Una guía para la iluminación estructurada de microscopía TIRF a alta velocidad con colores múltiples
30 de mayo de 2016
Este artículo proporciona una guía detallada para el montaje y el funcionamiento de un microscopio de iluminación estructurada que funciona con iluminación de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF-SIM) para obtener imágenes de procesos biológicos dinámicos con superresolución óptica en múltiples colores.
El objetivo general de este protocolo es construir y alinear un microscopio de iluminación estructurada adecuado para la obtención de imágenes de superresolución de células vivas de alta velocidad capaz de operar en modos TIRF y de sección óptica con múltiples colores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular que actualmente no se pueden responder utilizando la microscopía TIRF limitada por difracción estándar. La principal ventaja de esta técnica es su rápida resolución en el tiempo en comparación con otras técnicas de microscopía de superresolución, lo que la hace muy adecuada para obtener imágenes de procesos dinámicos en células vivas.
Aunque este protocolo describe los pasos para la construcción de un microscopio TIRF-SIM, la configuración es flexible y fácilmente modificable para implementar modalidades de imagen como 3D-SIM, SIM multifocal y SIM no lineal. Para organizar y alinear la ruta de excitación para un microscopio de iluminación estructurado, comience marcando las posiciones de los componentes en la mesa óptica como se indica aquí. Después de insertar el primer espejo dicroico, DM4, en la torreta del cubo de filtro del marco del microscopio, inserte el segundo espejo dicroico, DM3, en una montura de espejo cinemático cuadrado de una pulgada y colóquelo a una distancia focal de la lente del condensador, L5. A continuación, para definir con precisión el acceso óptico del sistema, retire la lente del objetivo, OB, de la torreta y, en su lugar, atornille una herramienta de alineación.
A continuación, utilice el espejo dicroico DM3 y un espejo de alineación temporal colocado en la ubicación final aproximada del SLM para dirigir un haz de referencia colimado desde el láser uno a través del centro de los orificios de los dos discos de alineación. Usando tres espejos y el espejo dicroico DM2 como se muestra aquí, dirija el haz desde el láser uno al espejo temporal. Una vez que se haya determinado el eje óptico grueso, retire la herramienta de alineación.
A continuación, inserte un iris en la trayectoria del haz antes de que entre en el cuerpo del microscopio y céntrelo en el haz. Coloque un trozo de cartulina blanca con un pequeño orificio centrado en el iris, luego vuelva a insertar la lente del objetivo. A continuación, realice ajustes angulares iterativos en los espejos DM3 y en la posición SLM para centrar la reflexión posterior en la tarjeta con el haz entrante.
A continuación, retire temporalmente la lente del objetivo y marque el punto láser en el techo para crear una posición de referencia. Inserte la lente de tubo, L5, aproximadamente a una distancia focal del objetivo, montándola en una platina de traslación lineal configurada para trasladar a lo largo de la dirección del haz de referencia. Ajuste la posición y el ángulo de la lente del tubo de modo que el haz que sale del objetivo se colime y golpee el punto de referencia en el techo.
Compruebe que la lente esté perpendicular al haz comprobando de nuevo el reflejo posterior con el iris y la tarjeta blanca. A continuación, retire la lente del objetivo e inserte la segunda lente del telescopio de retransmisión de imagen, L4. Utilice la etapa de traslación lineal para ajustar la posición y el ángulo de esta lente para mantener la colimación y para asegurarse de que el haz de referencia siga golpeando el punto marcado en el techo. Vuelva a colocar la lente del objetivo e inserte la primera lente del telescopio, L3. Ajuste la posición y el ángulo de esta lente para garantizar la colimación y la no deflexión como se describió anteriormente.
Después de montar el chip SLM de acuerdo con el protocolo de texto, con las lentes alineadas, inserte el SLM en lugar del espejo. Ajuste la posición del SLM de modo que el haz de referencia se encuentre en el centro del chip SLM y ajuste el ángulo para que el haz pase a través de las dos lentes de relé. A continuación, compruebe que el haz de referencia sigue centrado en el punto marcado.
Monte el retardador variable de cristal líquido, o LCVR, con su eje rápido a 45 grados a la polarización incidente. Luego, después de completar la alineación del rotador de polarización de acuerdo con el protocolo de texto, utilizando la luz transmitida a través de los oculares, concéntrese en una retícula y fije la lente del objetivo en esta posición. A continuación, prepare una monocapa de perlas fluorescentes extendiendo una gota de perlas multicolor de 100 nanómetros sobre un cubreobjetos número 1,5.
Deje que las perlas se sequen para adsorberlas al vidrio antes de volver a sumergirlas en agua. Con aceite de inmersión, coloque la muestra de cuentas en el objetivo. Ajuste con precisión la posición de la cámara para que la capa de perlas fluorescentes esté enfocada.
Después de generar patrones de rejilla binaria SIM como archivos de mapa de bits y cargarlos en el SLM de acuerdo con el protocolo de texto, cargue el software de control del SLM y haga clic en Conectar. En la pestaña Repertorio", haga clic en Cargar"para abrir el archivo de repertorio y comprobar el número de órdenes de ejecución contenidas en el archivo. Haga clic en "Enviar a la junta" para cargar el archivo de repertorio en el SLM.
A continuación, seleccione la pestaña "Estado" e introduzca el número de la orden de ejecución. Haga clic en "Seleccionar" para cambiar el orden de ejecución a la rejilla de alineación. Inserte una máscara espacial, o SM, montada en una etapa XY en la trayectoria del haz en la posición focal de L3 y traslade su posición con respecto al eje óptico de modo que solo se pasen los primeros órdenes deseados.
Justo después del filtro espacial, solo serán visibles dos haces circulares. Compruebe la imagen de la capa de cuentas fluorescentes en la cámara. Si los dos haces circulares no se superponen como se muestra aquí, vuelva a colocar el plano de muestra, ajustando iterativamente la lente del objetivo y la posición de la cámara.
Después de ajustar el enfoque y configurar el plano de muestra de acuerdo con el protocolo de texto, confirme la iluminación TIRF mediante imágenes, por ejemplo, una solución de colorante de rodamina 6G de 10 micromolares enfocando el tinte. Si los dos haces inciden en el ángulo TIRF correcto, entonces las moléculas individuales serán visibles sin un fondo alto y los bordes de la apertura circular estarán enfocados. Se pueden realizar ajustes finos en la posición de los haces ajustando el espejo dicroico DM3.
Para sincronizar y calibrar el sistema, coloque la muestra monocapa de perlas en el objetivo y concéntrese. Utilice el software de control SLM para programar el SLM para mostrar cada una de las tres imágenes de desplazamiento de fase a su vez para la primera orientación del patrón. A continuación, cambie al orden de ejecución cuatro del repertorio de ejemplos.
En el software de adquisición, configure la cámara para el período de exposición global eligiendo "Propiedades avanzadas de la cámara" y configurando "Tipo de disparo de salida 1" en positivo y "Tipo de disparo de salida 2" en negativo. En el panel de secuencia, en Tipo de análisis, seleccione Registro de disco duro y establezca el recuento de fotogramas en tres. A continuación, haga clic en "Inicio"para adquirir tres fotogramas.
El patrón SLM cambiará con cada exposición. Después de calcular el sistema de acuerdo con el protocolo de texto, en el software de control SLM, cambie el orden de ejecución de SLM a la serie completa de nueve imágenes de rejilla binarias requeridas para TIRF-SIM. Este es el orden de ejecución cero en el repertorio de ejemplos.
Después de adquirir nueve imágenes de la muestra de cuentas, en el panel de secuencia del software de la cámara, seleccione "Registro de disco duro" como tipo de escaneo y cambie el recuento de fotogramas a nueve. A continuación, haga clic en "Inicio" para adquirir imágenes. Por último, en Guardar imágenes almacenadas en búfer, elija TIFF como tipo de imagen y haga clic en Aceptar. Reconstruya una imagen de súper resolución de acuerdo con el protocolo de texto.
En la imagen, se obtuvieron imágenes de perlas fluorescentes multicolores de 100 nanómetros de diámetro para comparar el TIRF estándar con el TIRF-SIM. TIRF-SIM claramente tuvo una resolución lateral significativamente mayor en comparación con TIRF. La resolución estimada del microscopio es de 90 nanómetros y 120 nanómetros para TIRF-SIM de 488 y 640 nanómetros, respectivamente.
Esto corresponde a una mejora de dos veces en la resolución lateral para ambas longitudes de onda en comparación con el caso teórico de difracción limitada. Como se ve aquí, se formaron fibrillas de amiloide marcadas con fluorescencia in vitro y también se utilizaron como muestra de prueba para demostrar la resolución duplicada. Las estructuras subcelulares con alto contraste, como los microtúbulos marcados con emGFP o LifeAct-GFP, son ideales para la obtención de imágenes TIRF-SIM y producen imágenes de alto contraste y superresolución.
Las imágenes TIRF-SIM que utilizan la configuración demostrada permiten observar una subpoblación de microtúbulos ubicados en las proximidades de la corteza de la célula basal, y la polimerización y despolimerización de los microtúbulos se puede ver con el tiempo. Las muestras de bajo contraste sin estructuras discretas carecen de información de alta resolución, excepto en los bordes de la membrana plasmática y, por lo tanto, no son óptimas para la obtención de imágenes TIRF-SIM. Por último, el alto contraste de modulación es esencial para el éxito de las imágenes SIM.
Como se demuestra aquí, la transformada de Fourier de la imagen reconstruida permite la visualización de la función de transferencia óptica SIM. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en aproximadamente una semana, si se han adquirido todas las partes necesarias. Al intentar este procedimiento, uno debe ser consciente de los problemas más críticos para implementar con éxito TIRF-SIM.
En primer lugar, es esencial la alineación precisa de las vigas. Esto puede ser difícil, ya que deben estar ubicados en los bordes de la apertura de la lente del objetivo. En segundo lugar, es fundamental que el estado de polarización de la luz coincida con el patrón.
Sin esto, el contraste del patrón de la muestra será bajo y la construcción posterior de la imagen será imposible. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de los pasos más importantes en la construcción y alineación de un microscopio TIRF-SIM basado en SLM. No olvide que trabajar con láseres de clase 3B puede ser extremadamente peligroso.
La potencia del láser debe mantenerse a niveles seguros para los ojos mientras se realiza el proceso de alineación con el objetivo TIRF en su lugar.
Descripción general
Este artículo proporciona una guía detallada para construir y alinear un microscopio de iluminación estructurada para imágenes superresolutivas en células vivas a alta velocidad utilizando TIRF-SIM. Este método es ventajoso para la visualización de procesos biológicos dinámicos en múltiples colores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Técnicas de Microscopía
- Imagen de Superresolución
Antecedentes
- La microscopía TIRF estándar tiene limitaciones para resolver procesos dinámicos.
- Las técnicas de superresolución mejoran las capacidades de imagen.
- La microscopía de iluminación estructurada (SIM) ofrece una mayor resolución temporal.
- Este protocolo permite modificaciones flexibles en el montaje del microscopio.
Objetivo del estudio
- Construir un microscopio TIRF-SIM para imágenes avanzadas.
- Permitir el estudio de procesos biológicos que requieren alta resolución temporal.
- Proporcionar un protocolo detallado para que los investigadores puedan replicar el montaje.
Métodos Utilizados
- Alineación de componentes ópticos, incluidos espejos dicróicos y lentes.
- Uso de un retardador variable de cristal líquido para el control de polarización.
- Preparación de muestras de microesferas fluorescentes para calibración.
- Implementación del software de control del modulador espacial de luz (SLM) para la generación de patrones.
Resultados principales
- Alineación exitosa del microscopio TIRF-SIM.
- Demuestra las capacidades de imagen con perlas fluorescentes.
- Verificación de las condiciones de iluminación TIRF.
- Establecimiento de un protocolo para estudios de imagen futuros.
Conclusiones
- El montaje de TIRF-SIM permite la obtención de imágenes a alta velocidad de procesos dinámicos.
- Este método puede abordar preguntas en biología celular previamente inalcanzables.
- La flexibilidad del montaje permite diversas modalidades de obtención de imágenes.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagen superresolutiva multicolor de alta velocidad aborda la necesidad de visualización de procesos dinámicos en ensayos con células vivas, permitiendo la desvinculación mecanicista de dianas terapéuticas mediante la observación directa de dinámicas subcelulares. TIRF-SIM proporciona una confianza predictiva en la validación de dianas al resolver interacciones proteicas y eventos de tráfico a escala nanométrica con fidelidad temporal, apoyando decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales del descubrimiento. Esta capacidad mejora el desarrollo de ensayos para cribado fenotípico al ofrecer lecturas cuantitativas y resueltas espacialmente que aumentan la confianza en la diana y reducen los falsos positivos en la identificación de compuestos prometedores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de la localización y dinámica de proteínas con una resolución de 90-120 nm en células vivas.
- Valor operacional: Facilita la validación funcional de dianas mediante la observación directa de la polimerización y despolimerización de microtúbulos cerca de la corteza basal.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en los estudios de interacción con la diana al resolver subpoblaciones de microtúbulos y fibrillas amiloides con una resolución lateral duplicada en comparación con los límites de difracción.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la calibración con monocapas de microesferas fluorescentes para establecer parámetros de resolución.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante la generación sincronizada de patrones SLM, control de longitud de onda y activación de la cámara para una adquisición de cuadros constante.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en diferentes longitudes de onda de excitación (488 nm, 640 nm) y modalidades de imagen, incluyendo TIRF y modos de seccionado óptico.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las observaciones de descubrimiento de estructuras subcelulares (por ejemplo, microtúbulos emGFP, LifeAct-GFP) con la validación preclínica mediante imágenes de superresolución con alto contraste.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite la reducción del riesgo mecanicista al visualizar procesos dinámicos en células vivas que son invisibles para la TIRF estándar, informando así la selección de objetivos.
- Sistema Relevante para la Enfermedad: Demuestra aplicabilidad a modelos de células vivas, apoyando la alineación de biomarcadores para procesos como la dinámica de microtúbulos en neurodegeneración o cáncer.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Sitúa el método en la fase inicial del descubrimiento para la identificación de fármacos, donde la resolución a escala nanométrica de procesos dinámicos aporta información para la validación de dianas y la preparación de ensayos destinados al cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al resolver distribuciones y dinámicas proteicas a escala nanométrica en modelos de células vivas.
- Selección: Ofrece disponibilidad para ensayos mediante imágenes cuantitativas y de alta frecuencia de cuadros (hasta 10 Hz) con capacidad multicolor para una evaluación confiable de compuestos.
- Análisis: Proporciona resultados estadísticos mediante imágenes de superresolución reconstruidas y validación de la función de transferencia óptica basada en transformada de Fourier para la comparación de condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante imágenes relevantes para enfermedades de estructuras subcelulares con alto contraste y resolución.
- Reutilización Empresarial: Presenta al sistema como una capacidad reutilizable para múltiples modalidades de imagen (TIRF-SIM, 3D-SIM, SIM multifocal) en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista en la obtención de imágenes en células vivas.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante el control automatizado de la polarización, la estructura espacial y la sincronización de longitud de onda.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción del proyecto, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante la visualización temprana de la dinámica del objetivo.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en la observación directa del comportamiento del objetivo terapéutico en contextos fisiológicamente relevantes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en alineación óptica, seguridad con láseres (Clase 3B) y generación de patrones basada en moduladores espaciales de luz (SLM) para iluminación estructurada.
- Necesita instrumentación para el control de polarización (retardador variable de cristal líquido), disparo de cámaras de alta velocidad e integración de láseres de múltiples longitudes de onda.
- Exige estandarización entre equipos para la configuración de la mesa óptica, posicionamiento de componentes y protocolos de calibración mediante monocapas de microesferas fluorescentes.
- Implica consideraciones de adaptación para distintos tipos de muestras, ya que las muestras de bajo contraste carecen de información de alta resolución excepto en los bordes de las membranas.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de un alto contraste de modulación para obtener imágenes SIM exitosas y un alineado preciso del haz en las aperturas del objetivo.
