Name: Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprende a visualizar la matriz extracelular cardíaca mediante microscopía electrónica de barrido en tejido macerado. Esta técnica cualitativa permite estudiar la organización de la matriz y su relación con fibrosis y cardiomiopatías.

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Este estudio fue financiado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), el Instituto del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NIHLB): K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
Las imágenes y el procesamiento de tejidos (después de la maceración con NaOH) se realizaron mediante el uso del Recurso Compartido de Imágenes Celulares (CISR) del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt (VUMC) (respaldado por las subvenciones de los NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 y EY08126). Estamos especialmente agradecidos a los directores principales de VUMC CISR (Dr. Sam Wells y Dr. W. Gray (Jay) Jerome) por su valioso asesoramiento técnico y también por proporcionar el espacio y los recursos centrales para los fines de filmar la técnica destacada en este documento. 
Nos gustaría expresar nuestro más profundo agradecimiento al Dr. Yan Ru Su y a la Sra. Kelsey Tomasek en el Laboratorio Central de Cardiología para Investigación Traslacional y Clínica de la Universidad de Vanderbilt por proporcionar experiencia técnica y por recolectar muestras de tejido humano utilizadas en este estudio.

Declaración de Ética: Los protocolos para el manejo de animales fueron aprobados por el Vanderbilt Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC, protocolos número M / 10/117 (porcina) y M / 10/219 (ratones) y llevado a cabo de acuerdo con las normas de AAALAC-International. el uso de tejidos cardíacos humanos peraltadas fue aprobado por la Universidad de Vanderbilt Medical Center IRB (número de protocolo 100887). 1. Recolección de muestras y almacenamiento <ol><li> Hacer fresco glutaraldehído 4% en solución tampón de fosfato 0,1 M (PB). PRECAUCIÓN: El glutaraldehído es tóxico, lleve guantes y el trabajo en una campana de humos. <ol><li> Hacer una solución 0,2 M social de PB, pH 7,4 usando 21,8 g de Na 2 HPO 4 y 6,4 g NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) a 1.000 ml de dH2O </li><li> Añadir 400 l de 50% de glutaraldehído a 2,5 ml de solución madre de PB y 2,1 ml de dH2O </li></ol></li><li> Sumergir un trozo (no más de 2 cm 2) de tejido en la solución de glutaraldehído al 4%. Nota: Las piezas más pequeñas se pueden utilizar también, pero deberían ser de tamaño suficiente (no más pequeña que 5 mm 2) para ser fácilmente visualizado por el ojo a fin de facilitar los pasos posteriores del protocolo. </li><li> Se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, almacenar indefinidamente a 4 ° C. </li></ol> 2. Descelularización de tejido cardíaco <ol><li> Hacer una solución de NaOH acuoso al 10% fresco usando 10 g de lentejas de NaOH / 100 ml de dH 2 O. PRECAUCIÓN: soluciones de NaOH son corrosivos y pueden causar quemaduras a los álcalis, usar guantes. </li><li> Enjuague el tejido en dH2O </li><li> Se incuba en una solución de NaOH al 10% a temperatura ambiente durante 6 - 10 días (hasta que los cambios de tejido de color marrón rojizo a grisáceo o blanco). </li><li> Enjuague con H2O destilada hasta que el tejido se vuelve transparente. </li><li> Sumergir el tejido en ácido tánico al 1% durante 4 horas a temperatura ambiente. Use 1 ml 5% solución de reserva por 4 ml de dH2O PRECAUCIÓN: El ácido tánicoes un fuerte irritante, use guantes. </li><li> Enjuague en dH2O durante la noche. </li></ol> 3. Osmication y deshidratación de los tejidos del corazón (en la campana de humos para la Seguridad) <ol><li> Hacer una solución 0,2 M de stock de tampón de cacodilato de sodio utilizando 21,4 g de cacodilato de sodio, cloruro de calcio 10,0 g y 450 ml dH 2 O. Mezcla, a continuación, añadir ácido clorhídrico como sea necesario para ajustar el pH a 7,4. Qs a 500 ml con dH2O PRECAUCIÓN: cacodilato de sodio y ácido clorhídrico son tóxicos, usar guantes y el trabajo en una campana de humos. </li><li> Hacer solución madre acuosa al 2% de tetróxido de osmio en campana de humos para la seguridad disolviendo 1 g de cristal de tetróxido de osmio en 50 ml de dH2O PRECAUCIÓN: El tetróxido de osmio es un grave peligro de inhalación; la fijación de vapor de las membranas mucosas o los ojos es posible, por lo tanto, manejar sólo en la campana de humos con guantes. Se recomienda utilizar un protector contra salpicaduras. </li><li> Enjuague el tejido en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (de la mezcla de la solución 1: 1 con dH <sub&gt; 2 O) durante 5 min en los rotadores (o agitación suave). </li><li> Repita el paso anterior dos veces, para un total de tres enjuagues de amortiguamiento. </li><li> Sumergir el tejido en el 1% tetróxido de osmio en tampón cacodilato de sodio 0,1 M (de la mezcla de cacodilato de sodio social y acciones de tetróxido de osmio 1: 1) en el rotador durante 1 hora. </li><li> Enjuague el tejido en tampón cacodilato 0,1 M de sodio 3 veces durante 5 minutos cada uno en los rotadores. </li><li> Enjuague tejido usando concentraciones crecientes de etanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, y, finalmente, 100%) durante 15 minutos cada uno en los rotadores. </li></ol> 4. Corte transversal preparación de superficies para SEM <ol><li> Transferir el tejido en etanol al 100% a un plato poco profundo de Petri que contiene también 100% de etanol. </li><li> Mantenga dos cuchillas de afeitar muy afilados de tal manera que los planos de los lados están en contacto uno con el otro y la cruz bordes de corte para formar dos lados de un triángulo equilátero por encima de la muestra. Para lograr esto, usar la mano izquierda para colocar una cuchilla en el extremo derecho de la muestra ycorte hacia la izquierda. Al mismo tiempo, usar la mano derecha para colocar la segunda hoja en el extremo izquierdo de la muestra y la rebanada hacia la derecha. Por lo tanto, las cuchillas se deslizan uno contra el otro desde direcciones opuestas para hacer un solo corte suave. </li><li> Deslizar los lados de hoja plana uno contra el otro para hacer un corte muy limpio de la muestra con una distorsión mínima o fuerza de desgarro, preferiblemente exponiendo tan grande un área de superficie como sea posible sin dañar la muestra. </li><li> Repita este procedimiento para cada muestra para exponer las posibles superficies de sección transversal más limpias para su examen en el SEM. </li></ol> 5. El punto crítico de secado (CPD) de tejido cardíaco <ol><li> Utilice una espátula o pinzas para transferir tejido para el soporte de muestra de la secadora punto crítico (CPD), asegurando que el tejido se mantiene en etanol al 100% en todo momento. Asegúrese de que el soporte se sumerge en etanol y que la transferencia se consigue con el tejido expuesto al aire durante no más de unos pocos segundos. </li><li> Operar CPD por nosotrosmanual del er 3 para completar la purga y relleno para reemplazar los ciclos de etanol con dióxido de carbono líquido. </li><li> CPD operar según el manual del usuario para lograr un secado punto crítico de las muestras y devolverlos a la presión atmosférica con ventilación controlada de CO2. </li></ol> 6. Montaje de muestras de tejido del corazón para SEM <ol><li> Preparar un trozo de muestra SEM para cada muestra, adhiriendo una lengüeta adhesiva de carbono a la superficie superior del tramo de aluminio. </li><li> Con la ayuda de un microscopio estereoscópico, se adhieren cuidadosamente la muestra para el precinto adhesivo con la superficie de la sección transversal de interés hacia arriba (lejos de la pestaña, visible), y lo más cerca posible de manera paralela con el plano de la superficie de la muestra trozo. No introduzca ni toque la superficie de interés. </li><li> Romper un aplicador de madera para lograr un cepillo cónico, ideal para la aplicación de pintura. Aplicar pintura de plata o de carbono en la base y los lados de la probeta, para mejorar la adherencia al trozo. </li><li> Extender una línea muy fina de plata o de carbono pintar hasta un borde de la superficie de interés, para proporcionar un camino de carga de la superficie de interés a tierra. </li><li> Aplicar 2 o 3 pequeños toques de plata o pintura de carbono alrededor del perímetro de la pestaña de carbono, para proporcionar una ruta conductora de la superficie de la aleta de carbono para el talón de metal y por lo tanto a tierra. </li><li> Deje que se seque la pintura conductora durante dos horas. </li><li> Operar revestidor de bombardeo iónico por el manual del usuario para aplicar un recubrimiento relativamente pesado (intervalo objetivo de 30 - 40 nm) de aleación de oro-paladio u oro. Bomba cámara de muestras a aproximadamente 0,1 mbar; programar el temporizador de 40 segundos. Conjunto de válvula abierta al (flujo de gas argón moderada) 08:00 posición. Pulse Iniciar para iniciar el revestimiento por bombardeo iónico a 30 mA. descarga luminiscente púrpura debe ser visible en la cámara de muestra. </li></ol> 7. SEM El examen de muestras de tejido del corazón <ol><li> Realizar microscopía electrónica de barrido relativamente bajo voltaje de aceleración para minimizar la formación de imágenes pos problemas asociados con la mala disipación de la carga en la muestra (carga). Sugerido condición de imagen inicial son: 5 kV voltaje de aceleración, distancia de trabajo de 10 mm. </li><li> Con la asistencia de un operador con experiencia, empleo aumenta la distancia de trabajo para ampliar la profundidad de campo en condiciones de formación de imágenes que requieren foco de fibras en múltiples planos focales, o fibras que se extienden de considerable longitud en la dimensión z. <ol><li> Para el microscopio usado aquí (véase la Tabla de Materiales), en el acceso a la interfaz de usuario en la pestaña de navegación arriba a la derecha. </li><li> Acceder a la ficha Coordenadas del menú escenario. Para aumentar la distancia de trabajo, introduzca un valor mayor en milímetros para la coordenada z continuación, haga clic en la pestaña Ir a la etapa de mover la muestra a la distancia de trabajo introducido. </li></ol></li><li> Con la ayuda de un operador experimentado, emplear inclinación espécimen y rotación para posicionar la superficie de ortogonal interés para el haz de electrones. la inclinación adicional de 10 a 30 grado dees de esta posición puede mejorar la observación y documentación de la estructura de la matriz. <ol><li> Para el microscopio usado aquí (véase la Tabla de Materiales), en la interfaz de usuario, haga clic y mantenga pulsado el botón derecho del ratón, a continuación, deslice hacia la izquierda o hacia la derecha para enfocar la muestra cerca de la periferia del plano de la superficie preparada de interés, teniendo en cuenta la distancia de trabajo enfocado . </li><li> Navegar con el mando de control de interfaz de usuario Manual de moverse cerca del borde opuesto de la superficie y repita el enfoque. Si la distancia de trabajo no es aproximadamente igual a la primera posición, la muestra de inclinación para lograr la aproximación de acuerdo en ambos lugares mediante la ficha Coordenadas del menú de la etapa (véase el apartado 7.2) e introduzca un valor de inclinación en el T de coordenadas. </li><li> Girar noventa grados espécimen (Anotar el valor en R Coordinar campo) y repetir el proceso hasta que todas las posiciones se concentran aproximadamente a la misma distancia de trabajo. Nota: presión variable SEM se puede emplear para mejorar la disipación de la cargasi está disponible. De alto vacío es el modo de funcionamiento estándar para la microscopía electrónica de barrido. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cruz preparación sección de superficie es el paso más crítico durante el protocolo. Para preservar la estructura fina, las muestras deshidratadas deben permanecer en etanol al 100% en todo momento hasta introducido en el proceso de secado de punto crítico. Por lo tanto el corte en lonchas de los especímenes para lograr superficies de exploración EM deben hacerse mientras las muestras se sumergieron en etanol en un plato poco profundo. También es fundamental que la superficie expuesta no se toca o sondeó durante la manip...

La fibrosis interrumpe la red normal de colágeno miocárdico, que es crítica para las funciones mecánicas normales de los cardiomiocitos 1,2, así como para la comunicación intercelular, la señalización intracelular y la supervivencia celular 3. El desarrollo de fibrosis es un determinante importante de la función cardíaca, y la remodelación fibrótica del intersticio cardíaco que surge de una variedad de etiologías conduce a un aumento de la rigidez ventricular izquierda y disfunción diastólica 4. La fibrosis miocárdica también puede conducir a arritmias, y si la progresión del remodelado fibrótico es un fenómeno general o local, está altamente asociada a un mal pronóstico en pacientes con miocardiopatía isquémica y no isquémica 5. Asimismo, la ausencia de fibrosis miocárdica es un fuerte predictor de recuperación funcional ventricular y supervivencia a largo plazo 6. 
El sello distintivo de la fibrosis es la deposición de exceso de colágeno, que tiene la resistencia a la tracción del acero 7 y puede afectar negativamente a la función de los cardiomiocitos en múltiples niveles. Las fuerzas mecánicas resultantes de una matriz excesivamente colágena pueden provocar atrofia de los cardiomiocitos 8,9, rigidez pasiva del tejido 10, rigidez miocárdica inducida por la contracción tónica 11-13 y reducción del suministro de oxígeno a la población restante de cardiomiocitos. El acoplamiento de la unión gap de cardiomiocitos y mioFbs también puede comprometer las características eléctricas del corazón, creando un mayor riesgo para el desarrollo de arritmias 14-16. La fibrosis perivascular altera la reactividad vasomotora de las arterias coronarias intramurales y de las arteriolas 17 y contribuye al estrechamiento luminal que reduce el aporte de oxígeno y, por tanto, la supervivencia de los cardiomiocitos 17-22. El remodelado fibrótico y eléctrico patogénico, que emana de un sitio inicial de lesión isquémica o desequilibrio energético, progresa inevitablemente a insuficiencia cardíaca. 
La necrosis de los cardiomiocitos inicia la respuesta fibrótica y puede producirse una posterior remodelación fibrótica adversa independientemente de la etiología. Encontrar una forma de controlar la fibrosis cardíaca sería clínicamente beneficioso para el tratamiento de las miocardiopatías isquémicas e idiopáticas, la cardiopatía hipertensiva, la miocardiopatía hipertrófica, la valvulopatía y las distrofinopatías 23-42. Independientemente de cómo comience el proceso de la enfermedad fibrótica, los factores profibróticos solubles pueden atravesar el espacio intersticial y provocar la activación de los fibroblastos intersticiales y adventiciales en sitios remotos a la cicatriz fibrótica inicial, creando un efecto en cascada que finalmente conduce a la insuficiencia cardíaca. El escenario óptimo sería explotar el proceso fibrilogénico utilizando una terapéutica dirigida que se pueda aplicar durante la etapa hipertrófica compensatoria de la miocardiopatía antes de que progrese a falla de la bomba sistólica, insuficiencia cardíaca diastólica u otros resultados en etapa terminal. El objetivo final sería revertir la fibrosis para que los cardiomiocitos muertos puedan ser reemplazados y la función cardíaca restaurada por completo. 
La importancia de la matriz es ampliamente conocida, sin embargo, los métodos para estudiar la matriz se limitan principalmente a mediciones cuantitativas de los principales componentes estructurales, particularmente el colágeno, y los niveles relativos de diferentes proteínas matricelulares y de la matriz. Este protocolo pone de relieve una técnica poco utilizada que es útil para evaluar las diferencias cualitativas en la matriz cardíaca. Esta técnica se ha utilizado recientemente para comparar y contrastar diferencias fundamentales en matrices cardíacas de diferentes etiologías de enfermedades cardíacas (en explantes humanos), para examinar corazones de cerdos postinfartados tratados con la isoforma del factor de crecimiento glial (GGF) de neuregulina-1β, en relación con animales no tratados 43, y para sondear diferencias en las matrices de tejidos cardíacos de MDX ratones (un modelo animal comúnmente utilizado de distrofia muscular de Duchenne) a diferentes edades y en comparación con los controles de tipo salvaje. Esta técnica fue introducida por primera vez por los doctores Caulfield y Borg en 1979 44, pero pocos estudios han empleado desde entonces esta poderosa técnica 45-47, reintroducida aquí con sólo ligeras modificaciones. Esta metodología es una valiosa herramienta de investigación, ya que proporciona información cualitativa sobre la ultraestructura de la matriz extracelular que, de otro modo, podría pasarse por alto al medir simplemente el contenido de componentes de la matriz y/o el nivel de fibrosis.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>12340 100</td><td>g</td></tr><tr><td>Adhesivo de carbono</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>12664</td><td>30 g</td></tr><tr><td>Lengüetas adhesivas de carbono</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>77825</td><td>Orden para encajar los talones</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de doble filo Acero inoxidable</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td>250/pkg</td></tr><tr><td></td><td>Etanol Electrón Ciencias de la Microscopía</td><td>15055</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Gluteraldehído, Solución al 50%</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>16310</td><td>Grado EM, purificado por destilación</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>16760 o 16770</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Fosfato monosódico NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Osmio Tetróxido</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Adhesivo conductor de plata</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio Dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ácido tánico, 5% Acuoso&nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Cacodilato de Sodio Trihidrato</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Aleación de oro-paladio o</td><td>Sistemas de refinación de oro, Inc.&nbsp;</td><td>varía</td><td>según la marca y el modelo del recubridor por pulverización catódica</td></tr>: <tr><td>Secador de punto crítico</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de madera lisa</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 250 SEM ambiental</td><td>FEI</td><td>Q250 SEM</td><td></td></tr><tr><td>Recubrimiento por pulverización catódica</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>Modelo 108</td><td></td></tr><tr><td>Aluminio SEM Sample Stubs</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>75220-12</td><td>específico para el miscroscopio</td></tr></tbody></table>

microscopía electrónica de barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

La fibrosis es un componente de todas las formas de enfermedad cardíaca, independientemente de su etiología, y aunque se ha avanzado mucho en el campo de la biología de la matriz cardíaca, todavía existen lagunas importantes relacionadas con cómo se forma la matriz, cómo difiere la remodelación fisiológica y patológica y, lo que es más importante, cómo se podría manipular la dinámica de la matriz para promover la curación e inhibir la fibrosis. Actualmente no existe una opción de tratamiento para controlar, prevenir o revertir la fibrosis cardíaca. Parte de la razón es probablemente la gran complejidad de la formación de cicatrices cardíacas, como las que ocurren después de un infarto de miocardio para reemplazar inmediatamente a los cardiomiocitos muertos o moribundos. La propia matriz extracelular participa en la remodelación activando las células residentes y también ayudando a guiar a las células infiltrantes hacia la lesión difunta. La matriz también es una especie de almacén para las proteínas matricelulares que son cruciales para el recambio normal de la matriz, así como para la señalización fibrótica. Además, se ha demostrado que la matriz desempeña un papel electromecánico en el tejido cardíaco. La mayoría de las técnicas para evaluar la fibrosis no son de naturaleza cualitativa, sino que proporcionan resultados cuantitativos que son útiles para comparar dos grupos, pero que no proporcionan información relacionada con la estructura de la matriz subyacente. Aquí se destaca una técnica para visualizar la ultraestructura de la matriz cardíaca. La microscopía electrónica de barrido del tejido cardíaco descelularizado revela diferencias sorprendentes en la estructura que, de otro modo, podrían pasarse por alto utilizando los métodos tradicionales de investigación cuantitativa.

La técnica resaltado se aplicó a los tejidos cardíacos de un donante de trasplante de corazón humano no utilizado (Figura 1), tejidos explantados de los receptores de trasplante, los corazones de tipo salvaje y ratones distróficos (Figura 3), y en muestras de corazón post-infarto de miocardio de un cerdo modelo de lesión del corazón (Figura 2). Como se muestra en la Figura 1, la matriz cardíaco humano es un intrincado te...

Aquí se muestra un método para visualizar la ultraestructura de la matriz extracelular en tejidos cardíacos descelularizados.

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

El objetivo general de este método es visualizar la estructura de la matriz cardíaca en ausencia de células u otros materiales no matriciales. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la fibrosis, especialmente cómo las diferencias en el contenido de la matriz pueden afectar su organización, y cómo estos cambios podrían influir en diferentes cardiomiopatías u otras enfermedades fibrosas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una visión cualitativa de la matriz que puede utilizarse para complementar medidas cuantitativas.Los doctores Galindo y Sawyer tuvieron por primera vez la idea de utilizar esta técnica después de descubrir que el tratamiento convencional en cerdos posinfarto provocaba cambios en la expresión génica similares a los cambios en el contenido de la matriz tras el tratamiento. Las personas nuevas en este método podrían tener dificultades si no cuentan con experiencia previa en la preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido (SEM), debido a las habilidades motoras finas requeridas. La muestra de tejido debe ser lo suficientemente grande como para ser fácilmente visible y debe almacenarse en una solución de glutaraldehído al cuatro por ciento a cuatro grados Celsius.Retire el tejido del almacenamiento en frío y enjuáguelo con agua destilada. A continuación, sumerja el tejido en una solución de hidróxido de sodio al 10 por ciento, preparada recién a partir de perlas en agua. Asegúrese de tomar las precauciones adecuadas.Mantenga el tejido en la solución de hidróxido de sodio durante seis a 10 días a temperatura ambiente. Continúe cuando el color del tejido se vuelva blanco desvaído o blanco. Luego, enjuague el tejido con agua destilada hasta que se vuelva transparente.A continuación, póngase guantes e introduzca el tejido en ácido tánico al uno por ciento durante cuatro horas a temperatura ambiente. Después del baño con ácido tánico, enjuague el tejido con agua destilada durante toda la noche. Como preparación, en una campana extractora y usando guantes, prepare una solución stock de tampón de cacodilato de sodio 0,2 molar y una solución stock acuosa de tetraóxido de osmio al dos por ciento.Utilice una protección contra salpicaduras, ya que el tetraóxido de osmio representa un grave peligro por inhalación. Ahora, prepare una dilución 0,1 molar del tampón de cacodilato de sodio e incube el tejido en él durante cinco minutos con agitación suave. Cambie el tampón dos veces para lavar el tejido un total de tres veces con cacodilato de sodio.A continuación, prepare una mezcla uno a uno del stock de cacodilato de sodio y del stock de tetraóxido de osmio. Incube el tejido en la nueva mezcla sobre un agitador rotatorio durante una hora. Posteriormente, devuelva el tejido al cacodilato de sodio 0,1 molar e incúbelo con agitación suave durante cinco minutos.Cambie esta solución dos veces durante 15 minutos. Luego, deshidrate el tejido utilizando una serie de baños de etanol con concentraciones crecientes. Deje que el tejido se remoje durante 15 minutos en cada baño con agitación suave.A continuación, transfiera el tejido y la solución a una placa de Petri poco profunda llena con etanol al 100 por ciento. Luego, con cuidado, sostenga dos cuchillas de afeitar muy afiladas de manera que las caras planas laterales estén en contacto entre sí, y los filos de corte se crucen para formar dos lados de un triángulo equilátero por encima del espécimen. Ahora, use su mano dominante para colocar la segunda cuchilla en el extremo izquierdo de la muestra, y corte hacia la derecha.Por lo tanto, deslice las cuchillas una contra la otra desde direcciones opuestas para realizar un único corte suave con una distorsión o fuerza de desgarro mínima. El objetivo es exponer un área de superficie lo más amplia posible sin dañar la muestra. Repita el proceso hasta que se hayan preparado suficientes secciones transversales satisfactorias para su examen mediante MEB.Utilizando una espátula o pinzas, transfiera el tejido al portamuestras del SPD, manteniendo el tejido sumergido en etanol al 100 por ciento. El tejido no puede estar expuesto al aire durante más de unos pocos segundos. Utilice el SPD para reemplazar el etanol con dióxido de carbono líquido y realice el ciclo de secado según lo indicado por el fabricante.Luego, prepare un soporte para muestra de MEB para cada espécimen. Adhiera una cinta adhesiva de carbono a la superficie superior del soporte de aluminio. Bajo un estereoscopio, adhiera cuidadosamente el espécimen a la cinta adhesiva con la superficie de la sección transversal de interés orientada hacia arriba, alejada de la cinta, y lo más plana posible respecto a la superficie del soporte.No sondear ni tocar la superficie de interés. Para los especímenes más pequeños y difíciles, romper el aplicador de madera para usarlo como espátula. Además, trabajar sobre una hoja grande de papel de filtro para evitar perder un espécimen que se caiga.Para mejorar la adherencia, utilice un aplicador roto para hacer un pincel cónico y aplique pintura de plata o carbono en la base y los lados del espécimen. Extienda una línea muy fina de pintura hasta un borde de la superficie de interés. Esto creará un camino de carga desde la superficie de interés hacia tierra.Luego, aplique dos o tres pequeñas gotas de pintura conductora alrededor del perímetro de la pestaña de carbono para establecer un camino conductor desde la superficie de la pestaña hasta el soporte metálico. Esto actúa como tierra. Deje el espécimen aparte y permita que la pintura conductora se seque durante dos horas.Una vez secado, utilice un evaporador de pulverización catódica para aplicar una capa relativamente gruesa de aleación de oro-paladio o de oro sobre la muestra. Se desea un recubrimiento de entre 30 y 40 nanómetros de espesor. Realice la microscopía electrónica de barrido con un voltaje de aceleración relativamente bajo para minimizar los problemas asociados con una mala disipación de carga en la muestra.Utilice el modo de presión variable si está disponible. Primero, aumente la distancia de trabajo para proporcionar suficiente profundidad de campo y enfocar las fibras en la dimensión Z. Para ello, abra la pestaña Navegación en la parte superior derecha.A continuación, acceda a la pestaña Coordenadas desde el menú de la platina. Allí, ingrese un valor mayor para la coordenada Z, como por ejemplo 20 milímetros. Finalmente, presione la pestaña Ir a para ejecutar el cambio.A continuación, coloque la superficie de interés ortogonalmente al haz de electrones. Haga clic y mantenga presionado el botón derecho del ratón, luego deslícelo hacia la izquierda o la derecha para enfocar la muestra cerca del perímetro del plano de superficie preparado de interés. Tome nota de la distancia de trabajo enfocada.Luego, utilizando el joystick de la interfaz de usuario manual, mueva la vista hasta el borde opuesto y repita el método de enfoque. Si la distancia de trabajo ha cambiado, incline la muestra para lograr una aproximación coincidente en ambos puntos. Utilice la pestaña Coordenadas del menú de la platina e ingrese un valor de inclinación en la coordenada T.Ahora, gire la muestra 90 grados ingresando este valor en el campo de coordenadas R. Luego, repita el proceso de inclinación hasta que todas las posiciones estén enfocadas aproximadamente a la misma distancia de trabajo. La técnica descrita se aplicó a tejidos cardíacos de un donante humano de trasplante de corazón no utilizado.La matriz cardíaca humana es una trama intrincada de proteínas entrecruzadas que presenta un patrón similar a un panal en una sección transversal. Cada estructura tipo panal tiene aproximadamente 40 micrones de ancho y normalmente rodea un solo miocito. Cuando están conectados por discos intercalados, varios miocitos cardíacos pueden concebirse como una barra que atraviesa longitudinalmente una forma similar a un túnel.Además de proporcionar información estructural, un MEB de tejidos descelularizados puede permitir una evaluación cualitativa significativa en respuesta a lesiones o formas no lesivas de cardiopatía, como los tejidos cardíacos infartados de un cerdo. En un estudio independiente, se demostró que el isoforma GGF2 de NRG-1 beta podría ser un tratamiento terapéutico potencial para la insuficiencia cardíaca. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo procesar tejido, específicamente tejido cardíaco, para el microscopio electrónico de barrido, incluyendo la técnica para exponer la superficie de interés y para montar el espécimen.Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otras técnicas como espectrometría de masas, secuenciación de ARN y diversos ensayos adicionales para medir proteínas de la matriz extracelular y otras responsables de fenómenos de señalización y observaciones organizacionales. Asimismo, no olvide que el tetraóxido de osmio es un producto químico peligroso debido al potencial de fijación por vapores en las membranas mucosas. Recuerde siempre trabajar en una campana extractora con guantes de nitrilo, utilizando un protector contra salpicaduras o el panel frontal de la campana.

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Investigación

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Biology

Biología

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La mejora en 2D y 3D de la piel<em&gt; In Vitro</em&gt; Uso de modelos macromoleculares hacinamiento

La matriz extracelular desempeña un papel importante en la definición del microambiente de las células y en la modulación del comportamiento y el fenotipo celular. Describimos un método rápido para el aislamiento de matriz extracelular derivada de células, que puede adaptarse a diferentes escalas para estudios microscópicos, bioquímicos, proteómicos o funcionales.

Un rápido, método escalable para el aislamiento, estudio funcional, y análisis de la matriz extracelular derivado de células

Las trampas extracelulares macrófago son una entidad nuevamente descrita. Este artículo se centrará en los métodos de microscopía confocal y cómo son visualizados en vitro y en vivo de las muestras de pulmón.

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

El objetivo de este protocolo es la producción de fibras de la matriz extracelular todo destinados a la reparación de la herida que son adecuados para la evaluación preclínica como parte de un implante de andamio regenerativa. Estas fibras se producen por la cultura de los fibroblastos en las membranas de fibra hueca y extraídas por disolución de las membranas.

Producción de fibras de la matriz extracelular mediante cultivo de células de membrana de fibra hueca sacrificio

Este protocolo presenta un método para la descelularización y posterior formación de hidrogel de almohadillas de grasa mamaria murina después de la irradiación ex vivo.

Estudio de los efectos de radiación de tejido normal con hidrogeles de matriz extracelular

Describimos la preparación de cintas de secciones seriadas y su recolección en soporte de transferencia grande para su uso como muestras de tomografía de matriz, junto con procedimientos de imágenes automatizados en un microscopio electrónico de barrido. El protocolo permite la detección, la recuperación y la obtención de imágenes dirigidas de eventos locales y raros, y la adquisición de grandes volúmenes de datos.

Flujo de trabajo de tomografía de matriz para la adquisición dirigida de información de volumen mediante microscopía electrónica de barrido

El presente protocolo optimiza los métodos de perfusión/descelularización in situ hepática y microscopía de dos fotones para establecer una plataforma confiable para visualizar la dinámica de la remodelación de la matriz extracelular (MEC) durante la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).

Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica

Proponemos un protocolo para evaluar la regeneración ósea en varios niveles jerárquicos. Este enfoque multimodal permite el análisis estructural a diferentes escalas de longitud, abordando eficazmente los desafíos en la preparación de la muestra. También proporciona un flujo de trabajo fiable para evaluar la eficacia de los biomateriales en la promoción de la regeneración ósea.

Enfoque multimodal para evaluar la regeneración ósea y el rendimiento en andamios

Aprende a visualizar la matriz extracelular cardíaca mediante microscopía electrónica de barrido en tejido macerado. Esta técnica cualitativa permite estudiar la organización de la matriz y su relación con fibrosis y cardiomiopatías.

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

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