Generación de mutantes sin marcadores marcados y en el modelo de especies de cianobacterias

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un sistema para generar mutantes no marcados en las especies cianobacterianas de Synechocystis PCC6803 y mutantes marcados en las especies de Synechococcus PCC7002. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética cianobacteriana. Por ejemplo, cómo introducir alteraciones cromosómicas en una cepa.

Mediante la inserción de un gen de resistencia a antibióticos, seguida de una posterior extracción de este casete, utilizando un marcador negativo seleccionable. La principal ventaja de esta técnica es que las cepas pueden ser manipuladas genéticamente de forma repetida. Permitiendo introducir tantas alternancias en una cepa como se desee.

Después de preparar los medios, cepas de cianobacterias y plásmidos, de acuerdo con el protocolo de texto. Establezca un cultivo fresco inoculando un circuito lleno de células cianobacterianas, en 30 a 50 mililitros de medio BG11. Cultive el cultivo a la luz a 30 grados centígrados durante dos o tres días, hasta un OD7500, igual a 0,2 a 0,6.

Después de la incubación, centrifugar uno o dos mililitros del cultivo a 2.300 g durante cinco minutos. Luego, después de desechar el sobrenadante, use el medio BG11 para lavar los gránulos una vez, pipeteando suavemente para resuspender las células. Ya que el vórtice puede resultar en la pérdida de pili, que son esenciales para la absorción del ADN.

Después de peletizar las células nuevamente y eliminar el sobrenadante, agregue el medio BG11 hasta un volumen final de 100 microlitros y transfiera las células a un tubo de fondo redondo de 14 mililitros. A continuación, agregue 1 microgramo de plásmido A preparado previamente a las células. Y golpee suavemente para mezclar.

A continuación, coloque los tubos horizontalmente en la incubadora a 30 grados centígrados e incube durante cuatro a seis horas. Después de la incubación, extienda alícuotas de la mezcla de ADN plasmídico de cultivo celular en placas de agar BG11 sin antibióticos. E incubar a 30 grados centígrados.

Aproximadamente 24 horas después, prepare una solución de agar al 0,6%, en agua que contenga kanamicina. Y deje que se enfríe a 42 grados centígrados. A continuación, añada de 2,5 a tres mililitros a los bordes de las placas de cultivo e incline la placa, de modo que la solución forme una capa superior uniforme de agar en la superficie.

Incubar las placas aproximadamente siete días para que las colonias sean visibles. A continuación, divida una placa fresca de agar BG11 más kanamicina en seis sectores. Y use un palillo de dientes de extremo romo para rayar colonias individuales.

Para llevar a cabo la PCR, para confirmar el knockout marcado, transfiera una pequeña cantidad de células a un tubo que contenga 50 microlitros de agua y aproximadamente 20 perlas de vidrio de 425 a 600 micrómetros. Agite las celdas y las cuentas a aproximadamente 2.000 rpm durante cinco minutos, antes de girar a 15.700 g durante cinco minutos. A continuación, utilice cinco microlitros del sobrenadante para preparar reacciones de PCR de 50 microlitros con preliminares de ADN.

Para validar los mutantes, después de diseñar los cebadores de acuerdo con el protocolo de texto, amplificar el producto utilizando el siguiente programa, e incluir un control de tipo salvaje. A través de gelelektroforeses, verifique el genotipo de los transformantes knockout. Mostrando una banda de aproximadamente cuatro pares de kilobases y careciendo de la banda de tipo salvaje.

Consulte el protocolo de texto para obtener más detalles. Si todavía hay una banda de tipo salvaje, vuelva a rayar la cepa en el plato nuevo y repita la PCR. Repita el proceso de validación hasta que se segregue el mutante y no se observe ninguna banda de tipo salvaje en la reacción de PCR.

En el caso de una cepa que muestre un perfil mutante marcado, vuelva a colocar un rayado en una placa nueva para usarla en la generación de un nocaut sin marcar. Para generar mutantes de Synechocystis no marcados, se establece un nuevo cultivo del knockout marcado inoculando el bucle lleno de células en 30 a 50 mililitros de medio BG11. Cultive el cultivo durante dos o tres días hasta OD750, igual a 0,2 a 0,6.

Centrifugar 10 mililitros del cultivo a 2.300 g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. A continuación, utilice el medio BG11 para lavar suavemente las células. Después de agregar BG11 a un volumen final de 200 microlitros y transferir las células a un tubo de fondo redondo de 14 mililitros, agregue 1 microgramo de ADN plasmídico B a las células y golpee suavemente para mezclar.

A continuación, coloque los tubos horizontalmente en la incubadora e incube durante cuatro a seis horas. Después de la incubación, agregue 1,8 mililitros de medio BG11 e incube las muestras durante un total de cuatro días con agitación. Este es un tiempo suficiente para permitir que ocurra la recombinación en las copias cromosómicas múltiples.

Coloque 50, 10 y 1 microlitro de alícuotas del cultivo transformado en placas de agar BG11 más 5% de sacarosa e incube durante aproximadamente siete días para generar colonias individuales. A continuación, con un palillo de dientes de extremo romo, eclosione de 30 a 50 colonias individuales en placas BG11 más kanamicina. A continuación, coloque en BG11 más 5% de sacarosa.

Las colonias que crecen con BG11 más sacarosa, pero no en placas con kanamicina, son posibles knockouts no marcados. Es probable que las colonias que crecen en ambas placas sean resistentes a la sacarosa debido a una mutación en el gen sacB. Siguiendo el método de PCR, demostrado anteriormente en este video, verifique los knockouts no marcados, lo que producirá una banda de gel correspondiente al tamaño del tipo salvaje menos la región eliminada.

Si la cepa muestra un perfil mutante no marcado, vuelva a trazarla en agar BG11 fresco sin antibióticos. Para almacenar las cepas a largo plazo, establezca un cultivo fresco de la cepa inoculando un circuito lleno de células en 30 a 50 mililitros de medio BG11. Cultive el cultivo durante tres o cuatro días hasta que OD750 sea igual a 0,4 a 0,7.

Después de usar BG11 para lavar las células una vez, vuelva a suspender el pellet en aproximadamente dos mililitros de BG11. Agregue 0,8 mililitros de las células concentradas a un tubo. A continuación, añada 0,2 mililitros de glicerol esterilizado al 80%filtrante.

A otro tubo, agregue 0,93 mililitros de células concentradas y 0,07 mililitros de DMSO. Guarde ambos tubos a menos 80 grados centígrados. Para revivir las cepas, retire el tubo y use un palillo de dientes de extremo romo para raspar algunas células en una placa de agar sin antibióticos.

Luego use un lazo estéril para rayar como de costumbre. Esta figura muestra ejemplos de plásmidos A y B utilizados para generar mutantes de deleción. En cada caso, las cinco regiones de tablones primarios y tres primarios tienen aproximadamente entre 900 y 1.000 pares de bases.

El plásmido B, también puede contener un casete de genes entre las cinco regiones flanqueantes de los cinco primos y los tres primos de aproximadamente una kilobase. O una versión modificada de la secuencia de genes nativos. Tras la transformación con el plásmido A, aparecerán varios cientos de colonias en una placa después de siete a 10 días.

Si los genes no son esenciales y los mutantes muestran crecimiento, similar a la cepa de tipo salvaje, entonces todos los cromosomas deben contener una copia de la secuencia insertada npt1/sacB, según se determine mediante PCR. Si los genes no son esenciales, y los mutantes crecen lentamente, entonces son necesarias varias rondas de re-streaking con concentraciones crecientes de kanamicina para obtener un mutante marcado segregado. Si al volver a rayar no se obtiene un mutante marcado, es probable que el gen sea esencial para la supervivencia.

La mayoría de las colonias individuales, obtenidas por transformación con plásmido B, serán sensibles a la kanamicina y resistentes a la sacarosa. Como se ha demostrado aquí, la amplificación por PCR de la región diana en estas colonias, muestra que casi el 100% del perfil mutante no marcado. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en horas durante un período de seis semanas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar una técnica estéril. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la medición de la producción de oxígeno o la cromatografía de gases, para responder a preguntas adicionales, como la medición de las tasas fotosintéticas o la producción de metabolitos. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino a los investigadores en el campo de la genética de cianobacterias.

Explorar los procesos bioquímicos y fisiológicos clave en este filo, y las cepas de desarrollo con fines industriales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar knockouts no marcados en las especies de Synechococcus PCC6803.