Name: Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprende a transfectar siRNA mediante microporación en citotrofoblastos vellosos humanos recién aislados y a realizar EMSA para estudiar interacciones ADN-proteína en biología de la placenta.

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Este trabajo fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencias y la Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) (# 298527) (BB). CT fue apoyado por una beca de la FARE institucional. AV fue apoyada por un doctorado CRSNG Graham Bell beca. BB llevó a cabo una Cátedra de Investigación en Derechos Humanos Retrovirology (Nivel 2). Gracias a Beatriz Beisner en busca de ayuda en la revisión del texto.

El comité de ética de la UQAM ha aprobado estos protocolos, que están en conformidad con las directrices del Comité de Ética del Hospital de St-Luc del Centro Hospitalario Universitario de Montreal (Montreal, Canadá). Los participantes firmaron un consentimiento informado. 1. Medio Preparación y aislamiento de citotrofoblastos primarios vellosos <ol><li> Preparar medio de cultivo para citotrofoblastos vellosos primarios humanos complementando medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) con HEPES 25 mM, 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina. Se filtra el medio preparado a través de filtro de 0,22 micras estéril y guardar en un congelador a -20ºC en alícuotas de 50 ml. </li><li> Aislar citrofoblastos vellosidades primarias de placentas frescas siguientes protocolos estándar 3. <ol><li> Con unas pinzas, retirar la membrana fetal del tejido mediante rascado con cuidado si fuera poco, con cuidado de no remover el tejido de las vellosidades. Corta elrestante vellosidades placentarias en cubos de aproximadamente 3 x 3 cm utilizando escalpelo y tijeras. Es necesario lavar con agua que contiene 0,9% de NaCl para eliminar la sangre materna. <ol><li> La celebración de cada cubo con pinzas, retirar con cuidado el tejido de las vellosidades del resto de los vasos y tejidos fibrosos con unas tijeras. </li><li> De 15 a 30 mg de tejido de las vellosidades, digerir cuatro veces en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene tripsina (de 9,6 x 10 5 a 1,8 x 10 6 U; concentración final 1,2 mg / ml) y desoxirribonucleasa I (ADNasa I) ( concentración final 200 g / ml) durante 30 min a 37 ° C en un baño de agua con agitación continua. Nota: Use 150 ml de volumen total para la primera digestión, 100 ml para la segunda digestión y 75 ml para los dos restantes digestiones. </li></ol></li><li> Recoger el sobrenadante que contiene células dispersas y centrifugar a 1250 xg durante 15 min sin freno. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de DMEM precalentado que contiene1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> La capa de células dispersas en la parte superior de un discontinua 5% - 70% de gradiente de sílice recubiertas de polivinilpirrolidona (véase la Tabla 1 para la preparación de gradiente) y se centrifuga durante 23 min a 507 xg y sin freno. Eliminar la capa de densidad entre 1,017 a 1,033 por aspiración y recoger las capas entre 40% y 50% en el gradiente con una nueva pipeta. Lavar las células extensamente con 10 ml de DMEM precalentado que contienen 1% de penicilina / estreptomicina. Nota: La fracción recogida se corresponde con densidades de entre 1.048 y 1.062, que alberga los trofoblastos. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro. Brevemente, las células mezclar y añadir 10 l en un nuevo tubo de centrífuga. Añadir 10 l de azul de tripano y mezclar suavemente de nuevo. Elaborar la suspensión de células y llenar las cámaras de hemocitómetro. Contar las células bajo el objetivo de 10X. </li><li> Colocar 1 x 10 6 y 4,5 x 10 6 células en tubos separados para su uso en las secciones 1.3 y 2, respectivaLy. Sembrar las células restantes a una densidad de 1,5 x 10 6 células / pocillo en medio DMEM suplementado y la cultura a 37 ° C y 5% de CO2 durante un máximo de 4 días para otros experimentos. </li></ol></li><li> Evaluación de la pureza de aislados primarios citotrofoblastos vellosos <ol><li> Tirada 1 x 10 6 de los citotrofoblastos aislados recientemente en tubos de microcentrífuga a 300 x g. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de solución salina tamponada con fosfato precalentado (PBS). centrifugar las células a 300 xg y eliminar PBS mediante aspiración. </li><li> Añadir 1 ml de metanol frío a las células y se incuba a -20 ° C durante 20 min. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min y eliminar el metanol por aspiración. Precaución: Use máscara bote, gafas de seguridad y guantes de goma durante la manipulación de metanol. </li><li> Añadir 1 ml de PBS a temperatura ambiente para rehidratar las células, se centrifuga a 300 xg y eliminar PBS por aspiración. </li><li> Se incuban las células en PBS que contenía FBS (1:50 [v / v] de dilución) y un FcRreactivo de bloqueo (1:10) durante 45 min a temperatura ambiente para eliminar la unión no específica. </li><li> Lavar dos veces con 500 l de temperatura ambiente PBS, centrifugar las células a 300 xg durante 5 min y retirar PBS por aspiración. Resuspender las células en 100 l de PBS temperatura ambiente. </li><li> Se incuban las células con un isotiocianato de fluoresceína monoclonal de ratón (FITC) conjugado con LP5K anti-humano clon citoqueratina-7 de anticuerpos (1: 200) o un anticuerpo emparejado de isotipo de control no específico en PBS que contenía 0,2% de BSA durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Lavar las células en PBS. </li><li> Analizar las células mediante citometría de flujo 3. Utilice preparaciones de células, que demuestran un mínimo de 96% de células CK-7-positivos por citometría de flujo para experimentos adicionales. </li></ol></li></ol> 2. La transfección de siRNA primarios humanos vellosos citotrofoblastos <ol><li> La transfección de las vellosidades primarias citotrofoblastos humanas usando un dispositivo de formación de microporos <ol><li> Preparar placas de 6 pocillos que contienen2 ml de medio DMEM complementado para la incubación de células microporos. </li><li> Después del aislamiento de citotrofoblastos primarios (ver sección 1.2), tomar una alícuota de células en suspensión y determinar el número de células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Transferir 1,5 x 10 6 células a un tubo de microcentrífuga y las células de pellets por centrifugación a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Lavar las células con 1 ml de PBS de Dulbecco (DPBS) (Mg 2 +, Ca 2 + libre) y sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender las células suavemente en 100 l de tampón de resuspensión. Nota: No mantener la suspensión de células durante más de 15 a 30 min a temperatura ambiente, para maximizar la viabilidad de las células y la eficiencia de la transfección. </li><li> Añadir 300 ng de sincitina-2 siRNA (o revueltos de control-siRNA) en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y aspirar la mezcla de células utilizando un ARNsi 100 l transfección pipeta. Insertarla pipeta en la estación (ver Lista de Materiales) y someter las células a un solo pulso de 1300 V de 30 mseg. </li><li> Inmediatamente transferir las células a placas de 6 pocillos (preparados en la etapa 2.1.1) que contienen medio suplementado 37 ° C pre-calentado para evitar el daño celular. </li><li> Repita los pasos 2.1.5 y 2.1.6 para las muestras restantes. </li><li> Agite suavemente la placa durante 30 segundos para asegurar una distribución uniforme de las células. Incubar la placa a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado durante 24 a 48 h. Refrescar medio de cultivo 24 horas después de la transfección. </li><li> Evaluar la eficiencia de la transfección mediante análisis de transferencia Western (consulte los pasos 3 a 6). </li></ol></li><li> Lipofección de siRNA en citotrofoblastos humanas primarias <ol><li> Después del aislamiento de citotrofoblastos vellosos, sembrar las células a una densidad de 1,5 x 10 6 células por pocillo en placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de cultivo y se incuba durante 18 horas. </li><li> Diluir 300 ng de sincitina-2-siRNA (o revueltos controlsiRNA) y 5 l de reactivo de transfección basado en lípidos en distintos tubos de 1,5 ml en un volumen total de 10 l de medio antibiótico y libre de suero. Incubar durante 5 min. </li><li> Mezcle los reactivos diluidos y se incuba durante 20 min adicionales a temperatura ambiente para formar el complejo de transfección. Añadir 90 l de medio antibiótico y libre de suero a la mezcla a un volumen final de 100 l. </li><li> Retire el medio de cultivo de las placas de 6 pocillos (paso 2.2.1). Añadir 2 ml de medio fresco y la mezcla de transfección de 100 l a cada pocillo. Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 24 a 48 hr. Refrescar medio de cultivo 24 horas después de la transfección. </li><li> Evaluar la eficiencia de la transfección mediante análisis de transferencia Western (consulte los pasos 3 a 6). </li></ol></li></ol> 3. Preparación de lisados ​​de células completas Cultura <ol><li> Retire los medios de comunicación y enjuagar cada pocillo (de los pasos 2.1.8 y 2.2.4) utilizando DPBS precalentado (Mg2 +, Ca2 + libre). Aspirar el DPBS y añadir 500 l de ácido 0,25% de tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA). Incubar durante 1-3 minutos a 37 ° C en una incubadora de CO 2. Deja de tratamiento con tripsina mediante la adición de 500 l de suero que contiene medio de crecimiento. Nota: Utilizar el volumen de medios apropiados de acuerdo con el tipo de frasco / placa: 1 ml por 10 7 células / placa de 100 mm / matraz de 150 cm2; 0,5 ml por cada 5 x 10 6 células / mm / 60 plato de 75 cm 2 frasco. </li><li> La transferencia de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, células precipitado mediante centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. Lavar las células con DPBS (Mg 2 +, Ca 2 + libre) y las células de pellets por centrifugación a 300 xg durante 2 min a temperatura ambiente. </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Se coloca el tubo en hielo. Resuspender el precipitado en un tampón de 50-200 l helado de radio-inmunoprecipitación de ensayo (RIPA) (véase la Tabla 2 para la composición del tampón) que contiene recién añadirproteasa ed y inhibidores de la fosfatasa a una concentración final de 1x. En pocas palabras, el tubo de vórtice y dejar en hielo durante 30 min. </li><li> Centrifugado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Con cuidado, coloque el tubo en hielo. Con una pipeta, transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de pre-enfriado fresco conservado en hielo. Se desecha el precipitado. </li></ol> 4. Preparación de extractos nucleares de células cultivadas <ol><li> Para cada pocillo (paso 1.2.5), se lava dos veces citrofoblastos cultivadas con 1 ml de DPBS pre-calentado (Mg2 +, Ca2 + libre). Aspirar DPBS y añadir 500 l de 0,25% de tripsina / EDTA. Incubar durante 1 a 3 min a 37 ° C en una incubadora de CO 2 y detener el tratamiento con tripsina mediante la adición de 500 l de suero que contiene medio de crecimiento. </li><li> La transferencia de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, células precipitado mediante centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se lavan las células con DPBS (Mg 2+, Ca 2 + libre) y las células de pellet por centrifugacióna 300 xg durante 2 min a temperatura ambiente. Retire cuidadosamente todo el sobrenadante sin perturbar el sedimento y colocar el tubo en hielo. </li><li> Extracto de proteína nuclear de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinar la concentración de proteínas de cada muestra usando un ensayo de cuantificación de proteínas (Bradford o ensayo del ácido bicinconínico (BCA)). </li></ol> 5. Preparación de muestras y Electroforesis <ol><li> Determinar la concentración de proteínas para cada extracto de células usando un ensayo de cuantificación de proteínas (por ejemplo, Bradford 8 o 9 BCA). </li><li> De acuerdo con las instrucciones del fabricante (si los anticuerpos podrían utilizarse en condiciones de reducción y desnaturalización), añadir un volumen igual de 2x tampón de muestra Laemmli (Tabla 2) para 20 a 30 g de proteína total. </li><li> lisados ​​celulares hierven a 100 ° C durante 5 min. Alícuota de 50-100 l de lisado para evitar ciclos repetidos de congelación / descongelación y almacenar los tubos restantes a -20 ° C para su uso futuro. </li&gt; <li> Mientras que las muestras se están calentando, preparar 1 l de 1x tampón de funcionamiento (Tabla 2). </li><li> Girar las muestras a 16.000 xg durante unos segundos y colocarlos en hielo. </li><li> Carga igual cantidad de proteína en cada pocillo de un gel de SDS-PAGE 12% (véase la Tabla 2 para la composición de gel), junto con un marcador de peso molecular. Ejecutar el gel durante 1 a 2 horas a 100 V. </li></ol> 6. La transferencia de la proteína desde el gel a la membrana <ol><li> Activar membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) con metanol durante 1 min y enjuague con solución tampón / 10% de metanol transferencia 1x. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la transferencia de 30 min a 1 hr, dependiendo del tamaño de la proteína. Nota: Eficacia de transferencia puede evaluarse usando tinción con Ponceau Red antes de la etapa de bloqueo. </li></ol> 7. tinción de anticuerpos <ol><li> Bloquear la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C usando solución de bloqueo 5%. </li><li> Incubar la membrana con anticuerpos anti-sincitina-2 (4 mg / ml; 1: 5000) 6 o con anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 0,4 mg / ml; 1: 500) en solución de bloqueo 5% durante la noche a 4 ° C (anti-sincitina-2) o durante 45 min a temperatura ambiente. Lavar la membrana tres veces en solución salina tamponada con Tris Tween (TBST; véase la Tabla 2 para la composición del tampón) durante 5 min. </li><li> Incubar la membrana con peroxidasa de rábano picante apropiada (HRP) conjugado con anti-conejo o anticuerpo anti-ratón (1: 10.000) en 5% tampón de bloqueo en TBST a temperatura ambiente durante 1 hr. Se lava la membrana tres veces en TBST durante 5 min y luego enjuague en TBS. Detectar señales utilizando el sustrato de transferencia basado en quimioluminiscencia. </li></ol> 8. El radiomarcado del oligonucleótido de cadena simple <ol><li> reacción de fosforilación <ol><li> En un tubo de microcentrífuga, añadir 50 ng de un oligonucleótido hacia adelante a lo largo con tampón de polinucleótido quinasa T4 1x, 1 UT4 polinucleótido quinasa y 20 Ci (γ- 32P) ATP y compensar el volumen de reacción de 20 l con agua libre de nucleasa. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min. Detener la reacción mediante la adición de 5 l de 0,5 M EDTA. Completar el volumen de 50 l con agua libre de nucleasa. </li></ol></li><li> La eliminación de los nucleótidos no incorporados de oligonucleótidos <ol><li> Preparar una columna G-25 equilibrada con tampón TE (Tabla 2) siguiendo las instrucciones del fabricante. Colocar la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml DNasa libre fresco. </li><li> Añadir lentamente 50 l de sonda (de la etapa 8.1.2) sobre la resina, teniendo cuidado de no perturbar el lecho de resina. Centrifugado durante 2 minutos a 350 xg para recoger la muestra purificada en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Lavar la columna G-25 con 36 l de agua libre de nucleasa y centrifugado durante 2 minutos a 350 xg para recuperar la muestra en el tubo de microcentrífuga. </li></ol></li><li> La hibridación con la cadena complementaria oligonucleotide <ol><li> La transferencia de la sonda radiomarcada (86 l) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 200 ng del oligonucleótido inverso y 1x de tampón de hibridación (Tabla 2). Heat 5 min a 95 ° C y dejar toda la noche a temperatura ambiente para la refrigeración. </li><li> Preparar oligonucleótidos de doble hebra no radiactivos mediante la adición de 50 ng de no marcado adelante y atrás oligonucleótidos y 1x de tampón de hibridación en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Completar el volumen a 100 l con agua libre de nucleasa. El calor y mantener a temperatura ambiente como se describe en el paso 8.3.1. </li></ol></li></ol> 9. Preparación de un gel de poliacrilamida no desnaturalizante para EMSA <ol><li> Preparar un gel nativo 4% (10 x 12 cm) con un espacio de 1,5 mm-peine (véase la Tabla 2 para composición de gel). Limpiar todas las placas de vidrio con agua destilada. Nota: Es muy importante que las placas sean completamente libre de detergente iónico, como SDS. </li><li> inmediatamente pnuestra la solución de acrilamida entre las placas y permitir que la polimerización proceda (aproximadamente 30 min). </li><li> Montar el aparato de electroforesis y llenar el tanque con TBE 0,5x. Pre-ejecutar el gel durante 30 min a 1 hora a 150 V antes de la carga de la muestra. </li></ol> 10. ADN reacción de unión <ol><li> En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 10 g de extracto nuclear (paso 4.3) en tampón 1x Gel Shift Encuadernación (Tabla 2) y completar hasta el volumen final a 10 l con agua libre de nucleasa. Como control, prepare un tubo sin extracto nuclear. Para la reacción de competencia, añadir 1 l de oligonucleótido frío no específica o específica de doble hebra (etapa 8.3.2). </li><li> Añadir 1 l de sonda radiactiva procedente de la etapa 8.3.1 a cada reacción. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 20 min. Añadir 1 l de tampón de carga 10x gel por reacción y cargar cada muestra en el gel preparado en el apartado 9. </li><li> Ejecutar el gel durante 1 1/2 a 2 horas a 150 V. Después de la migración, envolver el gel y el vidrio en una envoltura de plástico y la posición en un casete de exposición por debajo de una pantalla de fósforo. Deja casete a 4 ° C durante 24 horas. </li><li> Retire la pantalla del casete de exposición e insertar en el dispositivo de imágenes de fósforo para la exploración. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los estudios sobre la función de la placenta humana y el desarrollo se han mejorado en gran medida por los protocolos orientados a optimizar el aislamiento de varias poblaciones de células placentarias. Uno de los mejores población de células de la placenta permanece estudiado los citotrofoblastos vellosos, cuyo estudio se ha beneficiado enormemente de los protocolos optimizados que permiten el aislamiento eficiente y fiable. Esto ha permitido, además, un número de experimentos, tales como estudios de transfección y de ...

La disfunción placentaria humana se asocia con el desarrollo de varias enfermedades asociadas al embarazo, como la preeclampsia y la restricción del crecimiento intrauterino 1. Un componente celular importante de la placenta son los trofoblastos, que se pueden clasificar como citotrofoblastos extravellosos o vellosos. Tras la fusión, los citotrofoblastos vellosos se diferencian aún más en la capa de sincitiotrofoblastos, una estructura celular multinuclear con un papel importante en el intercambio feto-materno y la producción de hormonas 2. Los citotrofoblastos vellosíticos primarios humanos y sus homólogos diferenciados representan muestras biológicas importantes y permiten a los investigadores estudiar una serie de procesos relacionados con la placenta, como la fusión celular, en cultivo. Además, se están realizando esfuerzos considerables para identificar marcadores que faciliten el tratamiento adecuado y mejoren las terapias preventivas específicas para las enfermedades relacionadas con el embarazo. Los laboratorios aíslan de forma rutinaria citotrofoblastos vellosidos humanos primarios de placentas frescas, utilizando un procedimiento de aislamiento estándar basado en la digestión con tripsina de las vellosidades de la placenta 3. Dado que los citotrofoblastos cultivados pierden su capacidad de proliferar y diferenciarse rápidamente en una capa similar a la de los sincitiotrofoblastos tras el cultivo 4, se necesitan métodos de transfección muy eficientes y enfoques de análisis optimizados. Estudios previos han determinado las condiciones óptimas de transfección de estos citotrofoblastos primarios 5. En este trabajo se presenta un método diferente de transfección de siRNA, que ha sido previamente probado en esta célula tipo 6. En comparación con un enfoque basado en la lipofección, este método de microporación mejora la transfección, evaluada por el grado de silenciamiento de genes específicos.
Los estudios de promotores y expresión génica también proporcionan una mejor comprensión de la función placentaria. Aunque su uso es más difícil debido al corto período de tiempo en el que se pueden cultivar los citotroblastos vellosicos primarios, los análisis de promotores que utilizan protocolos estándar pueden abordarse, como se ha publicado anteriormente 7. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) es uno de estos métodos in vitro comúnmente utilizados, lo que permite un seguimiento rápido y fácil de las interacciones ADN-proteína. Los extractos nucleares de estos trofoblastos primarios se utilizaron para probar una región del promotor de sincitina-2 para interacciones específicas. Los resultados revelaron que los factores ligados podían detectarse en diferentes puntos temporales de la cultura y de manera específica y reproducible.
Los datos presentados en este protocolo confirman que nuestro enfoque de transfección y el protocolo EMSA pueden utilizarse para citotrofoblastos vellosicos primarios aislados y serán de gran utilidad para estudiar las diversas funciones de los citotrofoblastos vellositos en condiciones normales o patológicas.

<table><tbody><tr><td>HBSS sin&nbsp; Ca2+, Mg2+&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#H2387</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Sigma</td><td>#14060-057</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Alta Glucosa sin Hepes</td><td>Gibco</td><td>#12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td><td>Gibco</td><td>#15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Neomicina (100x)</td><td>Gibco</td><td>#15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#A2411</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>#16170-078&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P-1644</td><td>Para las tecnologías de gradiente de densidad</td></tr><tr><td>Syncytin-2 siRNA</td><td>Ambion Life</td><td></td>#AM16708 <td></td></tr><tr><td>SiRNA codificado</td><td>Qiagen</td><td># SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td>#D5025 <td></td></tr><tr><td>Trypsine, tipo I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#T8003</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT Lipotransfección&nbsp; reactivos&nbsp;</td><td>GEhealthcare</td><td># T-2001-01</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de tripsina/EDTA</td><td>Life</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>#P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-conejo IgG, anticuerpo ligado a HRP&nbsp;</td><td>Señalización celular</td><td>#7074</td><td></td></tr><tr><td>BM Quimioluminiscencia Western Blotting Substrate (POD)</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11500708001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Tecnologías de la vida</td><td>#14287-080</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleótido quinasa</td><td>NEB</td><td>#M0201S</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]</td><td>Perkin Elmer</td><td>#BLU002A100UC</td><td></td></tr><tr><td>Acrylmide</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A9099</tr><tr><td>TEMED</td><td>Life technologies</td><td>#17919</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A3678</tr><tr><td>Clon del anticuerpo anti-citoqueratina-7 humano LP5K,</td><td>reactivo de bloqueo Millipore</td><td>CBL194F</td><td>dilución 1:200</td>FcR conjugado con</tr> FITC<tr><td>&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130- 059-901</td><td>Citómetro de flujo de dilución 1:10</td></tr><tr><td>BD Sistema Acuri</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microporator MP-100 aparato&nbsp;</td><td>Tampón de</td> resuspensión digital <td></td><td></td></tr> Bio <tr><td>R (Sistema de transfección de neón 100&nbsp; y micro; l Kit)</td><td>Tecnologías de la vida</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>membrana de PVDF&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010&nbsp;</td><td>Activar con metanol</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GAPDH</td><td>humano Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-137179</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado anticuerpo anti-conejo o anti-ratón anti-ratón</td><td>Señalización celular</td><td>#7074</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>Peroxidasa de rábano picante (HRP)-conjugado cabra anticuerpo anti-ratón</td><td>Señalización celular</td><td>#7076&nbsp;</td><td>1:10.000</td></tr><tr><td>NE-PER Reactivo de extracción nuclear y citoplasmática</td><td>Thermo Scientific</td><td>#78833</td><td></td></tr><tr><td>G-25 columna&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>#27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de imágenes de quimioluminiscencia y fluorescencia</td><td>Montr&eacute; al Biotech</td><td>Fusion FX5</td><td></td></tr><tr><td>4% gel nativo</td><td>PBS casero</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1x</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Imagen Molecular Personal (PMI)</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

los análisis de sirna transfección y emsa en recién aisladas vellosos citotrofoblastos humanos

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Los citotrofoblastos vellositos primarios humanos son una fuente muy útil de células primarias para estudiar las funciones placentarias y los mecanismos reguladores, y para comprender las enfermedades relacionadas con el embarazo. En este protocolo, los citotrofoblastos vellosidos primarios humanos recién aislados de placentas a través de un protocolo estándar de DNasa/tripsina se microporan con ARN interferente pequeño (siRNA). Este enfoque proporcionó una mayor eficiencia para la transfección de siRNA en comparación con un método basado en lipofección. Las células transfectadas pueden analizarse posteriormente mediante Western blot estándar en un plazo de 3 a 4 días después de la transfección. Además, utilizando citotrofoblastos vellosíticos primarios cultivados, se optimizó el análisis del ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y se realizó en extractos de los días 1 a 4. El uso de estas células primarias cultivadas y el protocolo descrito permiten evaluar la implicación de genes específicos y factores de transcripción en el proceso de diferenciación de citotrofoblastos vellosos en una capa celular similar a la de sincitiotropoblas. Sin embargo, el tiempo limitado permitido en el cultivo impide el uso de métodos que requieren más tiempo, como la generación de una población celular estable. Por lo tanto, las pruebas de esta población celular requieren protocolos de transferencia de genes altamente optimizados.

placentas frescos de embarazos a término fueron utilizados para aislar citrofoblastos vellosidades primarias humanos para llevar a cabo el conjunto de experimentos presentados en la sección Protocolo. Tras su aislamiento, se analizaron primero la pureza de citotrofoblastos mediante el uso del marcador de citoqueratina-7 (Figura 1). Preparaciones de células se tiñeron por lo tanto el uso de un anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina-7. La figura 1 repres...

Este protocolo describe un método para la transfección eficiente siRNA en recién aisladas citotrofoblastos vellosos humanos usando formación de microporos y la identificación de complejos de ADN-proteína en estas células. Las células transfectadas pueden ser monitoreados por Western blot y análisis EMSA durante el tiempo de cultivo de 4 días.

Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar las condiciones óptimas para la transfección de citotrofoblastos primarios de vellosidades recién aislados y presentar un método para la identificación de la interacción ADN-proteína en sitios promotores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación placentaria, como aquellas relacionadas con los genes involucrados en la diferenciación de citotrofoblastos y los mecanismos reguladores implicados en su expresión. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de realizar y muy eficiente.Además, el tiempo necesario para realizar este experimento es corto y puede incluir una gran cantidad de muestras diferentes. Estos procedimientos serán demostrados por Chirine Toufaily, una ex estudiante de doctorado de mi laboratorio, así como por Yong Xiao, un asociado de investigación. Aquí, los citotrofoblastos villotes primarios se aíslan de placentas frescas según protocolos estándar.El primer paso de este protocolo consiste en analizar la pureza de la preparación mediante análisis por FACS. Primero, centrifugue una vez diez elevado a la sexta de citotrofoblastos recién aislados en tubos de microcen

sirna-transfection-emsa-analyses-on-freshly-isolated-human-villous

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este protocolo, se describe la disección de placenta de ratón en el embarazo D10.5, seguido por el aislamiento de las células trofoblásticas utilizando un gradiente de Percoll. A continuación, demostrar el uso de las células aisladas en un ensayo de invasión de Matrigel.

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

Este manuscrito presenta un modelo in vitro único de células de citotrofoblasto velloso humano inmunopurificadas cultivadas bajo hipoxia/reoxigenación. Este modelo es adecuado para estudiar los efectos protectores de tratamientos prometedores, como la melatonina, sobre las complicaciones del embarazo asociadas con el aumento del estrés oxidativo y la alteración de la función placentaria.

Trofoblasto humana primaria cultivo celular modelo para estudiar los efectos protectores de la melatonina contra la hipoxia / reoxigenación interrupción inducida

Las células gigantes trofoblásticas (TGC) desempeñan un papel clave en la placenta para garantizar un embarazo saludable. Presentamos un protocolo para evaluar el estado transcripcional de genes en TGCs mediante hibridación fluorescente naciente in situ en secciones de criostato de embriones post-implantación o cultivos a corto plazo de conos ectoplacentarios embrionarios de día 7.

Análisis de la transcripción por ARN naciente de FISH<em&gt; En Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes o<em&gt; In Vitro</em&gt; Los cultivos a corto plazo de Ectoplacental Cono explantes

Aquí, se presenta un protocolo para la disección de cordón umbilical humano umbilical (CU) y la muestra de placenta fetal en cable de forro (CL), gelatina de Wharton (WJ), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP) para el aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales (MSCs) utilizando la técnica de cultivo de explantes.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

Aquí, presentamos un protocolo para generar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando la proteína morfogénica ósea 4 e inhibidores de las vías Activina/Nodal. Este método es adecuado para la diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas y puede generar grandes cantidades de células para la manipulación genética.

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

Presentamos es un protocolo para el muestreo de tejido velloso placentario humano seguido por el aislamiento de citotrofoblastos para el cultivo celular primario. Tratamiento de trofoblastos con TNFα recapitula la inflamación en el ambiente intrauterino obeso y facilita el descubrimiento de dianas moleculares regulados por inflamación en placentas con obesidad materna.

Un modelo de trofoblasto humano primario para estudiar el efecto de la inflamación asociado con obesidad materna sobre la regulación de la autofagia en la Placenta

Este estudio presenta un protocolo para el tejido reversible claro, immunostaining, renderizado 3D y análisis de redes vasculares en las muestras de vellosidades de la placenta humana del orden de 1-2 mm3.

Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

Este protocolo muestra un método para el aislamiento de las células decidual humanas primarias recogidas de las membranas fetales de la placenta de término que puede ser utilizada para una variedad de aplicaciones (es decir, inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc.) con el objetivo de para estudiar el papel de diferentes poblaciones celulares en complicaciones del embarazo.

Aislamiento de células Decidual humanas primarias de las membranas fetales de la placenta de término

Aquí, presentamos un protocolo altamente accesible para evaluar el movimiento de la célula en células de trofoblasto humano mediante tres ensayos in vitro: el ensayo de rayado, el ensayo de invasión transwell y el ensayo de proliferación celular.

En los ensayos de Vitro para evaluar la migración, invasión y proliferación de las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre

El presente protocolo permite la recuperación de estructuras en forma de tubo formadas en el ensayo clásico de formación de tubos de angiogénesis in vitro , donde las células, como las células trofoblásticas, se organizan en estructuras similares a capilares sobre una capa de matriz de membrana basal extracelular. Las estructuras recuperadas se utilizan para el aislamiento de ARN y proteínas para diversos análisis bioquímicos.

Ensayo de recuperación de células trofoblásticas de angiogénesis y formación de tubos para el análisis de la expresión de marcadores de diferenciación

Este protocolo permite la purificación, caracterización y cultivo de trofoblastos extravillosos primarios de HLA-G+ (EVT) de la decidua basal y la membrana coriónica de placentas humanas a término. Los cultivos primarios de EVT mantienen la viabilidad durante 96 horas, permitiendo el cocultivo con células inmunitarias maternas emparejadas por muestras y el posterior análisis citométrico y molecular de flujo de sus interacciones.

Purificación de trofoblastos extravillosos HLA-G+ de tejidos placentarios humanos para fenotipado y análisis funcional

Aprende a transfectar siRNA mediante microporación en citotrofoblastos vellosos humanos recién aislados y a realizar EMSA para estudiar interacciones ADN-proteína en biología de la placenta.

Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos

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