Name: Generación de mutantes sin marcadores marcados y en el modelo de especies de cianobacterias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprende a generar mutantes sin marcadores en Synechocystis sp. PCC6803 y mutantes marcados en Synechococcus sp. PCC7002 mediante manipulación genética repetida. Este método facilita la introducción de alteraciones cromosómicas múltiples en cianobacterias.

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<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los pasos más importantes en la generación de mutantes no marcados son: 1) Diseño de plásmido cuidado para asegurar que sólo se altera la región objetivo; 2) garantizar que las muestras permanezcan axénicos, especialmente cuando se cultivan en sacarosa; 3) placas células de marcado generación mutante transformada inicialmente en placas de agar BG11 que carecen de antibióticos, seguido de la adición de agar más antibióticos 24 horas más tarde; 4) cultivar marcado mutantes para 4 días completos antes de la siembra en plac...

Las cianobacterias son un phylum antigua y diversa evolutivamente de bacterias que se encuentran en casi todos los medio natural en la Tierra. En los ecosistemas marinos son particularmente abundantes y juegan un papel clave en muchos ciclos de nutrientes, lo que representa aproximadamente la mitad de la fijación de carbono 1, la mayoría de la fijación de nitrógeno 2 y cientos de millones de toneladas de producción de hidrocarburos 3 en los océanos anualmente. Cloroplastos, el orgánulo responsable de la fotosíntesis de las algas y las plantas eucariota, es probable que hayan evolucionado a partir de una cianobacteria que fue engullido por un organismo huésped 4. Las cianobacterias han demostrado organismos modelo útil para el estudio de la fotosíntesis, transporte de electrones y 5 vías bioquímicas, muchos de los cuales se conservan en las plantas. Además cianobacterias cada vez se utilizan para la producción de alimentos, los biocombustibles 6, 7 y electricidad compuestos industriales 8, debido a su altaghly conversión eficiente del agua y CO 2 a la biomasa utilizando la energía solar 9. Muchas especies pueden cultivarse en tierras no cultivables con nutrientes mínimos y el agua de mar, lo que sugiere que las cianobacterias potencialmente podrían ser crecido a gran escala sin afectar la producción agrícola. Ciertas especies son también fuentes de productos naturales, incluidos los compuestos antifúngicos, antibacterianos y anti-cáncer 10,11. La capacidad de generar mutantes es clave para entender la fotosíntesis de cianobacterias, bioquímica y fisiología, y esencial para el desarrollo de cepas con fines industriales. La mayoría de los estudios publicados generate modificado genéticamente cepas mediante la inserción de un casete de resistencia a los antibióticos en el sitio de interés. Esto limita el número de mutaciones que pueden introducirse en una cepa, como sólo unos casetes de resistencia a antibióticos están disponibles para su uso en cianobacterias. Las cepas que contienen los genes que confieren re antibióticoresistencia no puede ser utilizado para la producción industrial en estanques abiertos, lo que es probable que sea el único medio rentables para la producción de biocombustibles y otros productos de bajo valor 12. La generación de mutantes no marcados supera estas limitaciones. mutantes no marcados no contienen ADN extraño, excepto si se incluye intencionalmente, y se pueden manipular varias veces. Por lo tanto es posible generar tantas alteraciones en una cepa como se desee. Además, los efectos polares de genes aguas abajo del sitio de modificación pueden minimizarse, lo que permite la modificación más preciso del organismo 13. Para generar cepas mutantes, plásmidos suicidas que contienen dos fragmentos de ADN idéntica a las regiones en el cromosoma de cianobacterias que flanquean el gen a eliminar (denominado el 5 &#39;y 3&#39; flanqueantes) se construyó primero. Dos genes se insertan entonces entre estas regiones flanqueantes. Uno de ellos codifica una proteína de resistencia a los antibióticos; la segunda codifica SacB, que produces levansucrasa, un compuesto que confiere sensibilidad a la sacarosa. En la primera etapa del proceso, los mutantes marcados, es decir, las cepas que contienen algo de ADN externa, se generan. La construcción de plásmido se mezcla con las células de cianobacterias y el ADN se recogió de forma natural por el organismo. Los transformantes se seleccionaron por crecimiento en placas de agar que contienen el antibiótico apropiado y el genotipo mutante verificada por PCR. plásmidos suicidas no pueden replicarse dentro de la cepa de interés. Por lo tanto cualquier colonias resistentes a los antibióticos serán el resultado de un evento de recombinación mediante el cual el gen de interés en insertado en el cromosoma. Para generar mutantes no marcados, el mutante marcada se mezcla a continuación con un segundo plásmido suicida que contiene sólo las regiones flanqueantes 5 &#39;y 3&#39;. Sin embargo, si se requiere la inserción de ADN extraño, un plásmido que consiste en el 5 &#39;y 3&#39; que flanquean las regiones con un casete que contiene los genes de interés insertado entre estos fragmentos de ADN, se puede utilizar. selección es a través del crecimiento en placas de agar que contienen sacarosa. Como la sacarosa es letal para las células cuando se expresa el producto del gen sacB, las únicas células que sobreviven son aquellos en los que se ha producido un segundo suceso de recombinación, con lo cual el gen de sensibilidad sacarosa, además de el gen de resistencia a los antibióticos, se ha recombinado de la cromosoma y en el plásmido. Como consecuencia del intercambio de recombinación, las regiones flanqueantes y cualquier ADN entre ellos se insertan en el cromosoma. Hemos utilizado con éxito estos métodos para generar múltiples mutaciones cromosómicas en la misma cepa de Synechocystis sp. PCC6803 (en adelante como Synechocystis) 13,14, para introducir mutaciones puntuales en un gen de interés y 13 para la expresión de cassettes de genes. Mientras que la generación de knockouts sin marcar se ha demostrado con anterioridad a nuestro trabajo en Synechocystis 15,16, un método detallado, con la ayuda deuna presentación visual de los pasos críticos, no está disponible públicamente. También hemos aplicado el mismo método para la generación de knockouts marcadas en otro modelo de cianobacteria, Synechococcus sp. PCC7002 (en lo sucesivo, Synechococcus). Este protocolo proporciona un método claro y sencillo para la generación de mutantes y un protocolo rápido para la validación y almacenamiento de estas cepas.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de amonio férrico</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>cianocobalamina</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td>Placa</tr> de <tr><td>Petri 90 mm triple ventilada</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0.2 y micro; m filtros</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>matraces cónicos de 100 ml</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad&nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de ADN&nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasas de restricción</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ligasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Caldo Bertani</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml tubo de fondo redondo</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi ADN polimerasa</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &micro; m perlas de vidrio</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Bombillas fluorescentes</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT fotobiorreactor multitron</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación de mutantes sin marcadores marcados y en el modelo de especies de cianobacterias

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Las cianobacterias son organismos ecológicamente importantes y plataformas potenciales para la producción de biocombustibles y productos industriales útiles. La manipulación genética de cianobacterias, especialmente de organismos modelo como Synechocystis sp. PCC6803 y Synechococcus sp. PCC7002, es una herramienta clave tanto para la investigación básica como para la aplicada. La generación de mutantes no marcados, mediante la cual se introducen alteraciones cromosómicas en una cepa mediante la inserción de un casete de resistencia a antibióticos (un fragmento manipulable de ADN que contiene uno o más genes), seguido de la posterior extracción de este casete utilizando un marcador seleccionable negativo, es una técnica particularmente poderosa. Los mutantes no marcados pueden ser manipulados genéticamente repetidamente, lo que permite introducir tantas alteraciones en una cepa como se desee. Además, es deseable la ausencia de genes que codifican proteínas de resistencia a los antibióticos en la cepa mutada, ya que evita la posibilidad de "escape" de organismos resistentes a los antibióticos en el medio ambiente. Sin embargo, los métodos detallados para rondas repetidas de manipulación genética de cianobacterias no están bien descritos en la literatura científica. Aquí proporcionamos una descripción completa de esta técnica, que hemos utilizado con éxito para generar mutantes con múltiples deleciones, mutaciones de un solo punto dentro de un gen de interés e inserción de nuevos casetes de genes.

Diseño plásmido es crítica para la generación exitosa de ambos mutantes marcados y sin marcar. Figura 1 da un ejemplo del plásmido A y B utiliza para generar un mutante de deleción en los genes Synechocystis cpcC1 y cpcC2 13. En cada caso, las regiones flanqueantes 5 &#39;y 3&#39; son de aproximadamente 900-1.000 pb. regiones que flanquean reducidos se pueden utilizar aunque el más pequeño que hemos ensayado con éxito ha sido de apro...

La introducción de múltiples alteraciones genómicas en las cianobacterias es una herramienta esencial en el desarrollo de cepas con fines industriales y de investigación básica. Describimos un sistema para generar mutantes no marcados en la especie cianobacteriana modelo Synechocystis sp. PCC6803 y mutantes marcados en Synechococcus sp. PCC7002.

Generación de mutantes sin marcadores marcados y en el modelo de especies de cianobacterias

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un sistema para generar mutantes no marcados en las especies cianobacterianas de Synechocystis PCC6803 y mutantes marcados en las especies de Synechococcus PCC7002. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética cianobacteriana. Por ejemplo, cómo introducir alteraciones cromosómicas en una cepa.Mediante la inserción de un gen de resistencia a antibióticos, seguida de una posterior extracción de este casete, utilizando un marcador negativo seleccionable. La principal ventaja de esta técnica es que las cepas pueden ser manipuladas genéticamente de forma repetida. Permitiendo introducir tantas alternancias en una cepa como se desee.Después de preparar los medios, cepas de cianobacterias y plásmidos, de acuerdo con el protocolo de texto. Establezca un cultivo fresco inoculando un circuito lleno de células cianobacterianas, en 30 a 50 mililitros de medio BG11. Cultive el cultivo a la luz a 30 grados centígrados durante dos o tres días, hasta un OD7500, igual a 0,2 a 0,6.Después de la incubación, centrifugar uno o dos mililitros del cultivo a 2.300 g durante cinco minutos. Luego, después de desechar el sobrenadante, use el medio BG11 para lavar los gránulos una vez, pipeteando suavemente para resuspender las células. Ya que el vórtice puede resultar en la pérdida de pili, que son esenciales para la absorción del ADN.Después de peletizar las células nuevamente y eliminar el sobrenadante, agregue el medio BG11 hasta un volumen final de 100 microlitros y transfiera las células a un tubo de fondo redondo de 14 mililitros. A continuación, agregue 1 microgramo de plásmido A preparado previamente a las células. Y golpee suavemente para mezclar.A continuación, coloque los tubos horizontalmente en la incubadora a 30 grados centígrados e incube durante cuatro a seis horas. Después de la incubación, extienda alícuotas de la mezcla de ADN plasmídico de cultivo celular en placas de agar BG11 sin antibióticos. E incubar a 30 grados centígrados.Aproximadamente 24 horas después, prepare una solución de agar al 0,6%, en agua que contenga kanamicina. Y deje que se enfríe a 42 grados centígrados. A continuación, añada de 2,5 a tres mililitros a los bordes de las placas de cultivo e incline la placa, de modo que la solución forme una capa superior uniforme de agar en la superficie.Incubar las placas aproximadamente siete días para que las colonias sean visibles. A continuación, divida una placa fresca de agar BG11 más kanamicina en seis sectores. Y use un palillo de dientes de extremo romo para rayar colonias individuales.Para llevar a cabo la PCR, para confirmar el knockout marcado, transfiera una pequeña cantidad de células a un tubo que contenga 50 microlitros de agua y aproximadamente 20 perlas de vidrio de 425 a 600 micrómetros. Agite las celdas y las cuentas a aproximadamente 2.000 rpm durante cinco minutos, antes de girar a 15.700 g durante cinco minutos. A continuación, utilice cinco microlitros del sobrenadante para preparar reacciones de PCR de 50 microlitros con preliminares de ADN.Para validar los mutantes, después de diseñar los cebadores de acuerdo con el protocolo de texto, amplificar el producto utilizando el siguiente programa, e incluir un control de tipo salvaje. A través de gelelektroforeses, verifique el genotipo de los transformantes knockout. Mostrando una banda de aproximadamente cuatro pares de kilobases y careciendo de la banda de tipo salvaje.Consulte el protocolo de texto para obtener más detalles. Si todavía hay una banda de tipo salvaje, vuelva a rayar la cepa en el plato nuevo y repita la PCR. Repita el proceso de validación hasta que se segregue el mutante y no se observe ninguna banda de tipo salvaje en la reacción de PCR.En el caso de una cepa que muestre un perfil mutante marcado, vuelva a colocar un rayado en una placa nueva para usarla en la generación de un nocaut sin marcar. Para generar mutantes de Synechocystis no marcados, se establece un nuevo cultivo del knockout marcado inoculando el bucle lleno de células en 30 a 50 mililitros de medio BG11. Cultive el cultivo durante dos o tres días hasta OD750, igual a 0,2 a 0,6.Centrifugar 10 mililitros del cultivo a 2.300 g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. A continuación, utilice el medio BG11 para lavar suavemente las células. Después de agregar BG11 a un volumen final de 200 microlitros y transferir las células a un tubo de fondo redondo de 14 mililitros, agregue 1 microgramo de ADN plasmídico B a las células y golpee suavemente para mezclar.A continuación, coloque los tubos horizontalmente en la incubadora e incube durante cuatro a seis horas. Después de la incubación, agregue 1,8 mililitros de medio BG11 e incube las muestras durante un total de cuatro días con agitación. Este es un tiempo suficiente para permitir que ocurra la recombinación en las copias cromosómicas múltiples.Coloque 50, 10 y 1 microlitro de alícuotas del cultivo transformado en placas de agar BG11 más 5% de sacarosa e incube durante aproximadamente siete días para generar colonias individuales. A continuación, con un palillo de dientes de extremo romo, eclosione de 30 a 50 colonias individuales en placas BG11 más kanamicina. A continuación, coloque en BG11 más 5% de sacarosa.Las colonias que crecen con BG11 más sacarosa, pero no en placas con kanamicina, son posibles knockouts no marcados. Es probable que las colonias que crecen en ambas placas sean resistentes a la sacarosa debido a una mutación en el gen sacB. Siguiendo el método de PCR, demostrado anteriormente en este video, verifique los knockouts no marcados, lo que producirá una banda de gel correspondiente al tamaño del tipo salvaje menos la región eliminada.Si la cepa muestra un perfil mutante no marcado, vuelva a trazarla en agar BG11 fresco sin antibióticos. Para almacenar las cepas a largo plazo, establezca un cultivo fresco de la cepa inoculando un circuito lleno de células en 30 a 50 mililitros de medio BG11. Cultive el cultivo durante tres o cuatro días hasta que OD750 sea igual a 0,4 a 0,7.Después de usar BG11 para lavar las células una vez, vuelva a suspender el pellet en aproximadamente dos mililitros de BG11. Agregue 0,8 mililitros de las células concentradas a un tubo. A continuación, añada 0,2 mililitros de glicerol esterilizado al 80%filtrante.A otro tubo, agregue 0,93 mililitros de células concentradas y 0,07 mililitros de DMSO. Guarde ambos tubos a menos 80 grados centígrados. Para revivir las cepas, retire el tubo y use un palillo de dientes de extremo romo para raspar algunas células en una placa de agar sin antibióticos.Luego use un lazo estéril para rayar como de costumbre. Esta figura muestra ejemplos de plásmidos A y B utilizados para generar mutantes de deleción. En cada caso, las cinco regiones de tablones primarios y tres primarios tienen aproximadamente entre 900 y 1.000 pares de bases.El plásmido B, también puede contener un casete de genes entre las cinco regiones flanqueantes de los cinco primos y los tres primos de aproximadamente una kilobase. O una versión modificada de la secuencia de genes nativos. Tras la transformación con el plásmido A, aparecerán varios cientos de colonias en una placa después de siete a 10 días.Si los genes no son esenciales y los mutantes muestran crecimiento, similar a la cepa de tipo salvaje, entonces todos los cromosomas deben contener una copia de la secuencia insertada npt1/sacB, según se determine mediante PCR. Si los genes no son esenciales, y los mutantes crecen lentamente, entonces son necesarias varias rondas de re-streaking con concentraciones crecientes de kanamicina para obtener un mutante marcado segregado. Si al volver a rayar no se obtiene un mutante marcado, es probable que el gen sea esencial para la supervivencia.La mayoría de las colonias individuales, obtenidas por transformación con plásmido B, serán sensibles a la kanamicina y resistentes a la sacarosa. Como se ha demostrado aquí, la amplificación por PCR de la región diana en estas colonias, muestra que casi el 100% del perfil mutante no marcado. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en horas durante un período de seis semanas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar una técnica estéril. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la medición de la producción de oxígeno o la cromatografía de gases, para responder a preguntas adicionales, como la medición de las tasas fotosintéticas o la producción de metabolitos. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino a los investigadores en el campo de la genética de cianobacterias.Explorar los procesos bioquímicos y fisiológicos clave en este filo, y las cepas de desarrollo con fines industriales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar knockouts no marcados en las especies de Synechococcus PCC6803.

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Investigación

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