Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D En Vivo

El objetivo general de este procedimiento es generar matrices de colágeno 3D alineadas y aleatorias, con el fin de observar la migración celular u otros procesos celulares en el contexto de un entorno 3D. Este método está diseñado para capturar las características del colágeno que encontramos en los tejidos reales, lo que puede ayudar a responder las preguntas clave, como los mecanismos que utilizan las células para reconocer una matriz extracelular alineada o aleatoria. La principal ventaja de esta técnica es que se puede manipular la organización del entorno 3D, las celdas de la imagen dentro y se puede hacer esto de manera rentable con el equipo que está comúnmente disponible.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no mezclan la solución de colágeno y el tampón de neutralización lo suficientemente bien y atraen el colágeno a través de los canales de manera inconsistente. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Brian Burkel, científico principal de mi laboratorio. Para comenzar, mezcle bien el colágeno y el tampón HEPES antes de agregar células y medios para garantizar una neutralización adecuada del colágeno.

Luego, agregue las células y los medios a la mezcla de colágeno neutralizado y colóquela en hielo como se describe en el protocolo de texto adjunto. Pipetear la mezcla helada en una superficie estéril tratada sin cultivo de tejidos para minimizar la adhesión y el crecimiento de células fuera del gel de colágeno. Utilice una pipeta para distribuir uniformemente la solución.

Deje que el gel se polimerice a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 a 15 minutos. A continuación, cubra los geles y muévalos a una incubadora de 37 grados centígrados durante 45 a 60 minutos adicionales para finalizar la polimerización. Tras la polimerización, el gel se volverá opaco.

Una vez polimerizado, agregue de dos a tres mililitros de medio. A continuación, libere los geles de los lados del pozo pasando una pipeta 200 por el perímetro del pocillo. Agite el plato suavemente para liberar el gel de la superficie inferior.

Con el fin de crear microcanales PDMS para alinear matrices de colágeno. En primer lugar, prepare un maestro de silicio SuA, utilizando las técnicas estándar de litografía blanda descritas en otra parte. A continuación, use un palito para manualidades para mezclar bien 20 gramos de base de elastómero con 2 gramos de agente de curado en un vaso desechable.

Una vez bien mezclado, desgasifique la mezcla de PDMS colocando el vaso desechable en una cámara de vacío bajo una presión de vacío de 550 milímetros de mercurio. Desgasifique la mezcla durante aproximadamente una a una hora y media. Mientras desgasifica el PDMS, prepare el maestro de silicio colocando una hoja limpia de película transparente en una placa caliente seguida del maestro de silicio.

Asegúrese de que el molde del microcanal quede hacia arriba. Después de una a una hora y media, retire el PDMS desgasificado de la cámara de vacío. Vierta lentamente el PDMS en el centro del maestro y permita que la gravedad lo distribuya uniformemente.

A continuación, enrolle con cuidado una segunda hoja de película transparente sobre el maestro de silicona y el PDMS para evitar burbujas de aire. Coloque suavemente una hoja de goma encima de la transparencia, seguida de una hoja de acrílico de 1/8 de pulgada, luego, agregue el primero de los tres pesos de diez libras encima de la hoja acrílica. Inicialmente, el primer peso flotará, permitirá que se asiente y se estabilice antes de proceder con los dos discos de peso restantes.

Cuando esté listo para continuar, ajuste una placa caliente a 70 grados centígrados y cure el PDMS durante cuatro horas. Una vez curado, deje que el PDMS se enfríe durante un mínimo de una hora adicional y luego, retire con cuidado la película de transparencia superior para la oblea. Por último, retira los canales con las pinzas.

Coloque los canales boca abajo sobre una nueva película de transparencia limpia y limpie todos los puertos con un movimiento circular con pinzas afiladas. Retire cualquier fragmento de PDMS que se suelte. A continuación, coloque un trozo de cinta de embalaje en el banco, con el lado adhesivo hacia arriba y coloque el canal PDMS con el lado hacia abajo encima de la cinta.

Presione los canales con el extremo redondo de un par de pinzas para asegurar un buen contacto. Retire los canales y repita este proceso en ambos lados hasta que se hayan eliminado todos los desechos visibles. Luego, transfiera los canales PDMS limpios y preparados a un tubo cónico de 50 mililitros lleno de etanol al 70%.

Agite los canales a máxima velocidad durante 30 segundos y luego reemplace la solución con etanol fresco al 70%. Utilizando técnicas asépticas, transfiera el canal PDMS con el lado hacia arriba, a una placa limpia y estéril. Luego, trate los canales con rayos UV hasta que el etanol se haya evaporado.

Una vez secos, voltee los canales sobre un cubreobjetos o un plato con fondo de vidrio y presiónelos sobre el vidrio para hacer un buen sello. Agregue un parche de PDMS estéril para cubrir y cerrar la parte central de los canales y deje que la configuración se seque completamente antes de continuar. A continuación, coloque una gota de 100 microlitros de una solución de colágeno de 10 microgramos por mililitro en la parte superior de un canal y extráigala a través del canal con una aspiradora.

Incube los canales a 37 grados centígrados durante una hora y luego transfiera los canales, aún llenos de solución de recubrimiento de colágeno, a un refrigerador. Enfríe la configuración durante aproximadamente 15 a 30 minutos y luego use un aspirador o pipeta para eliminar la solución de recubrimiento de colágeno de los canales. Comience neutralizando la solución de colágeno, diluyéndola con medios celulares e incubándola en hielo durante 15 minutos.

Luego, coloque de 120 a 150 microlitros de la solución de colágeno en el puerto A de un canal preenfriado. A continuación, conecte una pipeta de 25 mililitros a una línea de vacío y colóquela sobre el puerto C. Utilícela para aspirar la mezcla con un solo movimiento uniforme, deteniéndose una vez que el colágeno llegue al final. El paso más importante para generar matrices aleatorias es extraer lentamente el colágeno a través del canal.

Si se arrastra demasiado rápido, resultará en una mayor alineación en la parte del canal o en toda la totalidad del canal. Retire con cuidado cualquier exceso de solución de las regiones del puerto y luego coloque parches estériles de PDMS sobre ambos puertos, A y C. Después de dos a tres minutos, retire el parche central de PDMS que cubre el puerto B y agregue dos o tres micro camadas de células a una concentración de uno a tres millones de células por mililitro en el puerto central. Deje que el gel se polimerice parcialmente a temperatura ambiente durante otros 10 a 15 minutos y luego transfiera el producto a una incubadora de 37 grados centígrados durante 15 a 30 minutos adicionales.

Una vez polimerizado, retire las cubiertas de los puertos PDMS y agregue medios para cubrir completamente el canal. Aquí, 50.000 células T one se incrustaron en un gel de colágeno de 2 mg/ml o 3,5 mg/ml durante 5 días. La línea de cuatro células T es una línea de cáncer altamente contráctil, pero solo puede contraer el gel de alta densidad en aproximadamente un 10%, los geles de baja densidad se contraen en un 57% durante el mismo período de tiempo.

El grado de alineación del colágeno está modulado por la tasa de flujo de colágeno, de modo que una mayor tasa de flujo de colágeno produce una mejor alineación. El uso de canales más estrechos junto con presiones de vacío más altas mejora la alineación de la red de colágeno, mientras que un canal más ancho utilizado junto con bajas presiones de vacío genera matrices aleatorias. Una vez dominado, el vertido de geles o canales de colágeno se puede hacer en dos horas y media si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar configurar los componentes antes de comenzar. Una vez que comiences a trabajar con el colágeno, debes trabajar rápidamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular en 3D, exploraran la adhesión, migración e invasión celular en entornos extracelulares tridimensionales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo verter geles de colágeno de diferentes densidades y cómo generar, tanto matrices de colágeno aleatorias como alineadas.