Intra-ilíaca Arteria inyección de Modelamiento eficiente y selectiva de microscópico metástasis en los huesos
26 de septiembre de 2016
Este manuscrito proporciona el procedimiento detallado de la inyección de la arteria ilíaca (IIA), una técnica para administrar células cancerosas específicamente a los tejidos de las extremidades posteriores, incluidos los huesos, para establecer metástasis óseas experimentales. Aunque inicialmente se estableció con modelos de tumores de mama, este protocolo puede extenderse fácilmente a otros tipos de cáncer.
El objetivo general de este procedimiento es establecer metástasis óseas experimentales mediante la administración de células cancerosas directamente a los tejidos de las extremidades posteriores, incluidos los huesos, mediante inyección intrailíaca. Por lo tanto, este método puede ayudarnos a responder las preguntas clave sobre la colonización ósea del cáncer de mama, especialmente en la fase temprana de este proceso, cómo interactúan las células de cáncer de mama con las células del microambiente en el hueso. Hoy hicimos una inyección en la arteria ilíaca.
La principal ventaja de esta técnica es que establece de manera eficiente y selectiva un modelo experimental de metástasis ósea microscópica para varios tipos de cáncer sin causar daño tisular local. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque encontrar una inyección que sea precisa, la posición de inyección de la arteria ilíaca en el microscopio puede requerir práctica para lograr una tasa de éxito de inyección superior al noventa por ciento. Comience por confirmar el nivel apropiado de sedación mediante un pellizco en los dedos de los pies de un ratón de veinte gramos de cinco a seis semanas de edad.
Después de aplicar el ungüento para los ojos, limpie el área de la ingle derecha afeitada varias veces con hisopos de algodón secuenciales, estériles y empapados en etanol de isopropil al 70%, seguidos de un exfoliante quirúrgico betadine. A continuación, cubra todo el ratón con un paño estéril. Luego, use una hoja de bisturí estéril de acero al carbono número diez y un mango número tres para hacer una incisión en la piel de uno a 1,2 centímetros entre el cuarto y el quinto pezón en la parte inferior derecha del abdomen.
Y transfiera al animal bajo un microscopio de disección estándar de sobremesa. Bajo el objetivo 4X, inserte pinzas de separación romas en la incisión entre el tejido graso y el peritoneo, y empuje los tejidos hacia afuera en ambos lados para revelar los vasos ilíacos y los nervios. A continuación, utilice pinzas rectas y finas para atravesar el tejido conectivo entre los vasos y el nervio más cercano a los vasos.
Luego, deslice las pinzas en ángulo a través del tejido conectivo y debajo de los vasos ilíacos, mientras inserta las pinzas rectas en los tejidos conectivos del otro lado de los vasos para guiar las pinzas en ángulo a través del tejido. Recomendamos separar y levantar el borde ilial y la arteria como un haz para este paso. Aunque las células tumorales se inyectan solo en la arteria, el aislamiento de ambos vasos juntos ahorra tiempo y esfuerzo.
Una vez que las pinzas en ángulo estén en su lugar, separe aún más la vena ilíaca y la arteria del tejido circundante, manteniendo los vasos encima de las pinzas en ángulo durante la disección. Cuando los vasos estén despejados, use las pinzas rectas para colocar la punta de una sutura de seda 4-0 en las pinzas en ángulo y tire de la sutura lenta y suavemente debajo de los vasos. Ambas venas comunes ilíacas y los vasos arteriales deben ser sostenidos por la sutura.
Cuando los vasos estén listos, pipetee las células tumorales hacia arriba y hacia abajo varias veces para volver a suspenderlas en una solución de una sola célula y romper los grumos. Luego, aspire 100 microlitros de células por ratón en una jeringa de insulina de calibre 31. Ahora, deslice las pinzas en ángulo hacia atrás debajo de los vasos usando la sutura como guía y abra las pinzas para que los vasos descansen suavemente sobre las puntas.
Con la otra mano, inserte la punta de la aguja con el bisel hacia arriba en la luz de la sección de la arteria entre las puntas de las pinzas. Presione el émbolo lentamente para inyectar las células. La suspensión celular hará que la sangre pase por el vaso.
Cuando se hayan expulsado todas las células, retire suavemente la aguja, manteniendo los vasos elevados en las pinzas para evitar el sangrado. Luego, retira la sutura. Finalmente, retire rápidamente las pinzas y presione un hisopo de algodón sobre la incisión durante cinco a 10 minutos para detener el sangrado.
Aquí, se muestra una imagen bioluminiscente representativa de un animal entero después de la inyección intra-ilíaca de cinco veces 10 a la quinta células de cáncer de mama MCF-7 marcadas con luciferina GFP seguida de la administración de d-luciferina por inyección de seno retroorbitario. A los 14 días después de la inyección, se obtuvo una fuerte señal de bioluminiscencia del hueso posterior inyectado en la arteria inilíaca, pero no del hueso control contralateral, lo que confirma la localización específica de las células inyectadas. El corte de una tinción de H&E de los huesos portadores de tumores también demostró una población de células compactas, parecidas a adoquines, con núcleos grandes indicativos de lesiones metastásicas microscópicas de MCF-7 en el tejido óseo 14 días después de la inyección de la arteria intensiliaca.
Además, la tinción inmunofluorescente de las secciones óseas también reveló una mezcla de las células MCF-7 con osteoblastos y preosteoblastos. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en diez o quince minutos. Siguiendo estos procedimientos, puede usar otros métodos para responder preguntas adicionales.
Por ejemplo, podemos usar RNA-Seq para perfilar las células del microambiente en el nicho de metástasis y compararlas con las células normales. Esta técnica proporciona una forma para que los investigadores del cáncer de mama y los investigadores del cáncer de próstata estudien la micrometástasis ósea en animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer un modelo de metástasis ósea de cáncer de mama mediante inyección intrailíaca.
Tome las precauciones adecuadas porque trabajar con ketamina y xilacina podría ser extremadamente peligroso.
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Descripción general
Este manuscrito describe la técnica de inyección en la arteria iliaca interna (IIA) para administrar células cancerosas a los tejidos de la extremidad posterior, incluyendo los huesos, con el fin de establecer metástasis óseas experimentales. Este método es particularmente útil para estudiar las interacciones de las células de cáncer de mama con el microambiente óseo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Oncología
- Técnicas experimentales
Antecedentes
- La metástasis ósea es una complicación común en pacientes con cáncer.
- Comprender los mecanismos de colonización de las células cancerosas en el hueso es fundamental para desarrollar terapias.
- El método de inyección en la arteria ilíaca permite la administración dirigida de células cancerosas.
- Esta técnica minimiza el daño tisular local en comparación con otros métodos.
Objetivo del estudio
- Establecer un modelo para estudiar la metástasis ósea.
- Investigar las interacciones entre las células de cáncer de mama y las células del microambiente óseo.
- Mejorar la precisión y la tasa de éxito de la técnica de inyección.
Métodos Utilizados
- Inyección intraarterial ilíaca de células cancerosas.
- Uso de un modelo de ratón de cinco a seis semanas de edad.
- Monitoreo de los niveles de sedación mediante pellizco en el dedo del pie.
- Práctica de técnicas de inyección para lograr altas tasas de éxito.
Resultados Principales
- La técnica permite el establecimiento eficiente de modelos de metástasis ósea.
- Se pueden lograr altas tasas de éxito con la práctica.
- Se observa un daño mínimo en los tejidos locales con este método.
- Se obtienen conocimientos sobre las fases iniciales de la colonización por células de cáncer de mama.
Conclusiones
- La inyección intraarterial ilíaca es una herramienta valiosa para la investigación del cáncer.
- Este método puede adaptarse para diversos tipos de cáncer más allá del cáncer de mama.
- Estudios posteriores pueden mejorar la comprensión de las interacciones entre el cáncer y el hueso.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de modelos confiables de metástasis ósea en estadios tempranos sigue siendo un desafío crítico en el descubrimiento de fármacos oncológicos, particularmente para evaluar intervenciones terapéuticas dirigidas a la colonización micrometastásica. La técnica de inyección en la arteria ilíaca permite una diseminación sincronizada espaciotemporalmente de células cancerosas hacia los huesos de las extremidades posteriores, lo que facilita una cuantificación robusta de las células tumorales diseminadas y reduce las respuestas inflamatorias confusas derivadas del daño tisular procedimental. Este enfoque aumenta la confianza predictiva en estudios preclínicos al permitir un monitoreo continuo de lesiones óseas indolentes sin metástasis en órganos sistémicos, mejorando así la relevancia traslacional de los modelos de metástasis ósea para la validación de dianas y los esfuerzos de identificación de compuestos prometedores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la modelización de las interacciones iniciales de las células cancerosas con componentes del microentorno óseo, como los osteoblastos y preosteoblastos.
- Valor operativo: Proporciona una vía selectiva y eficiente para la administración de células cancerosas a los huesos de las extremidades posteriores, facilitando la generación consistente del modelo en diferentes cohortes experimentales.
- Valor estratégico: Apoya la desvinculación mecanicista de las vías de metástasis ósea al permitir la visualización de la progresión de micrometástasis desde células individuales hasta lesiones multicelulares mediante lecturas bioluminiscentes e histológicas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados cuantificables, como la intensidad de la señal de bioluminiscencia y la densidad histológica de lesiones, lo que permite la evaluación estandarizada de la carga metastásica.
- Valor operativo: Evita el daño tisular local y los factores de confusión asociados a la cicatrización de heridas, mejorando la reproducibilidad del ensayo y reduciendo la variabilidad en los análisis posteriores.
- Valor estratégico: Produce sistemas relevantes para la enfermedad con mínima metástasis en órganos ajenos al objetivo, permitiendo ventanas de observación prolongadas para estudios de respuesta a la dosis y de cronometraje en campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad al capturar la progresión desde células tumorales diseminadas hasta micrometástasis en el hueso, un cuello de botella clínico clave.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al facilitar imágenes longitudinales y análisis finales como tinciones de H&E e inmunofluorescencia.
- Valor estratégico: Orienta decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar señales tempranas de eficacia sobre compuestos que interrumpen la coexistencia cancerosa-estromal o la formación de nichos en el microentorno óseo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método de inyección en la arteria iliaca interna se enmarca dentro del continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores y las pruebas preclínicas de eficacia, especialmente para terapéuticos dirigidos al hueso, donde la modelización temprana de metástasis aporta información sobre los mecanismos de acción y las ventanas terapéuticas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las interacciones entre células cancerosas y el microentorno óseo, al permitir la administración controlada de células tumorales a sitios esqueléticos.
- Selección: Proporciona sistemas biológicos listos para ensayos, con lecturas cuantitativas de bioluminiscencia e histopatológicas adecuadas para plataformas de cribado de alto contenido.
- Análisis: Genera variables dependientes mensurables, incluyendo el flujo de fotones proveniente de la bioluminiscencia, el área de lesión en secciones histológicas y los índices de co-localización de células tumorales y estromales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de la fase micrometastásica avascular, que precede a la progresión osteolítica u osteoblástica en la metástasis ósea clínica.
- Reutilización Empresarial: Representa una técnica quirúrgica estandarizada adaptable a diferentes tipos de cáncer y laboratorios, promoviendo la consistencia entre proyectos en la generación de modelos de metástasis ósea.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación del blanco al reducir el ruido provocado por la inflamación procedimental y permitir atribuir claramente los cambios fenotípicos a los mecanismos del fármaco.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante referencias anatómicas definidas y el aislamiento de vasos guiado por sutura, lo que minimiza la variabilidad dependiente del operador.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción al proporcionar lecturas tempranas y específicas de metástasis orgánica que reducen los fracasos en fases avanzadas debido a la tropismo óseo no previsto.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de candidatos dirigidos al hueso al permitir la comparación directa de la carga metastásica entre diferentes grupos de tratamiento en modelos singénicos o xenoinjertos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere dominio de técnicas microquirúrgicas, incluyendo el aislamiento de vasos y la ligadura con sutura bajo microscopio de disección.
- Depende del acceso a microscopios de disección estériles, pinzas finas, jeringas de insulina y equipos para la preparación de suspensiones celulares isotónicas.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de anestesia (por ejemplo, ketamina/xilacina) y del monitoreo postoperatorio para garantizar el bienestar animal y la consistencia del modelo.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen el ajuste del volumen de inyección y de la concentración celular según la agresividad de la línea celular de cáncer y la variabilidad entre cepas murinas.
- Las limitaciones prácticas incluyen una curva de aprendizaje para alcanzar una tasa de éxito en la inyección superior al 90 % y la necesidad de técnica aséptica para prevenir la contaminación peritoneal durante la incisión inguinal.
