Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de Drosophila melanogaster Las larvas

El objetivo general de este ensayo es cuantificar el componente locomotor del comportamiento de las larvas de Drosophila. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética del comportamiento sobre las contribuciones genéticas y ambientales a las diferencias individuales en el comportamiento de las larvas. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, reproducible y permite la recogida de muestras de gran tamaño.

Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque el éxito del ensayo depende del momento del desarrollo y del manejo constante y cuidadoso de los animales de prueba. Quienes demuestren el procedimiento estarán Ina Anreiter y Oscar Vásquez, estudiantes graduados en mi laboratorio. Prepare la botella de retención cortando agujeros en un lado de una botella de plástico de cultivo de moscas de seis onzas.

A continuación, use una jeringa para llenar las tapas de las placas de Petri con medio de jugo de uva previamente preparado hasta que la superficie del medio de jugo de uva forme una cúpula sobre el borde de la tapa. Guarde los platos de uva en un recipiente húmedo y hermético a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos semanas. Vierta 40 mililitros de comida para moscas previamente preparada en placas de Petri de 100 por 15 milímetros.

Obtenga tres placas de plexiglás negro con diez pocillos circulares de diez centímetros de diámetro y dispuestos en un diseño de dos por cinco para probar las larvas, y un esparcidor de plexiglás negro utilizado para esparcir la pasta de levadura sobre las placas de plexiglás. Luego, separe las tapas de la parte inferior de las placas de Petri. Recoge de 100 a 150 hembras y de 50 a 75 machos.

Permita que las hembras y los machos se apareen durante la noche en una botella de cultivo de moscas de seis onzas con alimento estándar para moscas. Transfiera las moscas a una botella de retención y use cinta adhesiva para asegurar un plato de uva con una pequeña cantidad de pasta de levadura fresca sobre la parte superior de la botella. Deje la botella boca abajo con el plato de uva en la parte inferior para permitir que los adultos pongan huevos en el plato de uva.

Deseche el primer plato de uva después de 24 horas y coloque un nuevo plato de uva en la botella de reserva. Después de 22 horas, retire las placas de uva de las botellas y colóquelas en una placa de Petri de 60 por 15 milímetros. A continuación, coloque un nuevo plato de uva con pasta de levadura fresca en la botella de reserva.

Limpie y deseche todas las larvas de la placa de uva con semillas con una sonda de disección. Incubar las placas de uva aclaradas durante cuatro horas en condiciones estándar. Después de cuatro horas, recoja 100 larvas L1, o de primer estadio, por cepa de los platos de uva y colóquelas en los platos de comida.

Coloque las larvas sobre la comida suavemente, sin perforar la comida y sin enterrar las larvas. Se pueden recoger y colocar grupos de diez larvas a la vez. Evite el hacinamiento distribuyendo las larvas por el plato de comida.

Incubar los platos de comida hasta que los animales de prueba estén diez horas antes del inicio de la deambulación, momento en el que las larvas abandonan la comida en busca de un sitio de pupa. Si las larvas han comenzado a deambular y se mueven en la tapa de la placa de Petri, como se puede ver aquí, los animales son demasiado viejos para realizar pruebas y su tiempo de desarrollo debe ser reevaluado. Disuelva la levadura en agua en una proporción de uno a dos.

Asegúrese de que la pasta terminada gotee y deje cintas en la superficie de la pasta que se derritirán rápidamente. Evaluar la consistencia correcta de la pasta de levadura es más importante que usar la proporción exacta debido a la variabilidad entre marcas, lotes de levadura y el medio ambiente. Con un pincel, recoja suavemente las larvas del plato de comida de la primera cepa.

Recoja las larvas en una placa de Petri y lávelas suavemente con agua para eliminar toda la comida. Lave rápidamente las larvas con dos mililitros de agua y séquelas suavemente con una toallita de laboratorio. Mantenga las larvas en un ambiente húmedo pero no sumergidas en agua para evitar el estrés.

Coloque tres placas de prueba una al lado de la otra y configure un temporizador de cinco minutos para cada placa de prueba. Aplique pasta de levadura en la parte superior de las placas de prueba y use el esparcidor para distribuir una capa delgada de pasta de levadura en cada placa de prueba para que todos los pocillos tengan una capa uniforme de levadura. Coloque suavemente una larva en el centro de cada pozo.

Inicie el temporizador de cinco minutos inmediatamente después de colocar las primeras larvas en cada plato. Luego coloque el resto de las larvas en los pozos restantes. Coloque una tapa de placa de Petri en la parte superior de cada pocillo.

Cuando se acabe el tiempo, comience a trazar las longitudes de los caminos que quedan en la levadura con un marcador permanente sin quitar las larvas de la placa. Traza las longitudes de las trayectorias en el mismo orden y velocidad con que se colocaron las larvas en las placas. Por último, repita los pasos de la prueba de longitud del camino de las larvas para cada cepa.

Los datos recopilados durante tres días consecutivos de pruebas revelaron un efecto de deformación significativo, con los rovers viajando más lejos que los asistentes. Además del efecto de la cepa, las larvas a las que se privó de alimento durante cuatro horas antes de la prueba tuvieron longitudes de trayectoria significativamente más cortas que las larvas alimentadas. En general, las longitudes de las vías fueron más largas cuando ambas cepas se criaron con alimentos ricos en nutrientes en comparación con alimentos bajos en nutrientes.

Si se realiza correctamente, este ensayo permite a una sola persona analizar hasta 500 larvas con facilidad en cuatro horas, lo que lo hace valioso para el fenotipado a gran escala. Siguiendo el procedimiento que acabamos de mostrar, se pueden probar otras variables como el sexo, la privación de alimentos o la calidad de los alimentos para mostrar el efecto de esas variables en los patrones de movimiento relacionados con los alimentos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la locomoción relacionada con la alimentación de las larvas de Drosophila para la evaluación de las contribuciones genéticas y ambientales a las diferencias individuales en el comportamiento.