La evaluación simultánea de los cardiomiocitos de síntesis de ADN y la ploidía: Un Método de Ayuda a la cuantificación de los cardiomiocitos Regeneración y Facturación

El objetivo general de este protocolo es cuantificar el recambio de cardiomiocitos mediante el marcaje de nucleósidos a largo plazo y la citometría de flujo para cuantificar los núcleos de neomiomiocitos teniendo en cuenta la poliploidización de los núcleos. Este método se puede utilizar para abordar preguntas clave en el campo de la regeneración de cardiomiocitos y se puede utilizar como herramienta de cribado para cuantificar los cambios en la dinámica de la generación de cardiomiocitos. La principal ventaja de este protocolo es que permite una cuantificación sensible y precisa de la generación de neocardiomiocitos, independientemente de la fuente celular y controlando la poliploidación.

24 horas después de la sexta inyección de EdU, coloque al animal tratado en posición supina y utilice unas tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la piel desde la mitad del abdomen hasta el diafragma. A continuación, manteniendo el esternón alejado de la cavidad corporal, corte bilateralmente el diafragma para exponer el corazón. A continuación, levante ligeramente el corazón y corte los vasos sanguíneos principales del tracto de salida para diseccionar el corazón de la cavidad torácica.

Inmediatamente después de la cosecha, coloque los corazones en tubos de centrífuga individuales de 15 mL que contengan 10 mL de PBS enfriado a cuatro grados Celsius. A continuación, transfiera las muestras a placas de Petri individuales de 10 cm y utilice un bisturí para cortar cada corazón en dos trozos en orientación sagital. A continuación, exprima suavemente las piezas del corazón con un par de pinzas.

Retire ambos trozos de corazón y colóquelos en una placa de Petri que contenga 20 ml de PBS fresco. Repita una vez más con una nueva placa de Petri y 20 ml de PBS fresco. Coloque ambas partes de los corazones en el mismo tubo de microcentrífuga de 1.5 ml y use una aguja de calibre 25 para hacer un pequeño orificio en la tapa de cada tubo para evitar que la tapa se abra cuando el corazón haya procesado.

A continuación, etiquete cada tubo y congele los tejidos cardíacos en un recipiente con nitrógeno líquido. Para cada corazón a analizar, incubar 36 mL de BSA y PBS al uno por ciento en un tubo ultracentrífugo. Deseche la solución después de 30 minutos.

Cuando los tubos se hayan secado al aire, agregue 10 ml de solución de gradiente de sacarosa a cada tubo. Después de picar individualmente las muestras de corazón congelado con nitrógeno líquido con el bisturí, transfiera los fragmentos de tejido de cada corazón a tubos cónicos individuales de 50 mL que contengan 15 mL de tampón de lisis celular. Homogeneizar las muestras durante 15 segundos a 25.000 rpm con un homogeneizador de sonda a temperatura ambiente.

A continuación, añada 15 ml más de tampón de lisis a cada tubo y transfiera las muestras de una en una a una onza de 40 ml con un mortero de aclarado grande. Realice 10 golpes con el mortero y filtre los lodos de celdas a través de un colador de 100 micras seguido de un colador de celdas de 40 micras en tubos de centrífuga individuales de 50 mL. A continuación, recoja los gránulos cardíacos nucleares por centrifugación y vuelva a suspender las células en 25 ml de solución de gradiente de sacarosa cada una.

Coloque las células en capas sobre el gradiente de sacarosa libre de los núcleos en los tubos de ultracentrífuga preparados y centrifugue las capas utilizando un rotor de tubo oscilante. Después de la centrifugación, vuelva a suspender los gránulos de núcleos en 1.300 microlitros de tampón de almacenamiento de núcleos y transfiera los núcleos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml etiquetado como PCM1. Transfiera 300 microlitros de cada suspensión de los tubos PCM1 a un nuevo tubo de microcentrífuga y agregue 700 microlitros de tampón de almacenamiento de núcleos frescos y control ISO de etiqueta.

A continuación, etiquete los núcleos PCM1 con el anticuerpo anti-PCM1 y los núcleos de control ISO con el anticuerpo de control rápido del isotipo IGG durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, centrifugar las muestras y volver a suspender los gránulos en un ml de tampón de almacenamiento de núcleos frescos para una segunda centrifugación en las mismas condiciones. Después del segundo centrifugado, vuelva a suspender los gránulos en un ml de tampón de almacenamiento de núcleos frescos e incube los núcleos con un microlitro de un fragmento de F(ab'2 conjugado de una cabra anticuerpo IGG antirrabioso durante una hora a cuatro grados centígrados en la oscuridad.

Para evaluar el grado de incorporación de EdU, centrifugar las suspensiones de núcleos marcados con control PCM1 e ISO y resuspender los pellets en un mL de 1%BSA PBS dos veces durante dos lavados consecutivos. Después del segundo lavado, sustituya el sobrenadante por 100 microlitros de fijador EdU e incube las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al final de la fijación, lavar los núcleos dos veces más en un ml de PBS BSA, luego incubar las muestras con 100 microlitros de solución de permeabilidad a base de saponina a temperatura ambiente.

Después de 15 minutos, agregue 500 microlitros de cóctel de etiquetado EdU recién preparado a cada tubo para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, centrifugar las muestras tres veces lavando los núcleos en un ml de PBS BSA durante las dos segundas centrifugaciones. Finalmente, etiquete las muestras con 400 microlitros de solución de tinción de ADN.

El análisis inmunohistológico de los corazones pulsados demuestra la presencia de cardiomiocitos que expresan PCM1 y que han incorporado EdU. Sin embargo, los datos obtenidos mediante métodos inmunohistológicos pueden ser malinterpretados, ya que otros tipos de células que han incorporado EdU pueden ser identificados erróneamente como cardiomiocitos. En un estudio con mdx y ratones control, el análisis de citometría de flujo detallado en este protocolo permite una cuantificación rápida de la generación nuclear de neocardiomiocitos, al tiempo que excluye las células que han incorporado EdU a la despoliploidización.

De manera similar a los datos publicados anteriormente, en este experimento representativo se observó un aumento en las tasas de generación de núcleos de neocardiomiocitos en los corazones de ratones mdx en comparación con los controles de la misma edad. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro horas en el espacio de dos días. Al realizar este procedimiento, es importante recordar los controles negativos EdU y PCM1 para que las puertas se puedan configurar con precisión durante el análisis.

Esta técnica también es compatible con una serie de técnicas inmunohistológicas posteriores que permiten cuantificar la incorporación de nucleocitos en varios tipos diferentes de células cardíacas. Esta técnica se ha utilizado en el campo de la investigación cardiovascular para estudiar los cambios en la regeneración de los cardiomiocitos en el modelo mdx de miocardiopatía no isquémica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar rápidamente los núcleos de neomiomiocitos, observe el recuento de poliploidación para detectar cambios en la regeneración y el recambio de los cardiomiocitos.