Name: Generación de mutantes sin marcadores marcados y en el modelo de especies de cianobacterias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprende a generar mutantes sin marcadores en Synechocystis sp. PCC6803 y mutantes marcados en Synechococcus sp. PCC7002 mediante manipulación genética repetida. Este método facilita la introducción de alteraciones cromosómicas múltiples en cianobacterias.

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<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los pasos más importantes en la generación de mutantes no marcados son: 1) Diseño de plásmido cuidado para asegurar que sólo se altera la región objetivo; 2) garantizar que las muestras permanezcan axénicos, especialmente cuando se cultivan en sacarosa; 3) placas células de marcado generación mutante transformada inicialmente en placas de agar BG11 que carecen de antibióticos, seguido de la adición de agar más antibióticos 24 horas más tarde; 4) cultivar marcado mutantes para 4 días completos antes de la siembra en plac...

Las cianobacterias son un phylum antigua y diversa evolutivamente de bacterias que se encuentran en casi todos los medio natural en la Tierra. En los ecosistemas marinos son particularmente abundantes y juegan un papel clave en muchos ciclos de nutrientes, lo que representa aproximadamente la mitad de la fijación de carbono 1, la mayoría de la fijación de nitrógeno 2 y cientos de millones de toneladas de producción de hidrocarburos 3 en los océanos anualmente. Cloroplastos, el orgánulo responsable de la fotosíntesis de las algas y las plantas eucariota, es probable que hayan evolucionado a partir de una cianobacteria que fue engullido por un organismo huésped 4. Las cianobacterias han demostrado organismos modelo útil para el estudio de la fotosíntesis, transporte de electrones y 5 vías bioquímicas, muchos de los cuales se conservan en las plantas. Además cianobacterias cada vez se utilizan para la producción de alimentos, los biocombustibles 6, 7 y electricidad compuestos industriales 8, debido a su altaghly conversión eficiente del agua y CO 2 a la biomasa utilizando la energía solar 9. Muchas especies pueden cultivarse en tierras no cultivables con nutrientes mínimos y el agua de mar, lo que sugiere que las cianobacterias potencialmente podrían ser crecido a gran escala sin afectar la producción agrícola. Ciertas especies son también fuentes de productos naturales, incluidos los compuestos antifúngicos, antibacterianos y anti-cáncer 10,11. La capacidad de generar mutantes es clave para entender la fotosíntesis de cianobacterias, bioquímica y fisiología, y esencial para el desarrollo de cepas con fines industriales. La mayoría de los estudios publicados generate modificado genéticamente cepas mediante la inserción de un casete de resistencia a los antibióticos en el sitio de interés. Esto limita el número de mutaciones que pueden introducirse en una cepa, como sólo unos casetes de resistencia a antibióticos están disponibles para su uso en cianobacterias. Las cepas que contienen los genes que confieren re antibióticoresistencia no puede ser utilizado para la producción industrial en estanques abiertos, lo que es probable que sea el único medio rentables para la producción de biocombustibles y otros productos de bajo valor 12. La generación de mutantes no marcados supera estas limitaciones. mutantes no marcados no contienen ADN extraño, excepto si se incluye intencionalmente, y se pueden manipular varias veces. Por lo tanto es posible generar tantas alteraciones en una cepa como se desee. Además, los efectos polares de genes aguas abajo del sitio de modificación pueden minimizarse, lo que permite la modificación más preciso del organismo 13. Para generar cepas mutantes, plásmidos suicidas que contienen dos fragmentos de ADN idéntica a las regiones en el cromosoma de cianobacterias que flanquean el gen a eliminar (denominado el 5 &#39;y 3&#39; flanqueantes) se construyó primero. Dos genes se insertan entonces entre estas regiones flanqueantes. Uno de ellos codifica una proteína de resistencia a los antibióticos; la segunda codifica SacB, que produces levansucrasa, un compuesto que confiere sensibilidad a la sacarosa. En la primera etapa del proceso, los mutantes marcados, es decir, las cepas que contienen algo de ADN externa, se generan. La construcción de plásmido se mezcla con las células de cianobacterias y el ADN se recogió de forma natural por el organismo. Los transformantes se seleccionaron por crecimiento en placas de agar que contienen el antibiótico apropiado y el genotipo mutante verificada por PCR. plásmidos suicidas no pueden replicarse dentro de la cepa de interés. Por lo tanto cualquier colonias resistentes a los antibióticos serán el resultado de un evento de recombinación mediante el cual el gen de interés en insertado en el cromosoma. Para generar mutantes no marcados, el mutante marcada se mezcla a continuación con un segundo plásmido suicida que contiene sólo las regiones flanqueantes 5 &#39;y 3&#39;. Sin embargo, si se requiere la inserción de ADN extraño, un plásmido que consiste en el 5 &#39;y 3&#39; que flanquean las regiones con un casete que contiene los genes de interés insertado entre estos fragmentos de ADN, se puede utilizar. selección es a través del crecimiento en placas de agar que contienen sacarosa. Como la sacarosa es letal para las células cuando se expresa el producto del gen sacB, las únicas células que sobreviven son aquellos en los que se ha producido un segundo suceso de recombinación, con lo cual el gen de sensibilidad sacarosa, además de el gen de resistencia a los antibióticos, se ha recombinado de la cromosoma y en el plásmido. Como consecuencia del intercambio de recombinación, las regiones flanqueantes y cualquier ADN entre ellos se insertan en el cromosoma. Hemos utilizado con éxito estos métodos para generar múltiples mutaciones cromosómicas en la misma cepa de Synechocystis sp. PCC6803 (en adelante como Synechocystis) 13,14, para introducir mutaciones puntuales en un gen de interés y 13 para la expresión de cassettes de genes. Mientras que la generación de knockouts sin marcar se ha demostrado con anterioridad a nuestro trabajo en Synechocystis 15,16, un método detallado, con la ayuda deuna presentación visual de los pasos críticos, no está disponible públicamente. También hemos aplicado el mismo método para la generación de knockouts marcadas en otro modelo de cianobacteria, Synechococcus sp. PCC7002 (en lo sucesivo, Synechococcus). Este protocolo proporciona un método claro y sencillo para la generación de mutantes y un protocolo rápido para la validación y almacenamiento de estas cepas.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de amonio férrico</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>cianocobalamina</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td>Placa</tr> de <tr><td>Petri 90 mm triple ventilada</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0.2 y micro; m filtros</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>matraces cónicos de 100 ml</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad&nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de ADN&nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleasas de restricción</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ligasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Caldo Bertani</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml tubo de fondo redondo</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi ADN polimerasa</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &micro; m perlas de vidrio</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Bombillas fluorescentes</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT fotobiorreactor multitron</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación de mutantes sin marcadores marcados y en el modelo de especies de cianobacterias

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Las cianobacterias son organismos ecológicamente importantes y plataformas potenciales para la producción de biocombustibles y productos industriales útiles. La manipulación genética de cianobacterias, especialmente de organismos modelo como Synechocystis sp. PCC6803 y Synechococcus sp. PCC7002, es una herramienta clave tanto para la investigación básica como para la aplicada. La generación de mutantes no marcados, mediante la cual se introducen alteraciones cromosómicas en una cepa mediante la inserción de un casete de resistencia a antibióticos (un fragmento manipulable de ADN que contiene uno o más genes), seguido de la posterior extracción de este casete utilizando un marcador seleccionable negativo, es una técnica particularmente poderosa. Los mutantes no marcados pueden ser manipulados genéticamente repetidamente, lo que permite introducir tantas alteraciones en una cepa como se desee. Además, es deseable la ausencia de genes que codifican proteínas de resistencia a los antibióticos en la cepa mutada, ya que evita la posibilidad de "escape" de organismos resistentes a los antibióticos en el medio ambiente. Sin embargo, los métodos detallados para rondas repetidas de manipulación genética de cianobacterias no están bien descritos en la literatura científica. Aquí proporcionamos una descripción completa de esta técnica, que hemos utilizado con éxito para generar mutantes con múltiples deleciones, mutaciones de un solo punto dentro de un gen de interés e inserción de nuevos casetes de genes.

Diseño plásmido es crítica para la generación exitosa de ambos mutantes marcados y sin marcar. Figura 1 da un ejemplo del plásmido A y B utiliza para generar un mutante de deleción en los genes Synechocystis cpcC1 y cpcC2 13. En cada caso, las regiones flanqueantes 5 &#39;y 3&#39; son de aproximadamente 900-1.000 pb. regiones que flanquean reducidos se pueden utilizar aunque el más pequeño que hemos ensayado con éxito ha sido de apro...

La introducción de múltiples alteraciones genómicas en las cianobacterias es una herramienta esencial en el desarrollo de cepas con fines industriales y de investigación básica. Describimos un sistema para generar mutantes no marcados en la especie cianobacteriana modelo Synechocystis sp. PCC6803 y mutantes marcados en Synechococcus sp. PCC7002.

Generación de mutantes sin marcadores marcados y en el modelo de especies de cianobacterias

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un sistema para generar mutantes no marcados en las especies cianobacterianas de Synechocystis PCC6803 y mutantes marcados en las especies de Synechococcus PCC7002. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética cianobacteriana. Por ejemplo, cómo introducir alteraciones cromosómicas en una cepa.Mediante la inserción de un gen de resistencia a antibióticos, seguida de una posterior extracción de este casete, utilizando un marcador negativo seleccionable. La principal ventaja de esta técnica es que las cepas pueden ser manipuladas genéticamente de forma repetida. Permitiendo introducir tantas alternancias en una cepa como se desee.Después de preparar los medios, cepas de cianobacterias y plásmidos, de acuerdo con el protocolo de texto. Establezca un cultivo fresco inoculando un circuito lleno de células cianobacterianas, en 30 a 50 mililitros de medio BG11. Cultive el cultivo a la luz a 30 grados centígrados durante dos o tres días, hasta un OD7500, igual a 0,2 a 0,6.Después de la incubación, centrifugar uno o dos mililitros del cultivo a 2.300 g durante cinco minutos. Luego, después de desechar e

generation-marked-markerless-mutants-model-cyanobacterial

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Weber, N., et al., Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la cianobacteria filamentosa Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Este video describe un procedimiento para realizar una transformación natural en cianobacterias filamentosas utilizando ADN plasmídico para lograr una expresión estable de GFP y resistencia a los antibióticos a través de la recombinación homóloga.

Transformación natural y expresión de GFP en la cianobacteria filamentosa Phormidium lacuna

Fuente: Lea-Smith, D. J., et al. Generación de mutantes marcados y sin marcadores en especies de cianobacterias modelo. J. Vis. Exp. (2016)El video demuestra un método para generar mutantes marcados con antibióticos en cianobacterias. El protocolo comienza con el cultivo de cianobacterias, seguido de pasos de centrifugación y lavado que preservan la superficie pili. Luego se introduce un plásmido portador de un gen de resistencia a los antibióticos flanqueado por secuencias homólogas. Durante...

Generación de mutantes marcados con antibióticos en cianobacterias mediante recombinación homóloga

Los mutantes letales sensibles a la temperatura (ts) son herramientas valiosas para identificar y analizar funciones esenciales. Aquí describimos métodos para generar y clasificar mutantes letales ts en alto rendimiento.

De alto rendimiento de aislamiento robótica asistida sensible a la temperatura del letal mutantes en<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Aquí presentamos protocolos para noveles investigadores para iniciar phenotyping del farmacológicamente importante Género bacteriano Streptomyces.

Evaluación visual y microscópica de mutantes desarrollo de Streptomyces

Aquí, presentamos un protocolo que describe cómo i) ensamblar un vector autorreplicante usando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate, ii) introducir el vector en un host cianobacteriano por conjugación, y iii) caracterizar las cepas de cianobacterias transgénicas usando un lector de placas o citometría de flujo.

Modificación genética de las cianobacterias por conjugación utilizando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate

Este protocolo utiliza promotor-reporteros fluorescentes, microscopía de células vivas y extracción de inclusión individual en un enfoque genético hacia adelante dirigido para identificar y aislar mutantes del desarrollo de Chlamydia trachomatis.

Enfoque genético de células vivas para identificar y aislar mutantes del desarrollo en Chlamydia trachomatis

Aquí, describimos la construcción de mutantes nulos de Aeromonas en glicosiltransferasas específicas o regiones que contienen glicosiltransferasas, los ensayos de motilidad y la purificación de flagelos realizados para establecer la participación y función de sus enzimas codificadas en la biosíntesis de un glicano, así como el papel de este glicano en la patogénesis bacteriana.

Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana

Phormidium lacuna es una cianobacteria filamentosa que se aisló de las piscinas de rocas marinas. Este artículo describe el aislamiento de filamentos de fuentes naturales, la extracción de ADN, la secuenciación del genoma, la transformación natural, la expresión de sfGFP, la crioconservación y los métodos de motilidad.

Transformación natural, expresión de proteínas y crioconservación de la filamentosa Cyanobacterium Phormidium lacuna

Este protocolo proporciona una guía completa para la configuración y el seguimiento cuantitativo de cocultivos, incluidas las cianobacterias fotoautótrofas secretoras de azúcar y las levaduras heterótrofas.

Ensamblaje y cuantificación de cocultivos que combinan levaduras heterótrofas con cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar

Uso de alta frecuencia de estimulación eléctrica, actividades similares a convulsiones pueden ser inducidos...

Neurocircuit ensayos para las convulsiones en la epilepsia de los mutantes Drosophila</em

Aprende a generar mutantes sin marcadores en Synechocystis sp. PCC6803 y mutantes marcados en Synechococcus sp. PCC7002 mediante manipulación genética repetida. Este método facilita la introducción de alteraciones cromosómicas múltiples en cianobacterias.

Generación de mutantes sin marcadores marcados y en el modelo de especies de cianobacterias

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