene limitaciones en cuanto a su aplicación y especificidad están sujetas to la disponibilidad y la especificidad del anticuerpo sea necesario. En comparación, la ISH tiene la ventaja de ser capaz de revelar la expresión de cualquier gen en el nivel de mRNA. Sin embargo, puede ser técnicamente difícil de utilizar varias sondas al mismo tiempo con el fin de localizar una expresión de genes a determinados tipos de células. En este artículo, se describe un protocolo que combina ARN de doble fluorescencia de hibridación in situ con fluorescencia immunolabelling de una proteína. Hemos utilizado este conjunto de técnicas para examinar el patrón de expresión de Aspa en cerebro de ratón. Este método permite el estudio preciso de la expresión génica utilizando microscopía confocal.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Formamida desionizada</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>para tampón de bloqueo de ISH</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico anhidro</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico dihidratado</td><td>Sigma</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levadura</td><td>Roche</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x Solución de Denhardt</td> Life <td>Technologies</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Aspa clon de ADNc</td><td>Fuente: Bioscience</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Fenol equilibrado</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isoamílico</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 ARN polimerasa</td><td>Promega</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de transcripción</td><td>Promega</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM TDT</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG Mezcla NTP Roche</td><td></td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Fisher científico</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitona</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>tijeras de disección</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 25</td><td>Terumo</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Cole-Parmer Instrument Co., Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>Weiss</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2 pinzas</td><td>World Precision Instruments</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>Matriz cerebral coronal</td><td>World Precision Instruments</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar Personna</td><td>Medical</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>medio Tissue tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de criostato/micrótomo</td><td>Bright</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>para 65 &deg; C tampón de lavado</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Suero de oveja inactivado por calor</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Pluma hidrofóbica</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&alpha;-FITC POD-anticuerpo conjugado Roche</td><td></td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&trade; Plus Sistema de fluoresceína</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&alpha;-DIG AP conjugado</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Fast tabletas rojas</td><td>Roche</td><td>11496549001.22</td><td></td></tr> <tr><td>&micro; Filtro M</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Olig2 Cuerpo de hormiga de conejo</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647-conjugado &alpha;-anticuerpo de conejo</td><td>Life technologies</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>bisBenzimida H 33258</td><td>sigma</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 confocal microscopio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la combinación de doble fluorescencia<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación con immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

La detección de la expresión de genes en diferentes tipos de células cerebrales, por ejemplo, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, precursores de oligodendrocitos y microglia, puede verse obstaculizada por la falta de anticuerpos primarios o secundarios específicos para la inmunotinción. Aquí se describe un protocolo para detectar la expresión de tres genes diferentes en la misma sección cerebral mediante doble fluorescencia de hibridación in situ con dos sondas de genes específicos, seguido de inmunotinción con un anticuerpo de alta especificidad dirigido contra la proteína codificada por un tercer gen. El gen Aspartoacyclase (ASPA), las mutaciones de que puede conducir a una enfermedad de la materia blanca humana rara - enfermedad de Canavan - se cree que está expresado en oligodendrocitos y microglia, pero no en astrocitos y neuronas. Sin embargo, aún no se ha establecido el patrón de expresión precisa de ASPA en el cerebro. Este protocolo nos ha permitido determinar que ASPA se expresa en un subconjunto de los oligodendrocitos maduros unand en general se puede aplicar a una amplia gama de estudios de patrones de expresión génica.

Este artículo describe un método para un ISH doble fluorescencia seguido de inmunomarcaje en las secciones de cerebro de ratón. Una breve descripción de este protocolo se muestra en la Figura 1. El primer paso fue sintetizar sondas específicas para Aspa y MBP (proteína básica de mielina). Para comprobar que las sondas se han sintetizado, una pequeña alícuota de cada reacción se realizó en un gel de agarosa. La plantilla lineal débil y una gran cantidad ...

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

El objetivo general de este experimento es detectar simultáneamente la expresión de tres genes diferentes en secciones cerebrales, utilizando hibridación in situ con doble fluorescencia seguida de inmunomarcado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como ¿qué tipo de célula expresa mi gen de interés? La ventaja principal de esta técnica es que no se necesita un buen anticuerpo para el gen de interés con el fin de localizar su expresión en un tipo celular específico.Para resumir este procedimiento, el primer día se cortan secciones de tejido fijado y se hibridan con dos sondas de ARN marcadas diferencialmente durante la noche. El segundo día, las secciones se incuban durante la noche con un anticuerpo dirigido contra la sonda marcada con FITC. Este anticuerpo está conjugado con peroxidasa de rábano picante, que cataliza la adición de una tirosamida fluorescente al tercer día.Luego, se utiliza un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina para dirigirse a la sonda marcada con DIG. En el día cuatro, esta enzima cataliza la formación de un precipitado fluorescente cuando se incuba con la solución Fast Red. A continuación, se incubarán las secciones durante la noche con un anticuerpo primario dirigido contra una proteína de interés.Finalmente, en el día cinco, esta proteína se visualiza con un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo. Para comenzar este procedimiento, seleccione un clon de ADN que contenga la secuencia de ADN complementario del gen de interés en un plásmido con promotores de ARN polimerasa. A continuación, cultive el clon de ADN, extraiga el plásmido con un kit de purificación de plásmidos a pequeña escala y secuencie con cebadores universales T7 y SP6.Digiera de 10 a 20 microgramos de ADN plasmídico con una enzima de restricción que corte en el extremo cinco prime de la cadena sentido del ADNc. Incube durante 1,5 horas a 37 grados Celsius. Luego, corra una pequeña alícuota en un gel de agarosa para verificar que el plásmido esté completamente linealizado.Para purificar el plásmido linealizado, agregue 1/10 del volumen de acetato de sodio tres molar, un volumen de fenol equilibrado con Tris-HCl 10 milimolar, y un volumen de cloroformo alcohol isoamílico. Centrifugue a 16.000 Gs durante un minuto a temperatura ambiente y extraiga la fase acuosa superior. Luego agregue un volumen de cloroformo IAA.Centrifúguelo a 16.000 G durante un minuto y extraiga la fase acuosa superior. Repita este paso una vez más. A continuación, agregue dos volúmenes de etanol y manténgalo a menos 20 grados Celsius durante una hora o durante la noche.Después de eso, centrifugar a 16.000 Gs a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Desechar el sobrenadante y lavar el botón con etanol frío al 70 %. Luego, volver a suspenderlo en TE a una concentración de un microgramo de ADNc por 2,5 microlitros.Para sintetizar las dos sondas, primero seleccione la ARN polimerasa apropiada. Luego, prepare la reacción de transcripción in vitro y afora el volumen final a 20 microlitros con agua tratada con DEPC. Incube a 37 grados Celsius durante 1.5 horas.Posteriormente, corra un microlitro de la reacción de transcripción en un gel de agarosa al 1% para verificar si la reacción ha funcionado. El gel debe mostrar la plantilla lineal y una banda intensa de la sonda. En este procedimiento, corte secciones de tejido congelado de 15 micrómetros de espesor en un criostato.Coloque las secciones sobre los portaobjetos del microscopio y deje que los portaobjetos sequen durante una hora para asegurar que los tejidos se adhieran. El factor más importante para que este procedimiento funcione bien es la calidad de las secciones. Esto depende en parte de tener un tejido bien perfundido y fijado, y en parte de la técnica de corte para obtener secciones planas que estén libres de contaminación por RNasas.Luego, diluya las dos sondas en tampón de hibridación precalentado a 65 grados Celsius y mezcle bien. Aplique 300 microlitros de la mezcla de hibridación sobre cada portaobjetos y cúbralo con una cubeta previamente horneada. Posteriormente, incube los portaobjetos durante la noche a 65 grados Celsius en una cámara humidificada.Al día siguiente, transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin que contenga tampón de lavado precalentado y lávelos durante 30 minutos, dos veces, a 65 grados Celsius. Después de eso, lave los portaobjetos durante 10 minutos, tres veces, con solución de lavado MABT a temperatura ambiente. En este paso, use un bolígrafo hidrófobo para dibujar círculos alrededor de las secciones de tejido.A continuación, incubar las laminillas durante una hora a temperatura ambiente con tampón bloqueante para hibridación in situ en una cámara humidificada. Después, incubar las laminillas durante la noche a 4 grados Celsius con un anticuerpo anti-FITC conjugado con peroxidasa de rábano picante. Luego, colocar las laminillas en un frasco Coplin que contenga PBST.Lávelos en PBST tres veces durante 10 minutos cada vez, y reemplace con PBST fresco cada vez. Posteriormente, añada tiromida fluorescente a los portaobjetos y déjelos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Coloque los portaobjetos en un frasco Coplin y lávelos en PBST durante 10 minutos tres veces.Posteriormente, incubar las laminillas con el tampón bloqueante de HSI durante una hora a temperatura ambiente. Luego, incubar las laminillas durante la noche a cuatro grados Celsius con un anticuerpo anti-dig conjugado con fosfatasa alcalina. Después, lavarlas tres veces con MABT durante 10 minutos cada vez.A continuación, lave las laminillas dos veces con tris HCl 0,1 molar a pH 8,2 durante cinco minutos a temperatura ambiente. Filtre la solución de rojo rápido e incube las laminillas a 37 grados Celsius con la solución de rojo rápido en una cámara humedecida. Dado que el tiempo para un desarrollo óptimo varía, revise las laminillas regularmente con un microscopio de fluorescencia para monitorear la formación del precipitado.Luego, lávese tres veces con PBST durante 10 minutos cada vez. Para realizar inmunohistoquímica, incube las laminillas con tampón bloqueador para IHC durante una hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada. A continuación, incube las laminillas en la solución de anticuerpo primario a cuatro grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, lave las laminillas con PBST durante 10 minutos tres veces. Incúbelas en la solución de anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante una hora. Luego, lávelas con PBST tres veces durante 10 minutos cada vez.Posteriormente, seque parcialmente las laminillas a temperatura ambiente y monte con un medio de montaje para fluorescencia. Deje secar las laminillas antes de obtener imágenes en un microscopio confocal. Aquí se muestran imágenes representativas de la hibridación in situ para Aspa y Mbp, seguidas de inmunomarcado para OLIG2 combinado con tinción con gancho.Aspa se expresó en algunas células MBP-positivas OLIG2-positivas en la corteza y en el cuerpo calloso. Algunas células Mbp-positivas OLIG2-positivas no expresan Aspa. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener los cortes y todas las soluciones libres de contaminación por RNasa.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar los patrones de expresión génica mediante la inhibización con N-citrina e inmunohistoquímica. Esta técnica puede adaptarse para una variedad de tejidos de diferentes orígenes y etapas de desarrollo.

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Investigación

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Neurociencia

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Una combinación de diferentes técnicas para maximizar la recogida de datos a partir de tejido de ratón se presenta.

La combinación de colorantes lipofílicos, In situ</emHibridación>, inmunohistoquímica y la histología

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 Realización de hibridación in situ de doble fluorescencia para detectar la expresión génica en secciones del cerebro de ratón

Fuente: Baleriola, J., et. al., Detección de ARNm localizados axonalmente en secciones cerebrales mediante hibridación in situ de alta resolución.  J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra la detección de ARNm dentro de axones colinérgicos en cortes fijos de hipocampo de ratón utilizando hibridación fluorescente in situ y tinción de anticuerpos. La microscopía de fluorescencia revela la localización espacial de los ARNm marcados con sonda y la colina acetiltransferasa en las neuronas...

Inmunotinción de neuronas en cortes de cerebro de ratón después de la hibridación fluorescente in situ

Este protocolo de nivel introductorio describe los reactivos, el equipo y las técnicas necesarias para completar la tinción inmunohistoquímica de cerebros de roedores, utilizando marcadores para la microglía y los elementos neuronales como ejemplo.

Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

Se describe un montaje de todo el hibridación in situ procedimiento multi-objetivo cromogénico (MC-DESEO) en embriones de Drosophila intactos permitiendo la detección simultánea y específica de tres patrones de distribución de ARNm diferentes contrastando precipitados de color.

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Este protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la costaría inmunofluorescente de IBA1 y TMEM119, además del análisis de la densidad microglial, la distribución y la morfología, así como la infiltración de células mieloides periféricas en el tejido cerebral del ratón.

Tinción de inmunofluorescencia utilizando IBA1 y TMEM119 para la densidad microglial, morfología y análisis de infiltración de células mieloides periféricas en el cerebro del ratón

Este protocolo describe un método para combinar la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la inmunohistoquímica de fluorescencia (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijas, con el objetivo de lograr una señal de FISH y IHC de fluorescencia multimarca. IHQ se dirigió a proteínas citoplasmáticas y unidas a la membrana.

Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Aprende a detectar simultáneamente tres genes en secciones cerebrales de ratón mediante hibridación in situ de doble fluorescencia combinada con inmunotinción. Este método permite localizar la expresión génica en tipos celulares específicos sin necesidad de anticuerpos para todos los objetivos.

La combinación de doble fluorescencia In Situ La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón (Video) | JoVE Journal

La combinación de doble fluorescencia

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