Name: Una guía para la iluminación estructurada de microscopía TIRF a alta velocidad con colores múltiples (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprende a construir y alinear un microscopio TIRF-SIM para imágenes de superresolución en células vivas a alta velocidad y en múltiples colores. Este protocolo detallado permite estudiar procesos biológicos dinámicos con resolución temporal mejorada.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Leverhulme, la Ingeniería y Ciencias Físicas de Investigación [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] y Consejo de Investigación Médica [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Agradecemos a E. Avezov y M. Lu para la transfección de la LifeAct-GFP y células citosólica-GFP, respectivamente, y W. Chen para la preparación de la cultura HEK293. Agradecemos también a K. O&#39;Holleran para obtener ayuda con el diseño del microscopio, y L. Shao y R. Heintzmann para las discusiones y sugerencias útiles.

<ol><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+modulated+excitation+microscopy%3A+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating%5BTitle%5D)+AND+%22BiOS+Eur%22%5BJournal%5D)">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li>
<li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li>
<li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li>
<li>Davies, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYK4+Promotes+Antiparallel+Microtubule+Bundling+by+Optimizing+MKLP1+Neck+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002121(2015).</li>
<li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat. Commun. 6, 5980(2015).</li>
<li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li>
<li>Esbjörner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+amyloid+%CE%B2+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A%CE%B2%281-40%29+and+A%CE%B2%281-42%29+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li>
<li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li>
<li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Super-Resolution+Imaging+of+%CE%B2-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo%3A+Method+and+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Biol.+Alzheimer%27s+Dis.+SE+-+6%22%5BJournal%5D)">Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li>
<li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+resolution+wide-field+optical+imaging%3A+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945(2006).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li>
<li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li>
<li>Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li>
<li>Förster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663(2014).</li>
<li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fastSIM%3A+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001(2015).</li>
<li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+internal+reflection+microscopy%3A+super-resolution+imaging+of+bacterial+dynamics+and+dark+field+imaging%22">Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging</a>. , University of Freiburg. (2012).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Meadowlark Optics Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Polarization+Techniques+and+Devices%22">Basic Polarization Techniques and Devices</a>. , (2005).</li>
<li>O'Holleran, K., Shaw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effects+on+contrast+in+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy.</a> Opt. Lett. 37 (22), 4603(2012).</li>
<li>Brankner, S. Z., Hobson, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrankner%2C+SZ+%22Synchronization+and+Triggering+with+the+ORCA-Flash4.0+Scientific+CMOS+Camera%22">Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera</a>. , <a target="_blank" href="http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf">http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf</a> (2013).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Wicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-iterative+determination+of+pattern+phase+in+structured+illumination+microscopy+using+auto-correlations+in+Fourier+space%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space.</a> Opt. Express. 21 (21), 24692(2013).</li>
<li>Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-smooth+convex+optimization+for+an+efficient+reconstruction+in+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%222014+IEEE+11th+Int.+Symp.+Biomed.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy.</a> 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).</li>
<li>Ströhl, F., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+joint+Richardson-Lucy+deconvolution+algorithm+for+the+reconstruction+of+multifocal+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002(2015).</li>
<li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li>
<li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723(2013).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915(2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Hechas a medida sistemas TIRF-SIM como la configuración se detalla en este protocolo son capaces de imágenes multicolores de super-resolución a alta velocidad en comparación con los microscopios disponibles en el mercado. La ventaja inherente de SIM como una técnica de super-resolución es que la resolución temporal no está limitado por los fotofísica del fluoróforo, en comparación con otros métodos, como única molécula de microscopía de localización (SMLM) o métodos de exploración de punto tales como la microscopía de agotamiento de la emisión estimulada ( STED). A diferencia de estas otras técnicas, SIM no requiere fluoróforos photoswitchable o no renovables de modo de imagen multicolor es sencillo. sistemas TIRF-SIM no, como óptica de seccionamiento SIM y multifocal SIM generalmente pueden lograr mejoras en la resolución de 1,7 veces o menos en la práctica en comparación con el factor de 2 mejora informado aquí, y sistemas comerciales también son a menudo más lento y menos flexible que el sistema de presentado en este protocolo. &quot;&gt; Las dos dificultades principales en la aplicación de esta técnica son en primer lugar la necesidad de un posicionamiento preciso de las seis vigas SIM dentro de la zona TIR de la abertura posterior del objetivo, que requiere un tiempo de laborioso y consume procedimiento de alineación óptica. En segundo lugar, para producir alto contraste patrón en la muestra, la rotación de la polarización es esencial. para los sistemas de NA 2D-SIM bajos, la rotación de la polarización se puede evitar mediante una cuidadosa elección de la orientación de la polarización lineal, pero esto se hace imposible para TIRF-SIM 25. para imágenes multicolor de alta velocidad, electro- control de la polarización óptica es necesaria y esto aumenta la complejidad y el costo del sistema. Las limitaciones de la técnica TIRF-SIM, como TIRF convencional, es, naturalmente, limitada a la observación de las estructuras y procesos localizados en la membrana celular basal que puede ser iluminado por la profundidad de penetración 150 a 200 nm del campo evanescente biológicos. MientrasSIM es a menudo citado como menos photodamaging a las células que cualquiera STED o SMLM, resolución duplicación lateral tiene todavía aumentar el número requerido de fotones por al menos 4 veces 5 en comparación con la microscopía TIRF convencional. Para imágenes en alta velocidad de cuadros con exposiciones breves momentos, este aumento de fotones hace necesario el uso de mayores intensidades de iluminación. Mientras que cualquier fluoróforo se puede utilizar para obtener imágenes de muestras SIM móviles fijos o lentos, proteínas fluorescentes de alta luminosidad o tintes sintéticos de nueva generación con fotoestabilidad mejorada se recomiendan para imágenes de células vivas. Aunque esta aplicación es capaz de formar imágenes de un solo color a velocidades de cuadro SIM en exceso de 20 Hz, de formación de imágenes multicolor en el sistema presentado está limitado por el tiempo de conmutación de la rueda de filtro de emisión motorizado. Debido al gran tamaño del chip de la cámara sCMOS, el uso de un filtro de emisión de multibanda y de imagen óptica de división sería posible y permitir i simultáneaMaging con múltiples longitudes de onda a ninguna pérdida de velocidad. Otra posibilidad sería la de alternar los diferentes láseres de excitación y utilizar un filtro de muesca multibanda para rechazar la luz de excitación. El uso de un SLM ferroeléctrico binario en esta implementación también no es óptima. La eficiencia de difracción de un SLM de este tipo es muy baja, por lo que la mayor parte de la luz incidente es en la reflexión de orden cero, que se filtra por la máscara espacial. Para aplicaciones que requieren velocidades de fotogramas muy altas, la velocidad de formación de imágenes está por lo tanto limitada por la potencia de salida de los diodos láser. El MST también introduce algunas elipticidad en la polarización para longitudes de onda de distancia de la longitud de onda de diseño de 550 nm, donde los píxeles no funcionan placas de media onda como ideales. Aunque esto podría compensarse mediante el uso de una LCVR adicional, la solución ideal puede ser el uso de un dispositivo de micro-espejo digital (DMD) como un generador de patrones. Las posibles modificaciones La configuración presented aquí es flexible y más fácil de modificar que los instrumentos comerciales para que otras modalidades de imágenes tales como 3D-SIM, rápido 2D-SIM, SIM multifocal (MSIM) y SIM no lineal (NL-SIM) se pueden implementar 21,34,35. 2D-SIM puede ser muy adecuado para la formación de imágenes relativamente plana, de movimiento rápido estructuras tales como el retículo endoplasmático periférica. El ER periférica es más profundo dentro de la célula que puede ser iluminado mediante un campo evanescente TIRF pero debido a su estructura plana se pueden obtener imágenes utilizando el estándar 2D-SIM con insignificante fondo fuera de foco. Además, el uso de mejores algoritmos de reconstrucción de seccionamiento óptico para suprimir fuera de foco de luz se extiende el uso de 2D-SIM para muestras ópticamente gruesas, aunque donde no se requiere una resolución axial de 21 duplicación. En MSIM, la muestra es iluminada por una celosía escasa de focos de excitación 36. Esta modalidad puede ser implementado por la simple eliminación de la máscara espacial (SM) Y su sustitución por un polarizador. El SLM ahora funciona como un modulador de amplitud. Las rejillas SIM binarias que aparecen en el SLM pueden ser reemplazados por una celosía 2D de manchas, con el tamaño de los lugares elegidos para ser igual al tamaño de un enfoque limitado de difracción en el plano de la imagen. En la Figura 7A, un enrejado de 4 x 4 píxeles cuadrados se muestra en el SLM (recuadro) que cuando demagnified sobre la muestra genera difracción focos limitados de 150 x 150 nm, dado el tamaño SLM pixel física de 13,62 m. Los focos de excitación se puede traducir al cambiar el patrón reticular en el MST y esto se repite varias veces con el fin de iluminar todo el campo de visión. Las imágenes se adquieren para cada posición del patrón traducida y la pila es post-procesados ​​para producir una imagen reconstruida con una mejor resolución de hasta un factor de <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> y la reducción de fuera de foco de luz en comparación con la imagen de campo amplio equivalente30. Esta modalidad puede ser útil para la formación de imágenes gruesas muestras y densos para los que SIM estándar no es adecuado, por ejemplo, las estructuras de bajo contraste, tales como células rojas de la sangre teñidas (Figura 7C), aunque el tiempo de adquisición se incrementa debido a la gran cantidad de marcos primas requerido por campo de visión (en este caso N = 168). Por último, la configuración puede ser modificado para permitir que sea de alta NA lineal TIRF-SIM o activación modelado no lineal SIM (PA NL-SIM), tal como se presenta recientemente por Li et al., Mediante el uso de un 1,7 objetivo o adición ultra alta NA de un láser de fotoactivación 405 nm y optimización cuidadosa de los patrones de rejilla SLM 35. Las aplicaciones futuras SIM es todavía una técnica rápida evolución y muchas aplicaciones en las ciencias de la vida se habilitará en el futuro. La velocidad, la resolución y mejoras de contraste de la técnica y la capacidad de utilizar fluoróforos estándar mean que para bioimagen, SIM está configurado para reemplazar muchos sistemas de microscopio convencionales, tales como plataformas de campo confocal y de ancho. Los sistemas SIM comerciales ya están disponibles hoy en día con las especificaciones técnicas pendientes, sin embargo, están fuera del alcance económico de muchos laboratorios de investigación, y, sobre todo, son inflexibles para ser modificado y desarrollado para implementar las investigaciones más recientes en el campo. También carecen de la capacidad esencial para &#39;ser adaptado para el experimento a la mano &quot;, a menudo un cuello de botella crítico en la reducción de la investigación biológica borde. El sistema descrito aquí será especialmente adecuado para estudiar los procesos dinámicos cerca de la superficie de la célula, para estudios in vitro de los sistemas bicapa reconstituidas, para estudiar la química de superficie en los materiales y las ciencias físicas, por ejemplo. de materiales 2D, y muchas otras aplicaciones.

Durante la última media década, super-resolución de la microscopía ha madurado y se trasladó de los laboratorios de óptica especialistas en manos de los biólogos. Existen soluciones comerciales de microscopio para las tres variantes principales para lograr la óptica de super-resolución: sola molécula de microscopía de localización (SMLM), estimuló la microscopía agotamiento de emisión (STED), y estructurado iluminación microscopía (SIM) 1,2. SMLM como la microscopía photoactivated localización (PALM) y estocástico microscopía óptica de reconstrucción (Storm) han sido las técnicas más populares, en gran parte debido a la simplicidad de la configuración óptica y la promesa de alta resolución espacial, con facilidad hasta 20 nm. Sin embargo super-resolución microscopía vía única localización molécula viene con una compensación intrínseca: la resolución alcanzable espacial depende de la acumulación de un número suficiente de localizaciones de fluoróforos individuales, por lo tanto, la limitación de la resolución temporal. proceso dinámico de imágenesES en células vivas, por tanto, se convierte en problemático, ya que hay que muestrear adecuadamente el movimiento de la estructura de interés para evitar artefactos de movimiento mientras que también adquirir suficientes eventos de localización en ese momento para reconstruir una imagen. Con el fin de cumplir con estos requisitos, demostraciones en vivo de células SMLM han obtenido el incremento requerido en las tasas de fluoróforo photoswitching aumentando en gran medida la potencia de excitación, y esto a su vez conduce a la fototoxicidad y el estrés oxidativo, lo que limita el tiempo de supervivencia de la muestra y relevancia biológica 3. Una clara ventaja de STED sobre ambos SIM y SMLM es que puede se logró imagen con super-resolución en muestras gruesas, por ejemplo la resolución lateral de alrededor de 60 nm en cortes de cerebro organotípicos a profundidades de hasta 120 micras 4. Imaging a tales profundidades con implementaciones objetivos individuales de SMLM o SIM es inviable, sino que se hace posible con cualquiera de lámina de luz de una sola molécula o celosía de lámina de luz micrófonoroscopy 5. -STED velocidad de vídeo también se ha demostrado y se utiliza para mapear la movilidad de las vesículas sinápticas, aunque hasta ahora esto se ha limitado a la formación de imágenes pequeños campos de visión 6. Para aplicaciones en la biología celular y reacciones moleculares de autoensamblaje 7 - 12 que requiere de formación de imágenes con alta resolución temporal sobre muchos puntos de tiempo, estructurado microscopía de iluminación (SIM) puede ser muy adecuado, ya que no depende de las propiedades fotofísicas de un fluorescente particular, sonda. A pesar de esta ventaja inherente de SIM, hasta ahora su uso se ha limitado principalmente a las imágenes de células fijas o procesos de movimiento lento. Esto es debido a las limitaciones de los sistemas SIM disponibles en el mercado: la velocidad de cuadro de adquisición de estos instrumentos estaba limitada por la velocidad de rotación de las rejillas utilizadas para generar los patrones de iluminación sinusoidales requeridas, así como el mantenimiento de la polarización óptica. La nueva generación de SIM comercialinstrumentos son capaces de imágenes rápidas, pero su precio es prohibitivo para todos excepto para las instalaciones centrales de imagen. Este protocolo presenta una guía para la construcción de un sistema flexible de SIM para obtener imágenes de procesos rápidos en muestras delgadas y cerca de la superficie basal de las células vivas. Se emplea fluorescencia de reflexión total interna (TIRF) para generar un patrón de iluminación que penetra más profundo que aproximadamente 150 nm en la muestra 13, que reduce enormemente la salida de la señal de fondo del foco. La idea de combinar SIM con TIRF es casi tan antigua como la propia SIM 14, pero no se realizó de forma experimental antes de 2006 15. La primera vez en vivo las imágenes obtenidas con TIRF-SIM se informó en 2009 16 han alcanzado velocidades de cuadro de 11 Hz para visualizar la tubulina y kinesin dinámica, y dos sistemas de TIRF-SIM de color se han presentado 17,18. Más recientemente, una guía para la construcción y el uso de un solo color de dos haces SIM sistema se presentó con el frame-rate de hasta 18 Hz 19,20. La puesta a punto que aquí se presenta es capaz de SIM de super-resolución de imagen a 20 Hz en tres colores, dos de los cuales pueden ser operados en TIRF-SIM. Todo el sistema se construye alrededor de un marco microscopio invertido y utiliza una etapa de traducción xy motorizado con una etapa z piezo-accionada. Para generar los patrones de excitación sinusoidal necesarios para TIRF de SIM, el sistema presentado utiliza un modulador espacial de luz ferroeléctrico (SLM). rallado patrones binarios se muestran en el MST y los órdenes de difracción ± 1 resultantes se filtraron, se transmiten y se centró en el anillo TIR de la lente objetivo. Los desplazamientos y rotaciones de las rejillas de fase necesarias se aplican cambiando la imagen SLM mostrada. Este protocolo describe cómo construir y alinear una trayectoria tal excitación, detalles de la alineación de la trayectoria de emisión, y presenta muestras de prueba para asegurar una alineación óptima. También De<html> escribas los problemas y retos particulares a alta velocidad TIRF-SIM en relación con el control de la polarización y la sincronización de los componentes. Consideraciones de diseño y limitaciones Antes de montar el sistema TIRF-SIM presentado en este protocolo, hay varias limitaciones de diseño a considerar que determinan la elección de los componentes ópticos. Todas las abreviaturas de los componentes ópticos se refieren a la Figura 1. Espacial modulador de luz (SLM) A ferroeléctrico SLM binario se utiliza en esta configuración, ya que es capaz de la conmutación de patrón de sub-milisegundo. MFEE nemáticos en escala de grises se pueden usar, pero estos ofrecen reducen en gran medida los tiempos de conexión. Cada dentro o fuera de píxel en una fase binaria SLM se impartir desplazamiento a la frente de onda plano incidente sea un π o 0 de fase, por lo tanto, si un patrón de red periódica se muestra en el SLM se operará como una difracción rejilla de fase. ent &quot;&gt; reflexión interna total (TIR) Para lograr TIR y producir un campo evanescente, el ángulo de incidencia de los haces de excitación en la interfase vidrio-muestra debe ser mayor que el ángulo crítico <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> . Esto establece el ángulo mínimo requerido incidente, y por lo tanto también la separación máxima, o periodo, del patrón de iluminación evanescente. El máximo ángulo incidente <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> (El ángulo de aceptación) está limitada por la apertura numérica (NA) de la lente objetivo que se puede calcular a partir de la definición <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> . Esto determina el patrón de espaciado mínimo alcanzable de acuerdo con la fórmula Abbe <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> que une NA y longitud de onda <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" /> a la separación mínima patrón <imgalt = &quot;Ecuación&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot; /&gt;. En la práctica, un 1,49 NA de inmersión en aceite objetivo TIRF se obtiene un ángulo máximo de incidencia de alrededor de 79 ° y un período mínimo patrón en la muestra de 164 nm utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nm. Estos dos ángulos definen un anillo en la abertura posterior de la objetivo sobre el cual el instrumento logra TIR de iluminación (es decir. El anillo TIR) y en el que los focos dos de excitación debe colocarse con exactitud y precisión girar para generar cada patrón de iluminación. Reconstrucción de imágenes TIRF-SIM requiere la adquisición de un mínimo de tres cambios de fase por la rotación del patrón, por lo tanto el período patrón SLM debe ser divisible por 3 (véase la figura 1). Por ejemplo, un período de 9 píxeles para la iluminación de 488 nm y 12 640 píxeles para la iluminación nm. Para una discusión completa de diseño del modelo del MST, incluyendo la optimización de sub-píxeles de patrón espaciado utilizando rejillas cizallados, Ver el trabajo previo de Kner et al. 16 y Lu-Walther et al. 20 La posición de los dos focos de excitación debe estar dentro de la anilla TIR para todas las longitudes de onda, sin embargo, el ángulo de difracción de los ± 1 órdenes del SLM es la longitud de onda dependiente. Para SIM estándar, imágenes multicolor se puede conseguir mediante la optimización del periodo de rejilla para la longitud de onda más larga, y tolerar una pérdida en el rendimiento de los canales más cortos. Para TIRF-SIM sin embargo, la optimización para una longitud de onda significa que la longitud de onda de otros focos ya no dentro del anillo TIR son. Por ejemplo, el uso de un periodo de red de 9 píxeles es suficiente para proporcionar TIRF de 488 nm, ya que los focos están en 95% del diámetro de la abertura hacia atrás y dentro del anillo de TIR, pero para 640 nm este período posicionaría los focos fuera la abertura. Por esta razón diferentes espaciamientos patrón de píxeles deben ser usados ​​para cada longitud de onda de excitación. La alineación de la trayectoria de excitación TIRF-SIMes extremadamente sensible a pequeños cambios en la posición del espejo dicroico (DM4 en la Figura 1) en el cuerpo del microscopio, mucho más que en el SIM convencional. No se recomienda el uso de una torreta giratoria filtro de cubo, en lugar utilizar una sola, espejo dicroico multi-banda, que se mantiene en una posición fija y diseñado específicamente para las longitudes de onda de excitación utilizadas. Es esencial que solamente se utilizan los más altos espejos dicroicos calidad. Estos requieren gruesas sustratos de al menos 3 mm, y se designan a menudo como &quot;plano de formación de imágenes&quot; por los fabricantes. Todos los otros sustratos conducen a la aberración intolerable y degradación de la imagen en TIRF-SIM. control de la polarización Para lograr TIRF-SIM es esencial para hacer girar el estado de polarización de la luz de excitación en sincronía con el patrón de iluminación de tal manera que permanece azimutal polarizada en el plano de la pupila objetivo con respecto al eje óptico (es decir,. s-polarizada). La alineación de la óptica de control de polarización dependerá del elemento óptico específico empleado, por ejemplo una célula Pockels 21, o una placa de media onda en una etapa de rotación motorizada 22. En este protocolo se utiliza un cristal líquido encargo retardador variable (LCVR), diseñado para proveer de onda completa (2π) retraso de todo el rango de longitud de onda de 488 a 640 nm, ya que permite la conmutación rápida (~ ms). Si se utiliza un retardador de cristal líquido, es esencial utilizar un componente de alta calidad: componentes estándar no son normalmente lo suficientemente estable como para dar un retardo de la constante en la duración del tiempo de exposición de la cámara que conduce a una borrosidad de la patrón de iluminación y bajo contraste de modulación . retardadores de cristal líquido también son fuertemente dependientes de la temperatura y requieren construidas en el control de la temperatura. Sincronización Los láseres se deben sincronizar con el MST. MFEE ferroeléctricos binarios están equilibrados internamente por sbrujas entre un estado encendido y apagado del estado. Los píxeles sólo actúan placas de onda como medio, ya sea en su estado activado o desactivado, pero no durante el tiempo de conmutación entre tramas. Por lo tanto, los láseres sólo deben estar encendidos durante los estados de encendido / apagado a través del LED de señal de habilitación del SLM para evitar la disminución del contraste patrón debido al estado intermedio de los píxeles. Un modulador acústico-óptico (AOM), alternativamente, podría ser utilizada como un obturador rápido si los láseres no pueden ser moduladas digitalmente. Elección de las lentes Sobre la base de estas limitaciones, el desmagnificación requerida del plano de SLM en el plano de muestra para producir los patrones de iluminación deseados se pueden determinar. Esto permite el cálculo de las distancias focales de las dos lentes L3 y L4 en el telescopio de retransmisión de la imagen y la lente condensadora de excitación L5. En este sistema a / de inmersión en aceite 1.49NA lente objetivo 100X se utiliza con 488 nm y 640 nm de excitación, por lo tanto, utiliza longitudes focales de 300 y 140 mmpara L4 y L3, y 300 mm para L5, dando un total de desmagnificación 357x, equivalente a un tamaño de píxel de SLM 38 nm en el plano de la muestra. El uso de esta combinación de lentes, SLM rejilla de períodos de 9 para 488 iluminación nm y 12 píxeles para 640 nm dan espaciamientos patrón de 172 y 229 nm en la muestra, que corresponde a ángulos de incidencia de 70 ° y 67 ° respectivamente. Para una interfaz vidrio-agua, el ángulo crítico es 61 °, y es independiente de la longitud de onda, por lo tanto estos dos espaciamientos patrón permiten excitación TIRF para ambas longitudes de onda. Una lente de objetivo equipado con un collar de corrección es útil para la corrección de aberraciones esféricas introducidas por variaciones en el espesor cubreobjetos, o si funciona a 37 ° C. Reconstrucción de imagen Una vez que los datos en bruto SIM ha sido adquirida es una cuestión de esfuerzo computacional para generar imágenes de super-resolverse en un proceso de dos pasos. En primer lugar, el patrón de iluminación tiene que ser determinada paracada imagen y en segundo lugar, los componentes del espectro de SIM se deben separar y recombinar apropiadamente como para duplicar el apoyo OTF efectiva (véase la Figura 6, inserciones). El conocimiento preciso de los patrones de iluminación proyectado es de suma importancia, ya que los componentes de frecuencia de super-resuelto tienen que ser mezclado con la mayor precisión posible para evitar artefactos causados ​​por las partes residuales de componentes superpuestos. Determinamos el patrón de iluminación parámetros a posteriori de los datos de imágenes en bruto siguiendo el procedimiento establecido por Gustafsson et al. 23 En resumen, un conjunto de parámetros de iluminación que describe una sinusoide de dos dimensiones normalizadas tiene que ser encontrado para cada una de las <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" /> patrones de excitación <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> : <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" /> Por la presente <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> y <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" /> describir el contraste franja y el patrón de la fase de arranque de cada imagen m individuo respectivamente. Los componentes del vector de onda, <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" /> y <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> , Sólo cambian con diferentes orientaciones <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" /> del patrón y lata supone que es de otro modo constante. Para determinar groseramente los componentes del vector de onda se realiza una correlación cruzada de los espectros de imágenes en bruto, que se refina mediante la aplicación de cambios de subpixel a una de las imágenes cruzada correlacionados como para optimizar la superposición. Esto se hace a través de la multiplicación de los gradientes de fase-espacio real <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" /> que inducen un cambio en los subpíxeles frecuencia-espacio. Observe que es útil tener una buena estimación de la onda-vectores antes de la estimación patrón real y esto se puede encontrar por la imagen de una capa de bolas fluorescentes. A medida que el paso de fase entre los patrones desplazado es <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> , Es decir. <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> , La separación de componentes de frecuencia puede ser realizada por una transformada de Fourier a lo largo de los &quot;eje de fase&quot;. La fase mundial <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" /> y el contraste de la franja <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> a continuación, se puede determinar usando regresión lineal compleja de diferentes componentes. Los componentes individuales separados se combinan a continuación, utilizando un filtro de Wiener generalizada. Para una descripción detallada tanto de extracción de parámetros y la aplicación del filtro de Wiener generalizado remitimos al lector a Gustafssonet al. 23, donde se utiliza el mismo algoritmo.

<table><tbody><tr><td>Láser de 488 nm</td><td>Toptica</td><td>iBeam SMART</td><td>con modulación digital</td></tr><tr><td>Láser de 561 nm</td><td>Coherent</td><td>OBIS LS</td><td>con modulación digital</td></tr><tr><td>Láser de 640 nm</td><td>Cobolt</td><td>MLD</td><td>con modulación digital</td></tr><tr><td>Espejos dicroicos de paso largo&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>para la combinación de haces de excitación</td></tr><tr><td>Espejo dicroico de cuatro bandas</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td> de <td>3 mm de espesor, TIRF de imagen plano, montado en cubo de filtro Olympus BX</td></tr><tr><td>Espejo dicroico de cuatro bandas</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>Del mismo lote que el anterior, 25 x 25 mm</td></tr><tr><td>Montura cinemática cuadrada de 1"</td><td>Edmund Optics</td><td>58-860</td><td></td></tr><tr><td>Calcita Glan-Taylor polarizadores</td><td>Thorlabs</td><td>GT5-A</td><td>Para la alineación de</td></tr><tr><td>la montura LCVR Glan-Taylor</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PM5</td><td></td></tr><tr><td>Placa de media onda acromática</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-600</td><td>400-800 nm</td></tr><tr><td>Montaje de jaula de rotación</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>para HWP</td></tr><tr><td>Cristal líquido Retardador variable</td><td>Meadowlark Optics</td><td>SWIFT</td><td>Construido a medida para proporcionar retardo de onda completa en el rango de 488 a 640 nm.</td></tr><tr><td>Controlador LCVR</td><td>Meadowlark Optics</td><td>D3060HV</td><td>Controlador de alto voltaje de dos canales para retardadores de cristal líquido</td></tr><tr><td>Placa acromática de cuarto de onda</td><td>Meadowlark Optics</td><td>AQM-100-0545</td><td></td></tr><tr><td>Montaje en jaula de rotación</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1P/M</td><td>Para doblete acromático QWP</td></tr><tr><td>de 10 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-010-A-ML</td><td>Para expansor de haz</td></tr><tr><td>200 mm acromático doblete</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>Para expansor de haz</td></tr><tr><td>Jaula XY Traductores</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>Modulador de luz espacial ferroeléctrico</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-00249&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SXGA-3DM (IFF) Micropantalla tipo M249, 1.280 x 1.024 píxeles, con placa de controlador</td></tr><tr><td>marco de montaje SLM</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-10014</td><td>Fijado a un soporte de aluminio hecho a medida</td></tr> <tr><td>y Oslash; Montaje de espejo con cardán de 50,8 mm</td><td>Thorlabs</td><td>GM200/M</td><td>para montaje SLM</td></tr><tr><td>Platina de traslación lineal de dos ejes con plataforma giratoria</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1/M</td><td>para montaje SLM</td></tr><tr><td>Soporte de raíl</td><td>Newport</td><td>M-PRC-3</td><td>Para montaje SLM</td></tr><tr><td>Carril óptico de precisión</td><td>Newport</td><td>PRL-6</td><td>Para montaje SLM</td></tr><tr><td>Lente doble acromática de 300 mm</td><td>Qioptiq</td><td>G322 273 322 y nbsp;</td><td>f = 300 mm, 31,5 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Lente doble acromática de 140 mm</td><td>Qioptiq</td><td>G322 239 322</td><td>f = 140 mm, 31,5 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Monturas de traslación XY de precisión</td><td>Thorlabs</td><td>LM2XY</td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores de montaje</td><td>de lentes Thorlabs</td><td>SM2AD32</td><td>Para el montaje de lentes de 31,5 mm en monturas de 2"</td></tr><tr><td>Etapas de traslación</td><td>Comar</td><td>12XT65</td><td>Cola de milano, accionamiento lateral</td></tr><tr><td>Traductor XY con accionamientos diferenciales</td><td>Thorlabs</td><td>ST1XY-D/M</td><td>para filtro espacial</td></tr><tr><td>Montaje en jaula de rotación</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>para filtro espacial</td></tr><tr><td>Doblete acromático de 300 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-300-A-ML</td><td>Lente de tubo de excitación</td></tr><tr><td>Platina XY automatizada con placa superior piezoeléctrica Z</td><td>ASI</td><td>PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&nbsp;</td><td>con controlador MS-2000</td></tr><tr><td>Montura de microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Lente de objetivo</td><td>Olympus</td><td>UAPON100XOTIRF</td><td>100X/1.49NA</td></tr><tr><td>Rueda de filtros de alta velocidad</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110A</td><td>con controlador Prior ProScan III</td></tr><tr><td>Filtros de emisión de paso de banda</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30, FF01-676/29</td><td></td></tr><tr><td>Cámara sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA Flash v4.0</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora superior de etapa</td><td>OKO Lab</td><td>H301-K-FRAME</td><td>Para la obtención de imágenes de células vivas, con controladores de temperatura y CO2 Bold Line Postes ópticos</td></tr> de <tr><td>acero inoxidable</td><td>Thorlabs</td><td>TR series</td><td>para el montaje de componentes ópticos</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>PH series</td><td>para el montaje de componentes ópticos</td></tr><tr><td>Monturas cinemáticas de espejos Thorlabs</td><td></td><td>KM100</td><td>para el montaje de espejos de 1"</td></tr><tr><td>Interferómetro de cizallamiento</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas fluorescentes de 100 nm</td><td>Life Technologies</td><td>T-7279</td><td>Tetraspeck</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83697-250MG</td><td></td></tr><tr><td>8 pocillos platos con fondo de vidrio</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td>con cubreobjetos #1.5</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>con cubreobjetos #1.5</td></tr><tr><td>0,01 mm portaobjetos de retícula para microscopio</td><td>EMS</td><td>68039-22</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10613</td><td></td></tr></tbody></table>

una guía para la iluminación estructurada de microscopía tirf a alta velocidad con colores múltiples

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Óptica de super-resolución de imagen con iluminación estructurada microscopía (SIM) es una tecnología clave para la visualización de los procesos a nivel molecular de las ciencias biomédicas y químicas. Aunque los sistemas de SIM comerciales están disponibles, los sistemas que están diseñados a medida en el laboratorio puede superar los sistemas comerciales, este último típicamente diseñados para facilidad de uso y aplicaciones de uso general, tanto en términos de la fidelidad de imagen y velocidad. Este artículo presenta una guía detallada para la construcción de un sistema de SIM que utiliza la iluminación de reflexión interna total (TIR) ​​y es capaz de imágenes de hasta 10 Hz en tres colores con una resolución de llegar a 100 nm. Debido a la combinación de SIM y TIRF, el sistema proporciona un mejor contraste de la imagen que las tecnologías rivales. Para cumplir con estas especificaciones, varios elementos ópticos se utilizan para habilitar el control automatizado sobre la estructura y estado de polarización espacial de la luz de iluminación para todos wav excitación está disponibleelengths. se dan detalles sobre la ejecución y control de hardware para lograr la sincronización entre la generación de luz de excitación patrón, longitud de onda, estado de polarización, y el control de la cámara con un énfasis en lograr la máxima velocidad de fotogramas de adquisición. Un protocolo paso a paso para la alineación y calibración del sistema se presenta y la mejora alcanzable resolución se valida en muestras de ensayo ideales. La capacidad para la velocidad de vídeo de super-resolución de imagen se demuestra con las células vivas.

Este artículo proporciona una guía detallada para el montaje y el funcionamiento de un microscopio de iluminación estructurada que funciona con iluminación de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF-SIM) para obtener imágenes de procesos biológicos dinámicos con superresolución óptica en múltiples colores.

Una guía para la iluminación estructurada de microscopía TIRF a alta velocidad con colores múltiples

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

El objetivo general de este protocolo es construir y alinear un microscopio de iluminación estructurada adecuado para la obtención de imágenes de superresolución de células vivas de alta velocidad capaz de operar en modos TIRF y de sección óptica con múltiples colores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular que actualmente no se pueden responder utilizando la microscopía TIRF limitada por difracción estándar. La principal ventaja de esta técnica es su rápida resolución en el tiempo en comparación con otras técnicas de microscopía de superresolución, lo que la hace muy adecuada para obtener imágenes de procesos dinámicos en células vivas.Aunque este protocolo describe los pasos para la construcción de un microscopio TIRF-SIM, la configuración es flexible y fácilmente modificable para implementar modalidades de imagen como 3D-SIM, SIM multifocal y SIM no lineal. Para organizar y alinear la ruta de excitación para un microscopio de iluminación estructurado, comience marcando las posiciones de los componentes en la mesa óptica como se indica aquí. Después de insertar el primer espejo dicroico, DM4, en la torreta del cubo de filtro del marco del microscopio, inserte el segundo espejo dicroico, DM3, en una montura de espejo cinemático cuadrado de una pulgada y colóquelo a una distancia focal de la lente del condensador, L5. A continuación, para definir con precisión el acceso óptico del sistema, retire la lente del objetivo, OB, de la torreta y, en su lugar, atornille una herramienta de alineación.A continuación, utilice el espejo dicroico DM3 y un espejo de alineación temporal colocado en la ubicación final aproximada del SLM para dirigir un haz de referencia colimado desde el láser uno a través del centro de los orificios de los dos discos de alineación. Usando tres espejos y el espejo dicroico DM2 como se muestra aquí, dirija el haz desde el láser uno al espejo temporal. Una vez que se haya determinado el eje óptico grueso, retire la herramienta de alineación.A continuación, inserte un iris en la trayectoria del haz antes de que entre en el cuerpo del microscopio y céntrelo en el haz. Coloque un trozo de cartulina blanca con un pequeño orificio centrado en el iris, luego vuelva a insertar la lente del objetivo. A continuación, realice ajustes angulares iterativos en los espejos DM3 y en la posición SLM para centrar la reflexión posterior en la tarjeta con el haz entrante.A continuación, retire temporalmente la lente del objetivo y marque el punto láser en el techo para crear una posición de referencia. Inserte la lente de tubo, L5, aproximadamente a una distancia focal del objetivo, montándola en una platina de traslación lineal configurada para trasladar a lo largo de la dirección del haz de referencia. Ajuste la posición y el ángulo de la lente del tubo de modo que el haz que sale del objetivo se colime y golpee el punto de referencia en el techo.Compruebe que la lente esté perpendicular al haz comprobando de nuevo el reflejo posterior con el iris y la tarjeta blanca. A continuación, retire la lente del objetivo e inserte la segunda lente del telescopio de retransmisión de imagen, L4. Utilice la etapa de traslación lineal para ajustar la posición y el ángulo de esta lente para mantener la colimación y para asegurarse de que el haz de referencia siga golpeando el punto marcado en el techo. Vuelva a colocar la lente del objetivo e inserte la primera lente del telescopio, L3. Ajuste la posición y el ángulo de esta lente para garantizar la colimación y la no deflexión como se describió anteriormente.Después de montar el chip SLM de acuerdo con el protocolo de texto, con las lentes alineadas, inserte el SLM en lugar del espejo. Ajuste la posición del SLM de modo que el haz de referencia se encuentre en el centro del chip SLM y ajuste el ángulo para que el haz pase a través de las dos lentes de relé. A continuación, compruebe que el haz de referencia sigue centrado en el punto marcado.Monte el retardador variable de cristal líquido, o LCVR, con su eje rápido a 45 grados a la polarización incidente. Luego, después de completar la alineación del rotador de polarización de acuerdo con el protocolo de texto, utilizando la luz transmitida a través de los oculares, concéntrese en una retícula y fije la lente del objetivo en esta posición. A continuación, prepare una monocapa de perlas fluorescentes extendiendo una gota de perlas multicolor de 100 nanómetros sobre un cubreobjetos número 1,5.Deje que las perlas se sequen para adsorberlas al vidrio antes de volver a sumergirlas en agua. Con aceite de inmersión, coloque la muestra de cuentas en el objetivo. Ajuste con precisión la posición de la cámara para que la capa de perlas fluorescentes esté enfocada.Después de generar patrones de rejilla binaria SIM como archivos de mapa de bits y cargarlos en el SLM de acuerdo con el protocolo de texto, cargue el software de control del SLM y haga clic en Conectar. En la pestaña Repertorio", haga clic en Cargar"para abrir el archivo de repertorio y comprobar el número de órdenes de ejecución contenidas en el archivo. Haga clic en "Enviar a la junta" para cargar el archivo de repertorio en el SLM.A continuación, seleccione la pestaña "Estado" e introduzca el número de la orden de ejecución. Haga clic en "Seleccionar" para cambiar el orden de ejecución a la rejilla de alineación. Inserte una máscara espacial, o SM, montada en una etapa XY en la trayectoria del haz en la posición focal de L3 y traslade su posición con respecto al eje óptico de modo que solo se pasen los primeros órdenes deseados.Justo después del filtro espacial, solo serán visibles dos haces circulares. Compruebe la imagen de la capa de cuentas fluorescentes en la cámara. Si los dos haces circulares no se superponen como se muestra aquí, vuelva a colocar el plano de muestra, ajustando iterativamente la lente del objetivo y la posición de la cámara.Después de ajustar el enfoque y configurar el plano de muestra de acuerdo con el protocolo de texto, confirme la iluminación TIRF mediante imágenes, por ejemplo, una solución de colorante de rodamina 6G de 10 micromolares enfocando el tinte. Si los dos haces inciden en el ángulo TIRF correcto, entonces las moléculas individuales serán visibles sin un fondo alto y los bordes de la apertura circular estarán enfocados. Se pueden realizar ajustes finos en la posición de los haces ajustando el espejo dicroico DM3.Para sincronizar y calibrar el sistema, coloque la muestra monocapa de perlas en el objetivo y concéntrese. Utilice el software de control SLM para programar el SLM para mostrar cada una de las tres imágenes de desplazamiento de fase a su vez para la primera orientación del patrón. A continuación, cambie al orden de ejecución cuatro del repertorio de ejemplos.En el software de adquisición, configure la cámara para el período de exposición global eligiendo "Propiedades avanzadas de la cámara" y configurando "Tipo de disparo de salida 1" en positivo y "Tipo de disparo de salida 2" en negativo. En el panel de secuencia, en Tipo de análisis, seleccione Registro de disco duro y establezca el recuento de fotogramas en tres. A continuación, haga clic en "Inicio"para adquirir tres fotogramas.El patrón SLM cambiará con cada exposición. Después de calcular el sistema de acuerdo con el protocolo de texto, en el software de control SLM, cambie el orden de ejecución de SLM a la serie completa de nueve imágenes de rejilla binarias requeridas para TIRF-SIM. Este es el orden de ejecución cero en el repertorio de ejemplos.Después de adquirir nueve imágenes de la muestra de cuentas, en el panel de secuencia del software de la cámara, seleccione "Registro de disco duro" como tipo de escaneo y cambie el recuento de fotogramas a nueve. A continuación, haga clic en "Inicio" para adquirir imágenes. Por último, en Guardar imágenes almacenadas en búfer, elija TIFF como tipo de imagen y haga clic en Aceptar. Reconstruya una imagen de súper resolución de acuerdo con el protocolo de texto.En la imagen, se obtuvieron imágenes de perlas fluorescentes multicolores de 100 nanómetros de diámetro para comparar el TIRF estándar con el TIRF-SIM. TIRF-SIM claramente tuvo una resolución lateral significativamente mayor en comparación con TIRF. La resolución estimada del microscopio es de 90 nanómetros y 120 nanómetros para TIRF-SIM de 488 y 640 nanómetros, respectivamente.Esto corresponde a una mejora de dos veces en la resolución lateral para ambas longitudes de onda en comparación con el caso teórico de difracción limitada. Como se ve aquí, se formaron fibrillas de amiloide marcadas con fluorescencia in vitro y también se utilizaron como muestra de prueba para demostrar la resolución duplicada. Las estructuras subcelulares con alto contraste, como los microtúbulos marcados con emGFP o LifeAct-GFP, son ideales para la obtención de imágenes TIRF-SIM y producen imágenes de alto contraste y superresolución.Las imágenes TIRF-SIM que utilizan la configuración demostrada permiten observar una subpoblación de microtúbulos ubicados en las proximidades de la corteza de la célula basal, y la polimerización y despolimerización de los microtúbulos se puede ver con el tiempo. Las muestras de bajo contraste sin estructuras discretas carecen de información de alta resolución, excepto en los bordes de la membrana plasmática y, por lo tanto, no son óptimas para la obtención de imágenes TIRF-SIM. Por último, el alto contraste de modulación es esencial para el éxito de las imágenes SIM.Como se demuestra aquí, la transformada de Fourier de la imagen reconstruida permite la visualización de la función de transferencia óptica SIM. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en aproximadamente una semana, si se han adquirido todas las partes necesarias. Al intentar este procedimiento, uno debe ser consciente de los problemas más críticos para implementar con éxito TIRF-SIM.En primer lugar, es esencial la alineación precisa de las vigas. Esto puede ser difícil, ya que deben estar ubicados en los bordes de la apertura de la lente del objetivo. En segundo lugar, es fundamental que el estado de polarización de la luz coincida con el patrón.Sin esto, el contraste del patrón de la muestra será bajo y la construcción posterior de la imagen será imposible. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de los pasos más importantes en la construcción y alineación de un microscopio TIRF-SIM basado en SLM. No olvide que trabajar con láseres de clase 3B puede ser extremadamente peligroso.La potencia del láser debe mantenerse a niveles seguros para los ojos mientras se realiza el proceso de alineación con el objetivo TIRF en su lugar.

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JoVE Journal

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Bioingeniería

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Este video demuestra una técnica de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de alta resolución para la visualización en tiempo real de la formación y cierre de fagosomas durante la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos (RBC) opsonizados con IgG adheridos a la superficie de un plato con fondo de vidrio. Los macrófagos extienden seudópodos alrededor de los glóbulos rojos y los engullen dentro de los fagosomas, separándolos de la superficie del vidrio.

Visualización basada en microscopía TIRF de la formación y el cierre de fagosomas

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

Aquí se muestra la preparación de bicapas lipídicas planas funcionalizadas con proteínas, la determinación de la movilidad de las proteínas en su interior y la medición de las densidades de las proteínas. Se esboza una hoja de ruta para la construcción de un microscopio de reflexión interna total con reducción de ruido, que permite visualizar fluorocromos residentes de una sola capa con alta resolución espacio-temporal.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

Para investigar las velocidades de flujo y la direccionalidad de la actina filamentosa en la sinapsis inmunológica de las células T, se combinan imágenes de superresolución de células vivas con fluorescencia de reflexión interna total y se cuantifican con espectroscopía de correlación de imágenes espacio-temporales.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

El objetivo general de esta metodología es darle las condiciones experimentales óptimas de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes y reconstrucción para realizar imágenes 2D color doble dSTORM de microtúbulos y filamentos intermedios de células...

Filamentos intermedios y microtúbulos con microscopía de reconstrucción óptica estocástica directo 2-dimensional de imágenes

Aquí, presentamos un protocolo para la localización de varios color de proteínas de membrana único en organelos de células vivas. Para colocar fluoróforos, se usan proteínas auto etiquetadas. Proteínas, situadas en compartimientos diferentes membranas de la mismo orgánulo, se pueden localizar con una precisión de ~ 18 nm.

Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

Aquí presentamos una guía práctica de la construcción de un sistema de microscopía integrado, que combina la proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, proyección de imagen de una sola molécula basada en la detección de súper resolución y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de una sola molécula la proyección de imagen, en una puesta en marcha de una manera costo-eficiente.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Un microscopio avanzado que permite rápido y de alta resolución de imagen de la membrana plasmática aislada y el volumen intracelular circundante, se presentará. La integración de microscopía de fluorescencia de reflexión interna disco y total en una configuración de giro permite energizados experimentos de imagen a precios de adquisición alto hasta 3.5 s por grupo imagen.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

La microscopía óptica de superresolución basada en chips es un enfoque novedoso para la microscopía de fluorescencia y ofrece ventajas en la rentabilidad y el rendimiento. Aquí, los protocolos para la preparación de chips y la toma de imágenes se muestran para la microscopía TIRF y la microscopía de superresolución basada en localización.

Fluorescencia de reflexión interna total de alto rendimiento y microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa utilizando un chip fotónico

Presentamos un protocolo para implementar la microscopía de interferencia-reflexión y la microscopía de reflexión-fluorescencia interna-total para la obtención simultánea de imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas a microtúbulos marcadas fluorescentemente.

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Aprende a construir y alinear un microscopio TIRF-SIM para imágenes de superresolución en células vivas a alta velocidad y en múltiples colores. Este protocolo detallado permite estudiar procesos biológicos dinámicos con resolución temporal mejorada.

Una guía para la iluminación estructurada de microscopía TIRF a alta velocidad con colores múltiples

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