Name: Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo de hígado fibrótico inducido por etanol en pez cebra para estudiar la regeneración de hepatocitos. Este método permite realizar cribados químicos in vivo de forma económica y visualizar células individuales.

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Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del GTEC (2731336 y 1411318), el NIH (K01DK081351), y la NSF (1.354.837) a CHS Agradecemos Alem Giorgis para la lectura crítica del manuscrito.

El pez cebra fueron criados y criados utilizando un protocolo estándar que cumpla con los criterios de los Institutos Nacionales de Salud y aprobadas por el Instituto de Tecnología de Georgia Institucional Cuidado de Animales y el empleo. 1. Preparación de soluciones <ol><li> Preparar el agua de huevo 20 L (utilizado indistintamente con &#39;medio de embrión&#39;) para mantener embriones de pez cebra / larval. Disolver 1,5 g de CaSO 4 y 6 g de sal del mar del océano instantánea en 250 ml de agua destilada. Verter en un bidón lleno de 20 litros de agua destilada y agitar. </li><li> Preparar 1 litro (PTU) solución madre-2-tiourea 1-fenil (20x). Disolver 0,6 g de polvo de PTU en 1 L de agua destilada. Añadir 1 ml de solución madre por 20 ml de medio de embrión a una concentración final de 0,003% como solución de trabajo. PRECAUCIÓN: La PTU puede causar toxicidad sistémica tras la inhalación o exposición cutánea. Preparar y utilizar de acuerdo con las directrices de manejo adecuadas. </li><li> Preparar 1 L de acetato de 3-aminobenzoate solución de metanosulfonato (Tricaína) (20x). Disolver 4 g de polvo Tricaína en agua destilada. Ajustar el pH a 7 mediante la adición de tampón Tris 1 M (pH 9), y llevar el volumen final a 1 L con agua destilada. Alícuota en 50 ml y se almacena a -20 ° C. Descongelarse antes de su uso. PRECAUCIÓN: Tricaína puede inducir una pérdida de sensibilidad. Preparar y utilizar de acuerdo con las directrices de manejo adecuadas. </li><li> Preparar 100 ml de solución de metronidazol larval (MTZ) de trabajo. Hacer solución fresca 15 MTZ mM disolviendo 0,25 g de polvo de MTZ en 0,1% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) en 100 ml de medio de embrión. Disuelva el polvo MTZ completamente mediante agitación vigorosa. Hacer una solución fresca MTZ y use papel de aluminio para evitar la degradación fotocatalítica de MTZ. PRECAUCIÓN: MTZ puede causar irritación. Preparar y utilizar de acuerdo con las directrices de manejo adecuadas. </li><li> Preparar 100 ml de solución de trabajo de larvas de etanol / metronidazol (EtOH / MTZ). Hacer una solución fresca MTZ y use papel de aluminio para evitar fotocatalítica degradación de MTZ. Añadir 1,5 ml 100% de etanol en 100 ml de solución de MTZ a una concentración final de 1,5% justo antes del uso. </li><li> Preparar 500 ml de solución de trabajo de adultos MTZ. Hacer una solución fresca MTZ 10 mM disolviendo 0,83 g de polvo de MTZ en DMSO al 0,1% en 500 ml de agua del sistema. Disuelva el polvo MTZ completamente mediante agitación vigorosa. Hacer una solución fresca MTZ y use papel de aluminio para evitar la degradación fotocatalítica de MTZ. </li><li> Preparar 1 l de tampón PEM. Disolver 30,2 g TUBOS, 0,74 g, EGTA y MgSO4 en agua destilada 0,12 g. Ajustar el pH a 7 con NaOH. Se ajusta el volumen final a 1 L con agua destilada. </li></ol> 2. Preparación de larvas de pez cebra <ol><li> Configurar el apareamiento de [Tg (fabp10a: PPC-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 pez cebra adulto con Tg (hand2: EGFP) PD24 13 adultos de pez cebra en los tanques de apareamiento. Utilice divisores para llevar a cabo el apareamiento cronometrado. </li><li> Retire el divider la mañana siguiente y permitir que los peces se acoplarán sin interrupción. Cosecha embriones de 2 horas más tarde por el esfuerzo de agua del sistema y la transferencia de los embriones en 100 mm placas de Petri con medio de embrión. </li><li> Mantener no más de 100 embriones por placa de Petri. Bajo un microscopio estereoscópico, eliminar los huevos no fertilizados utilizando una pipeta de vidrio. Crecer embriones a 28 ° C y añadir feniltiourea (PTU) a una concentración final de 0,003% después de 10 horas post-fertilización (HPF) para inhibir el desarrollo de pigmentos. </li></ol> 3. El etanol, tratamiento con metronidazol y el hígado en regeneración de las larvas de pez cebra <ol><li> Preparar la solución de EtOH fresco mediante la adición de etanol en medio de embrión a una concentración final de 1,5%. No agregue PTU. </li><li> Tratar embriones con solución de etanol 20 ml por placa Petri 56-80 hpf. Cubrir placas de Petri con papel de plástico para evitar la evaporación del etanol. </li><li> Clasificar [Tg (fabp10a: PPC-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 </sup&gt;; Tg (hand2: EGFP) PD24] larvas con el tamaño del hígado similares, tal como se determina por la expresión CFP, en 80 hpf. No utilice Tricaína al ordenar las larvas tratadas con EtOH porque esto causará alta tasa de mortalidad con el tratamiento posterior de EtOH / MTZ. Mantenga larvas ordenada a una densidad de 30 embriones por placa de Petri. </li><li> Preparar fresco MTZ 15 mM en medio de embrión en 0,1% de DMSO. Añadir la cantidad apropiada de EtOH en solución MTZ para hacer una concentración final de 1,5%. Se incuban las larvas en 20 ml de solución de EtOH / MTZ por placa de Petri durante 24 horas a 28 ° C. Cubrir placas de Petri con una envoltura de plástico para mantener la concentración de EtOH y con papel de aluminio para protegerlo de la luz. </li><li> Al final del tratamiento, eliminar la solución de EtOH / MTZ mediante la transferencia de las larvas a las nuevas placas de Petri con medio de embriones frescos. Lávese las larvas 3 veces con medio de embrión y mantenerlos en 20 ml de medio de embrión sin PTU. </li><li> Para resolver las larvas con la ablación casi completa de los hepatocitos, observar la fluorescenciabajo un microscopio de epifluorescencia con el filtro de CFP con un aumento de 80X. Resultados de la ablación con éxito en un mínimo de fluorescencia PPC en el hígado y el volumen hepático reducido significativamente. </li><li> Para evitar la muerte de las larvas tratadas-MTZ EtOH /, no utilice Tricaína para la clasificación. Fijar las larvas de inmunotinción (consulte la sección 5) o mantener ordenada larvas en placas de Petri a 28 ° C para análisis posteriores. </li></ol> 4. Pantallas químicos en tratados MTZ EtOH / larvas de pez cebra <ol><li> Llevar las placas de 96 pocillos que contenían 10 mM en DMSO acciones químicas (consulte la Lista de materiales para obtener detalles sobre las bibliotecas químicas comerciales) desde el -80 ° C congelador. Cubrir con papel de aluminio para evitar la degradación fotocatalítica de los productos químicos. Descongelar las soluciones madre a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Preparar soluciones químicas mediante la dilución de soluciones madre 10 mM con medio de embrión a una concentración final de 50 mM (en placas de 96 pocillos: s inicialesCreen; en tubos de 1,5 ml: repetición de pruebas). larvas de control se trataron con concentraciones iguales de DMSO en medio de embrión. </li><li> larvas de transferencia con la ablación casi completa de hepatocitos, que fueron tratados con EtOH MTZ 1,5% / 15 mM y ordenadas como se mencionó anteriormente, a cualquiera de 96 pocillos (pantalla inicial) o de 24 pocillos (de nuevas pruebas) placas llena previamente con medio de embrión a una densidad de 5 larvas por pocillo. Utilice pocillos por duplicado para cada producto químico. </li><li> Retire medio de embrión y añadir ya sea 250 l (placas de 96 pocillos) o 500 l (placas de 24 pocillos) soluciones químicas a cada pocillo. placas de cubierta con papel de aluminio y el tratamiento de las larvas de 50 horas a 28 ° C. Inspeccionar las larvas-remojo química diaria y eliminar cualquier larvas muertas de los pozos individuales. </li><li> Al final del tratamiento químico, observar el número y / o la intensidad de los hepatocitos CFP-expresan bajo un microscopio de epifluorescencia con el filtro de CFP con un aumento de 80X. La fotografía que muestra en vivo larvas mejorada o reducird número y / o la intensidad de la PPC hepatocitos que expresan con una cámara digital para los registros. </li><li> Conservar las larvas mediante la fijación de formaldehído durante imagen confocal como se describe en la sección 5. </li><li> Para volver a probar los productos químicos que facilitan la regeneración de los hepatocitos en la pantalla inicial, examinar su potencia a concentraciones superiores e inferiores para encontrar la concentración más eficaz con los procedimientos descritos en 4.1-4.5 ( &#39;nuevas pruebas&#39;). </li></ol> 5. La fijación de las larvas de pez cebra, inmunotinción, y Imagen confocal <ol><li> Anestesie larvas mediante la adición de tricaína a una concentración final de 0,02%. Transferencia de 10 a 15 larvas a un tubo de 1,5 ml y se lava una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Retirar PBS y añadir 1 ml de recién preparada de formaldehído al 2% en tampón PEM para fijar O / N a 4 ° C. PRECAUCIÓN: El formaldehído produce irritación y se sabe que es un carcinógeno humano. Manejar en una campana de humos química. </li><li> La solución que se fijan correctamente y luego waSH 3 veces con PBS a temperatura ambiente. larvas fijo puede mantenerse en PBS a 4 ° C hasta por varios días. De proceder al siguiente paso da rápidamente mejores resultados de inmunotinción. </li><li> Retirar con cuidado la yema y la piel que cubre el área del hígado usando un fórceps # 55 bajo un microscopio estereoscópico. </li><li> Permeabilizar y larvas de bloque en tampón de bloqueo (4% de albúmina de suero bovino y 0,3% de Triton X-100 en PBS) O / N a 4 ° C. </li><li> Incubar con el anticuerpo de conejo anti-colágeno I a una dilución de 1: 100 en tampón Bloque O / N a 4 ° C. Lavar 5 veces durante 15 min cada uno con tampón de lavado (0,3% de Triton X-100 en PBS). </li><li> Incubar con 647 AlexaFluor anticuerpo anti-conejo de burro conjugado a una dilución de 1: 200 en tampón Bloque O / N a 4 ° C. Lavar 5 veces durante 15 min cada uno con tampón de lavado. A continuación, lavar una vez con PBS. </li><li> transferir suavemente las larvas a portaobjetos de vidrio utilizando una pipeta de vidrio, y las larvas fijo Oriente con el lado lateral izquierdo hacia arriba. Eliminar el exceso de PBS utilizando Kimwipes. Añadir una gota de medio de montajeY cubierta de vidrio sellado con esmalte de uñas. La realización de formación de imágenes confocal de inmediato se recomienda en gran medida. </li><li> Utilice un sistema confocal equipado con una lente de 40X / 1.3 aceite para capturar imágenes. Utilice la fuerza de láser en 20 a 50%. Capturar imágenes de la consola Z a intervalos de 1 m. </li></ol> 6. Preparación de adultos de pez cebra <ol><li> Configurar el apareamiento de [Tg (fabp10a: PPC-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 pez cebra adultos en tanques de apareamiento. Cosecha embriones a la mañana siguiente por el esfuerzo de agua del sistema y la transferencia de los embriones en 100 mm placas de Petri con medio de embrión. </li><li> Mantener no más de 100 embriones por placa de Petri. Bajo un microscopio estereoscópico, eliminar los huevos no fertilizados utilizando una pipeta de vidrio. Crecer embriones a 28 ° C y añadir PTU a una concentración final de 0,003% después de 10 HPF para inhibir el desarrollo de pigmentos. </li><li> A las 4 dpf, utilice Tricaína para anestesiar a las larvas y ordenar [Tg (fabp10a: PPC-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] larvas. Lavar la Tricaína cambiando a nuevos embrión medio varias veces. Permitir que las larvas se recupere a 28 ° C hasta que alcancen el ritmo cardíaco normal de 120-180 latidos por minuto 18. </li><li> Elevar larvas ordenada de 6-12 meses de edad con base en el procedimiento estándar 19. </li></ol> 7. El etanol, tratamiento con metronidazol, y el hígado Regeneración en adultos de pez cebra <ol><li> Transferencia de 6-12 meses de edad [Tg (fabp10a: PPC-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] adultos de pez cebra a los tanques de apareamiento utilizando una red. Mantener a los peces a una densidad de no más de 10 peces por tanque. </li><li> Preparar la solución de EtOH fresco mediante la adición de EtOH en agua del sistema a una concentración final de 1%. El tratamiento de los peces adultos con 500 ml de solución de EtOH en cada tanque y mantenerlas en un 28 ° C incubadora. </li><li> peces adultos transferencia a la solución de EtOH fresco todos los días, de descarte de peces muertos properly como un riesgo biológico. Tratar a los animales de forma continua durante 72 horas antes del tratamiento MTZ. </li><li> Preparar una solución fresca MTZ 10 mM en agua del sistema en el 0,1% de DMSO. Pre-calentar la solución MTZ en una incubadora a 28 °. Tratar el pescado con 500 ml de solución de MTZ en la travesía del tanque 1 L durante 8 horas a 28 ° C, protegido de la luz usando papel de aluminio. </li><li> Observe por hora durante el tratamiento y retirar los peces muertos inmediatamente. Desechar adecuadamente los peces muertos como un riesgo biológico. Al final del tratamiento de MTZ, lavar la MTZ mediante la transferencia de los animales al agua sistema fresco dos veces. </li><li> Permita que los animales se recuperan y mantienen en una incubadora a 28 ° C. Alimentar y transferir pez en el agua del sistema fresco todos los días, hasta el punto de tiempo para los análisis. </li></ol> 8. Fijación adultos de pez cebra hígado, inmunotinción, y Imagen confocal <ol><li> Anestesiar a los peces adultos con 0,02% Tricaína y la eutanasia en agua helada durante 15 min. Pat el pescado seco en una toalla de papel y colocarlo en una estera de disección. </li><li> Exponer a los órganos gastrointestinales mediante la eliminación de la piel y los músculos a lo descrito previamente 20. Con unas tijeras para cortar la piel y el músculo subyacente a lo largo del vientre de la aleta anal para el opérculo, y luego posteriormente a lo largo del lado de los peces de nuevo a la aleta anal. </li><li> Ponga el pescado en un tubo cónico de 15 ml y lavar una vez con PBS. Retirar PBS y añadir 4 ml de recién preparada de formaldehído al 2% en tampón PEM para fijar O / N a 4 ° C. </li><li> La solución que se fijan correctamente, y lavar 3 veces con PBS a temperatura ambiente. Las muestras fijadas se pueden mantener en PBS a 4 ° C durante varios días. De proceder al siguiente paso de inmediato da mejores resultados de inmunotinción. </li><li> Diseccionar todo el intestino con el hígado de la cavidad del cuerpo de los peces cortando el esófago. Integrar los órganos gastrointestinales con 4% de bajo punto de fusión de agarosa en un molde de seccionamiento. </li><li> Use un vibratome para cortar muestras en secciones transversales a 50 micras intervalos en PBS enfriado con hielo, a partir del extremo anterior. transferir segciones a la placa de 6 pocillos con PBS utilizando un pincel # 1. </li><li> Permeabilizar y secciones de bloque en bloque del buffer O / N a 4 ° C. </li><li> Incubar con el anticuerpo de conejo anti-colágeno I a una dilución de 1: 100 en tampón Bloque O / N a 4 ° C. Lavar 5 veces, 15 minutos cada uno con tampón de lavado. </li><li> Incubar con 647 AlexaFluor anticuerpo anti-conejo de burro conjugado a una dilución de 1: 200 en tampón Bloque O / N a 4 ° C. Lavar 5 veces, 15 min cada uno con tampón de lavado y una vez con PBS. </li><li> transferir suavemente secciones a portaobjetos de vidrio utilizando un pincel # 1. Eliminar el exceso de PBS utilizando Kimwipes, añadir una gota de medio de montaje, y la cubierta de vidrio sellado con esmalte de uñas. La realización de la imagen confocal de inmediato es muy recomendable. </li><li> Utilice un sistema confocal equipado con una lente de 40X / 1.3 aceite para capturar imágenes. Utilice la fuerza de láser en 20 a 50%. Capturar imágenes de la consola Z a intervalos de 1 m. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Se observó la regeneración de hepatocitos HPC mediada en los hígados se recuperan con tratamiento MTZ EtOH /, lo que sugiere que incluso en presencia de una cantidad sustancial de proteínas ECM, incluyendo el tipo fibrilar de colágeno I, las HPCs conservan su competencia para regenerar como hepatocitos. La única MTZ-tratamiento no aumentó la deposición de proteínas ECM significativamente, mientras que el único tratamiento EtOH no indujo la activación HPC 15. Al utilizar el tratamiento combinado EtOH / MTZ, he...

A pesar de la notable capacidad de regeneración de los hepatocitos 1, que son el principal tipo de células de parénquima del hígado, insuficiencia hepática crónica afecta esta capacidad, dando lugar a células progenitoras hepáticas (HPC) la regeneración dependiente de 2. Daño hepático crónico se deriva principalmente de abuso de alcohol, el virus de la hepatitis C crónica (VHC) 3 y enfermedad de hígado graso no alcohólica (EHNA) 4. Esto conduce a la fibrosis hepática sostenida, que se asocia con la acumulación de proteínas de la matriz extracelular (ECM). La persistencia de la acumulación de ECM distorsiona la arquitectura hepática intacta mediante la formación de un tejido fibroso cicatrizante 5, posteriormente, lo que resulta en cirrosis con alta morbilidad y mortalidad. Se han hecho muchos intentos para mitigar la respuesta fibrótica principalmente centrándose en la inhibición de citoquinas profibrogénicas y miofibroblastos activados 6. Este último se deriva principalmente de las células estrelladas hepáticas (HSC), las principales células no parenquimatosas hepáticas responsables de la formación de la cicatriz del hígado 4. Sin embargo, las terapias regenerativas que estimulan fuentes celulares endógenos incluyendo HPCs para regenerar los hepatocitos en presencia de insultos fibrogénicos sostenidos esperan más investigación. Muchos modelos experimentales de fibrosis hepática se han descrito en los mamíferos. Inyección repetitiva de tetracloruro de carbono (CCl 4) ha sido ampliamente utilizado para inducir la fibrosis de hígado en murinos y de rata modelos 7. Cuando se combina con una dieta alta en grasa (HF), alcohol condujo a una regulación al alza sustancial de la expresión génica profibrogenic y fibrosis hepática 8. Mientras que la esteatosis (acumulación de lípidos) resulta de la exposición aguda de alcohol, hace que el hígado susceptible a daño hepático más grave 9. El pez cebra, Danio rerio, se ha convertido en un sistema de modelo de vertebrados de gran valor para el estudio de la regeneración. Aunqueotros vertebrados inferiores, tales como tritones y axolotls tienen una notable capacidad de regeneración, el pez cebra tiene ventajas sobre otros sistemas de modelos con respecto a las estrategias de manipulación genética y de visualización necesarios para manipular los factores de potencial regenerativo 10. El pez cebra también representa un modelo de vertebrados atractivo para el estudio de la enfermedad hepática alcohólica (ALD) por simple adición de etanol (EtOH) a su agua. La exposición aguda EtOH para larvas de pez cebra adultos y esteatosis hepática causada 11-13. Cuando el pez cebra adulto recibió la exposición prolongada EtOH, se observó la deposición de colágeno con la regulación positiva de genes relacionados con la fibrosis-14. Sin embargo, existe una necesidad para el desarrollo de modelos para estudiar la regeneración del hígado en respuesta a EtOH como un estímulo fibrogénicos. Recientemente, hemos desarrollado un modelo de fibrosis hepática inducida por EtOH 15 en el pez cebra. Hemos combinado un sistema de ablación genética específico de hepatocitos con el tratamiento con EtOH en larvas y adultt pez cebra. Hemos generado dos líneas transgénicas, Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1 y Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, en el que E. coli nitrorreductasa (NTR) se fusionan con el cian y proteína fluorescente mCherry, respectivamente, bajo el control del ácido graso específico de hepatocitos proteína 10a, básico (fabp10a) promotor hígado de unión. En este sistema, NTR convierte un profármaco no tóxico metronidazol (MTZ) en un agente de reticulación inter-cadena de ADN 16, inducir la muerte explícita de los hepatocitos. Utilizando este modelo, hemos demostrado que una población de células hepáticas, que son sensibles a la señalización de Notch, convertida en hepatocitos en la casi ausencia de hepatocitos y en el exceso de ECM. Designamos estas células como HPC. Por otra parte, a través de las pantallas químicas, hemos identificado activadores de moléculas pequeñas de la señalización de Wnt y los inhibidores de la señalización de Notch que aumentan la regeneración de los hepatocitos en el hígado fibrótico. Therefore, nuestro modelo de hígado fibrótico en el pez cebra representa un sistema de detección química excelente en comparación con cultura-célula o sistema de selección basado en los mamíferos. Es un sistema in vivo con costos significativos y beneficios de ahorro de tiempo. Aquí se describen los procedimientos detallados para el establecimiento de un modelo de fibrosis hepática inducida por EtOH y para la realización de pantallas químicos que utilizan este modelo en el pez cebra. Además, se realizaron análisis de tiempo-por supuesto para investigar cómo la regeneración de los hepatocitos se produce en el hígado fibrótico. Este protocolo proporcionará una valiosa herramienta para estudiar los mecanismos y estrategias de mejora de la regeneración de los hepatocitos en el hígado fibrótico.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de calcio hemihidrato (CaSO4)</td><td>Acros</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO4)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 1,4-piperazinadietanosulfónico (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)- N,N,N&prime;,N&prime; -ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 prueba</td></tr><tr><td>de formaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol (MTZ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-fenil-2-tiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Éster etílico de ácido 3-aminobenzoico (Tricaína)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>comprimido Amresco</td><td>E404</td><td>Disolver un comprimido con 100 ml de agua destilada</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting agarosa&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de compuestos de señalización de células madre</td><td>Selleck Chemicals</td><td>L2100</td><td>10&nbsp; Stock de mM en DMSO</td></tr><tr><td>ActiProbe-1K Library</td><td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&nbsp; mM stock en DMSO</td></tr><tr><td>SB 415286</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2729</td><td>Disolver con DMSO a 10&nbsp; mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>Disolver con DMSO a 10&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-colágeno I</td><td>Abcam</td><td>ab23730</td><td>Uso a escala 1:100 para inmunotinción, reacciona con peces</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Donkey anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Sondas moleculares</td><td>A31573</td><td>Uso a 1:200 para inmunotinción</td></tr><tr><td>Medios de montaje (Vectorshield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>24 pocillos placa</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Dumont #55</td></tr><tr><td>Corredera de vidrio</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 mm</td></tr><tr><td>Envoltura de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Vibrótomo</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de efluorescencia</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Confocol</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de un modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

< clase p = 'jove_content'>La fibrosis hepática sostenida con continuación de la acumulación de proteínas de la matriz extracelular (MEC) resulta en la pérdida de la competencia celular del hígado, lo que conduce a cirrosis con disfunción hepatocelular. Entre las múltiples lesiones hepáticas, el abuso del alcohol puede provocar problemas de salud importantes, como insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular. Sin embargo, la identidad de las fuentes celulares endógenas que regeneran los hepatocitos en respuesta al alcohol no se ha investigado adecuadamente. Además, pocos estudios han modelado eficazmente la regeneración de los hepatocitos a partir de lesiones inducidas por el alcohol. Recientemente informamos sobre el establecimiento de un modelo de hígado fibrótico inducido por etanol (EtOH) en pez cebra en el que las células progenitoras hepáticas (HPC) dieron lugar a hepatocitos tras la pérdida casi completa de hepatocitos en presencia de estímulos fibrogénicos. Además, a través de cribados químicos utilizando este modelo, identificamos múltiples moléculas pequeñas que mejoran la regeneración de los hepatocitos. En este trabajo se describen en detalle los procedimientos para desarrollar un modelo de hígado fibrótico inducido por EtOH y para realizar cribados químicos utilizando este modelo en pez cebra. Este protocolo será una herramienta crítica para delinear los mecanismos moleculares y celulares de cómo se regeneran los hepatocitos en el hígado fibrótico. Además, estos métodos facilitarán el descubrimiento potencial de nuevas estrategias terapéuticas para la enfermedad hepática crónica in vivo.

Figura 1 muestra el desarrollo de un modelo de hígado fibrótico EtOH inducida en larvas de pez cebra. Para optimizar un protocolo para la exposición de las larvas de pez cebra para EtOH, se evaluó la toxicidad primera EtOH. 2,5 días post-fertilización (DPF) larvas fueron expuestas a la concentración de EtOH 1%, 1,5% o 2% durante 24 horas seguido de un 24 hr EtOH tratamiento concurrente / MTZ. La exposición al 2% EtOH causó una mortalidad elevada, mientras que casi todas ...

La fibrosis sostenida con depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular conduce a la cirrosis. El abuso del alcohol es una de las principales causas de enfermedad hepática grave. Establecimos un modelo de hígado fibrótico de pez cebra inducido por etanol para estudiar los mecanismos y estrategias de promoción de la regeneración de hepatocitos tras la lesión inducida por el alcohol.

Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

El objetivo general de este protocolo es establecer un modelo de hígado fibrotico inducido por etanol en pez cebra y realizar cribados químicos utilizando este modelo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración hepática, como los mecanismos moleculares y celulares mediante los cuales los hepatocitos se regeneran en el hígado fibrotico.La principal ventaja de esta técnica es que es rentable y ahorra tiempo en la selección química in vevo. Además, se puede realizar un análisis detallado de la evolución temporal mediante la visualización de una sola célula. Realizando el procedimiento estarán Mianbo Huang, un posdoctorado, y Jin Xu, un estudiante de posgrado del laboratorio.Después de preparar los reactivos según el protocolo descrito, prepare acuarios de apareamiento con divisores utilizando peces cebra transgénicos adultos que contengan la proteína de unión a ácidos grasos 10a:CFP-NTR con Tp1:mCherry y Tg(hand2:EGFP). A la mañana siguiente, dos horas después de retirar los divisores, recolecte los embriones filtrando el agua del sistema y transfiriendo los embriones a placas de Petri de 100 milímetros que contengan medio para embriones. A las 56 horas post fertilización, o HPF, añada etanol al 1,5 por ciento a los embriones.Utilice una envoltura de plástico para cubrir las placas y evitar la evaporación del etanol. Incube luego a 28 grados Celsius durante 24 horas. Prepare MTZ fresco al 15 milimolar y medio de embriones con 0,1 por ciento de DMSO y agregue etanol hasta una concentración final del 1,5 por ciento.Luego, a las 80 HPF, trate los embriones seleccionados con 20 mililitros de solución de etanol MTZ por placa de Petri. Utilice papel de plástico para cubrir las placas y evitar la evaporación del etanol, y cúbralas con papel de aluminio para protegerlas de la luz. A continuación, incube a 28 grados Celsius durante 24 horas.Al día siguiente, observe los embriones bajo un microscopio epifluorescente utilizando un filtro CFP y un aumento de 80x para separar las larvas con ablación casi completa de hepatocitos. Para realizar ensayos químicos, retire las placas de 96 pocillos que contienen stocks químicos de diez milimolares en DMSO del congelador a menos 80 grados. Utilice papel de aluminio para cubrir las placas y evitar la degradación fotocatalítica de los productos químicos, y descongele con agitación suave a temperatura ambiente.En tubos de 1,5 mililitros, prepare soluciones químicas diluyendo cinco microlitros de soluciones stock de diez milimolares con un mililitro de medio para embriones hasta una concentración final de 50 micromolares. A continuación, transfiera cinco larvas por pocillo con ablación casi completa de hepatocitos a placas de 24 pocillos llenas con medio para embriones. Luego, retire el medio para embriones y agregue 500 microlitros de las soluciones químicas a cada pocillo.Cubra las placas con papel de aluminio e incube las larvas a 28 grados Celsius durante 50 horas. Después de la incubación, observe el número y/o la intensidad de los hepatocitos que expresan CFP bajo un microscopio epifluorescente con un aumento de 80x. Capture imágenes de larvas vivas con números aumentados o reducidos y/o intensidad de hepatocitos que expresan CFP.Establezca apareamientos de peces cebra transgénicos que contienen la proteína de unión a ácidos grasos 10a:CFP-NTR con TP1:mCherry y críe las larvas seleccionadas hasta que tengan entre seis y doce meses de edad. Utilice una red para transferir los peces cebra transgénicos adultos a los tanques de apareamiento. Prepare etanol fresco al uno por ciento en agua del sistema y luego use 500 mililitros de la solución para reemplazar el agua del sistema en los tanques de apareamiento.Incube los tanques a 28 grados Celsius durante 72 horas, transfiriendo los peces a una solución fresca de etanol y eliminando diariamente cualquier pez muerto durante la incubación. Prepare una solución fresca de MTZ de diez milimolar en agua del sistema con 0,1 por ciento de DMSO, luego agregue 500 mililitros de la solución de MTZ precalentada a los peces en tanques de apareamiento de un litro. Utilice papel de aluminio para cubrir los tanques.Incubar a 28 grados Celsius durante ocho horas y analizar según el protocolo del texto. Después de anestesiar según el protocolo del texto, exponer los órganos gastrointestinales utilizando tijeras para cortar la piel y el músculo subyacente a lo largo del vientre, desde la aleta anal hasta el opérculo. Luego, cortar posteriormente a lo largo del costado del pez hasta la aleta anal.Coloque el pez en un tubo cónico de quince mililitros y use PBS para lavarlo una vez. Luego elimine el PBS y agregue cuatro mililitros de formaldehído al tres por ciento recién preparado en tampón PEM. Incube a cuatro grados Celsius durante la noche para fijar el pez.Al día siguiente, después de lavar las muestras según el protocolo descrito, corte el esófago para diseccionar todo el intestino junto con el hígado de la cavidad corporal. A continuación, coloque los órganos gastrointestinales en un molde para corte y utilice agarosa al cuatro por ciento de punto de fusión baja para embeber el tejido. A continuación, recorte el bloque en forma de trapecio y péguelo a la base.Luego, utilice un vibrátomo y, comenzando desde el extremo interno del tejido, corte muestras en secciones transversales a intervalos de cincuenta micrómetros en PBS frío con hielo. Utilice un pincel número uno para transferir las secciones a una placa de seis pocillos con PBS. Después de la inmunotinción de las secciones según el protocolo descrito en el texto, use un pincel número uno para transferir suavemente las secciones a portaobjetos de vidrio.Utilice toallas de papel para eliminar el exceso de PBS antes de agregar una gota de medio de montaje y un cubreobjetos. Luego, use esmalte de uñas para sellar el cubreobjetos. Finalmente, utilizando un sistema confocal equipado con un objetivo de aceite de 40x 1.3 NA, capture imágenes Z-Stack a una intensidad del 20 al 50 por ciento y con intervalos de un microamperio.Esta figura muestra que las larvas tratadas con MTZ-etanol desarrollan una curvatura ascendente del tronco y la cola, edema pericárdico y fallo en la inflación de la vejiga natatoria. Como se observa aquí, los hígados de control tratados con DMSO no mostraron depósito de colágeno tipo uno fibrilar. Por el contrario, los hígados tratados con MTZ-etanol mostraron una acumulación elevada de colágeno tipo uno a las 25 y 50 horas posteriores a la ablación.Además, en comparación con los hígados control tratados con DMSO, las CSH aumentaron en número y adoptaron una forma similar a la de un miofibroblasto, careciendo de prolongaciones citoplasmáticas en los hígados en regeneración tratados con etanol y MTZ. Esta figura muestra el desarrollo de un modelo de hígado fibrotico inducido por etanol en peces cebra adultos tratados con un uno por ciento de etanol seguido de MTZ. A partir de estos análisis de curso temporal, se observó una deposición significativamente elevada de colágeno tipo uno en los hígados en regeneración tratados con etanol y MTZ a los dos, tres y cuatro días posteriores a la ablación, en comparación con los hígados tratados con DMSO.En este experimento de cribado químico, los hepatocitos fueron ablados en presencia de etanol al 1,5 por ciento y 15 milimolar de MTZ. Luego, las larvas fueron expuestas a productos químicos durante 50 horas. Varios agonistas de wint, como inhibidores de la glucógeno sintasa quinasa-3 y un activador de wint, promovieron la regeneración de hepatocitos en comparación con DMSO.Estos datos sugieren que este modelo fibrotico sostenido proporciona una herramienta invaluable para descubrir moléculas pequeñas que mejoren la regeneración de hepatocitos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una semana si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar lograr una ablación casi completa de los hepatocitos y mantener la concentración de etanol durante todo el procedimiento.Tras seguir este procedimiento, se puede evaluar la eficacia de los compuestos químicos identificados en modelos de lesión hepática en mamíferos. Tras su desarrollo, esta técnica puede abrir nuevas vías en el campo de la terapia de regeneración celular para explorar el descubrimiento potencial de nuevas estrategias terapéuticas para pacientes con insuficiencia hepática crónica. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un modelo de hígado fibrotico inducido por etanol en pez cebra y cómo realizar cribados químicos.No olvide que trabajar con formaldehído puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y manipular el reactivo en una campana extractora de gases, al realizar este procedimiento.

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Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos (Video) | JoVE Journal

Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos

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