Construcción de modelos para la predicción no destructiva de Contenidos ingrediente de arándanos por espectroscopia de infrarrojo cercano en base a mediciones de HPLC

El objetivo general de este procedimiento es construir y validar modelos para la predicción no destructiva del contenido total de azúcar, ácido orgánico total y anticianina total en arándanos individuales mediante espectroscopia de infrarrojo cercano. Este método responderá a problemas clave en el campo de la evaluación de productos agrícolas, como frutas y verduras. Para mí, una ventaja de esta técnica es que muchos de nuestros productos pueden ser controlados de forma no destructiva por espectroscopia.

Y los modelos construidos a través del procedimiento que se muestra aquí. La espectroscopia de infrarrojo cercano es una poderosa herramienta para la evaluación no destructiva de productos agrícolas. Los modelos de predicción se construyen examinando la correlación entre el espectro y los contenidos determinados por el análisis químico de cada objetivo.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Yusuke Kimura, un estudiante graduado de mi laboratorio y Jingai Che, de la universidad y uno de los autores de este protocolo. Recoja un número suficiente y varios tipos de arándanos de muestra de los cultivares objetivo. Recoja preferiblemente 100 arándanos para la construcción del modelo de calibración.

Y al menos 10 para la validación del modelo construido. Para construir modelos robustos, recoja muestras de varios tipos, como con varios colores, tamaños y en diversas condiciones de maduración. Pesa cada arándano.

Los pesos medidos se utilizan posteriormente para el cálculo del porcentaje de contenido de ingredientes de cada arándano. A continuación, coloque una muestra de arándano en el centro de la ventana del espectrofotomoter de infrarrojo cercano para mediciones de reflectancia difusa. Mediante el comando de canal único de ejemplo, mida los espectros de cada arándano.

Preferiblemente en varios puntos de la fruta. Mantenga los arándanos en un congelador, por debajo de menos 30 grados centígrados si no van a ser analizados justo después de las mediciones del espectro. Para comenzar el pretratamiento, corta un arándano en varios trozos para que se pueda homogeneizar fácilmente.

Cortar el arándano sin descongelar cuando está congelado. Pon las piezas en un vaso de precipitados de 50 mililitros. Agregue aproximadamente 10 mililitros de agua ultrapura al vaso de precipitados.

Calentar el arándano cortado en agua ultrapura en un horno microondas durante 20 segundos para desactivar las enzimas que podrían descomponer los azúcares durante los análisis. Agregue aproximadamente 10 mililitros de agua ultrapura al vaso de precipitados. Homogeneizar la mezcla durante cinco minutos a 12.000 rpm con un homogeneizador equipado con un eje y un generador estándar.

Centrifugar la mezcla homogeneizada durante 10 minutos a 3.000 RPM. A continuación, recoja el filtrado por filtración al vacío de la muestra centrífuga utilizando un filtro de papel de cinco B. Después de repetir los pasos de homogeneización dos veces, mida el pH del filtrado y ajústelo a siete con ácido clorhídrico diluido y soluciones acuosas diluidas de hidróxido de sodio.

Diluye el filtrado a 50 mililitros con agua ultrapura. Divida la muestra en dos. Uno para el análisis de azúcares y otro para el análisis de ácidos orgánicos.

Pase la primera solución de muestra a través de las columnas conectadas en serie para excluir pigmentos, cationes y aniones. Deseche el primer mililitro de la solución de muestra de las columnas. A continuación, utilice la solución de muestra de las columnas para el análisis de azúcares mediante cromatografía líquida de alta resolución o HPLC.

Centrifugar la solución a 6.600 rpm durante 10 minutos en un microtubo equipado con un filtro de 0,445 micras con minicentrífuga antes del análisis por HPLC. Organice el sistema de HPLC utilizando una columna de permeación de gel en el horno de columna a 40 grados centígrados. Utilice agua ultrapura desgasificada con un caudal de 0,1 mililitros por minuto como eluyente.

Utilice también un detector de índice de refracción. Mida los espectrogramas de HPLC de soluciones estándar inyectando una alícuota de 20 microlitros para cada medición. En este caso, se utiliza un software de solución empaquetada para la medición.

Obtenga la intensidad del área de la banda de azúcar en el cromatograma de cada solución estándar haciendo clic en el reanálisis con el botón derecho del ratón. A continuación, conecte las intensidades del área con las concentraciones correspondientes para obtener la curva de trabajo de cada azúcar mediante regresión lineal. A partir de la curva, se obtiene la ecuación que representa la relación entre la intensidad del área y la concentración para cada azúcar.

Después de obtener la curva estándar, mida los espectrogramas de HPLC de las soluciones de muestra inyectando una alícuota de 20 microlitros para cada medición. Obtenga las intensidades de área de las bandas de azúcares en el cromatograma de cada solución de muestra como antes. Consulte el protocolo de texto para conocer los pasos para realizar mediciones de HPLC de ácidos orgánicos.

Mantenga los arándanos en un congelador a menos 80 grados centígrados si no se van a analizar en busca de antocianinas justo después de las mediciones del espectro. Para realizar el pretratamiento de las mediciones de antocianinas por HPLC, seque cada fruta congelada con un liofalizador al vacío durante 12 horas. Extraiga la antocianina del arándano seco en una solución de metanol al uno por ciento de ácido trifluruocético dejando la mezcla en un refrigerador a cuatro grados centígrados durante 12 horas.

Centrifugar el extracto durante 15 minutos en un microtubo de dos mililitros utilizando una ultracentrífuga a menos ocho grados centígrados y 15.000 RPM. A continuación, filtre el extracto a través de un filtro de 0,45 micras para obtener la muestra para las mediciones de HPLC. Organice el sistema de HPLC utilizando una columna de fase inversa C18 en un horno de columna a 40 grados centígrados.

Aplique el método de gradiente utilizando un ácido trifluroacético acuoso al 0,1 por ciento como LUNA. Y ácido trifluroacético al 0,5 por ciento en acetonitrilo como LUNB. Utilice un caudal de 0,1 mililitros por minuto en el que la proporción de LUNB aumente del ocho por ciento al 15 % durante cero a 50 minutos después de la inyección.

Y del 15% al 75% durante 50 a 60 minutos después de la inyección. Utilice un detector de matriz de fotodiodos que monitoree a 520 nanómetros. Mida los espectrogramas de HPLC de soluciones estándar inyectando una alícuota de 10 microlitros a través del muestreador automático para cada medición.

Utilice el software de la solución LC para la medición. Por último, mida los espectrogramas de HPLC de las soluciones de muestra inyectando una alícuota de 10 microlitros a través del muestreador automático para cada medición. En este punto, la construcción de modelos de calibración para la predicción del contenido de ingredientes, seguida de la validación de estos modelos construidos, se realiza como se describe en el protocolo de texto.

Los modelos de predicción se construyen utilizando los espectros observados y el contenido de ingredientes determinado a través del procedimiento que se muestra aquí. Aquí se muestra un ejemplo del resultado de la validación cruzada del modelo construido para la predicción del contenido total de azúcar. La correlación entre los valores predichos por espectroscopia de infrarrojo cercano y los determinados por HPLC es satisfactoria.

Un resultado similar se observa para la validación cruzada del modelo para el contenido total de antocianinas. De nuevo, la correlación entre los valores pronosticados y los observados es satisfactoria. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener valores anteriores de contenido de arándanos con HPLC.

Solo es posible una evaluación diferente mediante el uso de los modelos construidos correctamente en función del contenido preestablecido medido por análisis químico destructivo. Esto significa que el análisis químico previo de un objetivo es un misterio para construir modelos de predicción de alto rendimiento. Consulte el protocolo de texto para el procedimiento de construcción de modelos de predicción que no se muestran en este video.

Una vez construidos correctamente, los modelos de predicción son aplicables para la predicción de azúcar, ácidos orgánicos y cualquier contenido de arándanos. Se espera que la espectroscopia de infrarrojo cercano, como se muestra aquí, sea aplicable para la correlación de muchos tipos de productos agrícolas. No olvide que es necesario obtener barreras de contenido preestablecidas a través del análisis químico para la construcción de un buen modelo cuando se aplica la espectroscopia de infrarrojo cercano a la evaluación de cualquier producto agrícola.