Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

El objetivo general de este método es visualizar la estructura de la matriz cardíaca en ausencia de células u otros materiales no matriciales. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la fibrosis, especialmente cómo las diferencias en el contenido de la matriz pueden afectar la organización de la matriz, y cómo estos cambios pueden afectar a diferentes miocardiopatías u otras enfermedades fibróticas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una visión cualitativa de la matriz que se puede utilizar para aumentar las medidas cuantitativas.

El Dr. Galindo y el Dr. Sawyer tuvieron la idea de utilizar esta técnica después de descubrir que el tratamiento regular de los cerdos post-infarto tenía cambios en la expresión génica que eran similares a los cambios en el contenido de la matriz después del tratamiento. Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades si no tienen experiencia previa en la preparación de muestras SEM, debido a las habilidades motoras finas requeridas. La muestra de tejido debe ser lo suficientemente grande como para ser vista fácilmente y almacenarse en una solución de glutaraldehído al cuatro por ciento a cuatro grados Celsius.

Retire el pañuelo de papel de la cámara frigorífica y enjuáguelo con agua destilada. Luego, sumerja el tejido en una solución de hidróxido de sodio al 10 por ciento, fresca a partir de gránulos en agua. Asegúrese de tomar las precauciones adecuadas.

Mantenga el tejido en la solución de hidróxido de sodio durante seis a 10 días a temperatura ambiente. Proceda cuando el color del tejido se vuelva blanquecino o blanco. Luego, enjuague el pañuelo con agua destilada hasta que se vuelva transparente.

A continuación, póngase los guantes y sumerja el tejido en ácido tánico al uno por ciento durante cuatro horas a temperatura ambiente. Después del baño de ácido tánico, enjuague el pañuelo con agua destilada durante la noche. En preparación, en una campana extractora con guantes, prepare una solución madre molar 0,2 de tampón de cacodilato de sodio y una solución madre acuosa al dos por ciento de tetróxido de osmio.

Use un protector contra salpicaduras, ya que el tetróxido de osmio es un grave peligro de inhalación. Ahora, haga una dilución de 0,1 molar del tampón de cacodilato de sodio e incube el tejido en él durante cinco minutos con una agitación suave. Cambie el tampón dos veces para lavar el tejido un total de tres veces con cacodilato de sodio.

A continuación, haga una mezcla uno a uno del cacodilato de sodio y el tetróxido de osmio original. Incubar el tejido en la nueva mezcla en un rotador durante una hora. Posteriormente, vuelva a colocar el tejido en cacodilato de sodio 0,1 molar e incube con una suave agitación durante cinco minutos.

Cambie esta solución de baño dos veces durante 15 minutos. A continuación, deshidratar el tejido utilizando una serie de baños de etanol con concentraciones crecientes. Deje el pañuelo en remojo durante 15 minutos en cada baño con una suave agitación.

A continuación, transfiera el tejido y la solución a una placa de Petri poco profunda llena de etanol al 100 por ciento. A continuación, con cuidado, sostenga dos hojas de afeitar muy afiladas de modo que los planos de los lados estén en contacto entre sí y los bordes cortantes se crucen para formar dos lados de un triángulo equilátero sobre el espécimen. Ahora, usa tu mano dominante para colocar la segunda cuchilla en el extremo izquierdo de la muestra y corta hacia la derecha.

Por lo tanto, deslice las cuchillas entre sí desde direcciones opuestas para hacer un solo corte suave con una distorsión o fuerza de desgarro mínimas. El objetivo es exponer una superficie lo más grande posible sin dañar la muestra. Repita el proceso hasta que se preparen suficientes secciones transversales satisfactorias para su examen por SEM.

Con una espátula o pinzas, transfiera el tejido al soporte de muestras del CPD, mientras mantiene el tejido sumergido en etanol al 100 por ciento. El tejido no puede exponerse al aire durante más de unos pocos segundos. Utilice el CPD para reemplazar el etanol con dióxido de carbono líquido y realice el ciclo de secado según lo indicado por el fabricante.

A continuación, prepare un trozo de muestra SEM para cada muestra. Adhera una lengüeta adhesiva de carbono a la superficie superior del trozo de aluminio. Bajo un estereoscopio, adhiera cuidadosamente la muestra a la lengüeta adhesiva con la superficie de la sección transversal de interés hacia arriba, lejos de la lengüeta y lo más plana posible con la superficie del muñón.

No sondee ni toque la superficie de interés. Para los especímenes más pequeños y difíciles, rompa el palo aplicador de madera para usarlo como espátula. Además, trabaje sobre un trozo grande de papel de filtro para evitar perder una muestra caída.

Para mejorar la adherencia, use un aplicador roto para hacer un pincel cónico y aplique pintura plateada o de carbón en la base y los lados de la muestra. Extienda una línea muy delgada de pintura hasta un borde de la superficie de interés. Esto creará una trayectoria de carga desde la superficie de interés hasta el suelo.

Luego, aplica dos o tres pequeñas gotas de pintura alrededor del perímetro de la lengüeta de carbón para proporcionar un camino conductor desde la superficie de la lengüeta hasta el trozo de metal. Esto funciona como el suelo. Deje la muestra a un lado y deje que la pintura conductora se seque durante dos horas.

Una vez seco, opere un recubridor de pulverización catódica para aplicar una capa relativamente pesada de aleación de oro, paladio u oro sobre la muestra. Se desea un recubrimiento de 30 a 40 nanómetros de espesor. Realice la microscopía electrónica de barrido a un voltaje de aceleración relativamente bajo para minimizar los problemas asociados con una mala disipación de carga en la muestra.

Utilice el modo de presión variable si está disponible. En primer lugar, mejore la distancia de trabajo para proporcionar suficiente profundidad de campo para centrarse en las fibras de la dimensión Z. Para hacerlo, abra la pestaña Navegación en la parte superior derecha.

A continuación, acceda a la pestaña Coordenadas desde el menú de la etapa. Allí, introduzca un valor mayor para la coordenada Z, como 20 milímetros. Finalmente, presione la pestaña Ir a para ejecutar el cambio.

A continuación, coloque la superficie de interés ortogonalmente al haz de electrones. Haga clic y mantenga pulsado el botón derecho del ratón y, a continuación, deslícelo hacia la izquierda o hacia la derecha para enfocar la muestra cerca de la periferia del plano de superficie preparado de interés. Tome nota de la distancia de trabajo enfocada.

Luego, usando el joystick de la interfaz de usuario manual, mueva la vista al borde opuesto y repita el método de enfoque. Si la distancia de trabajo ha cambiado, incline la muestra para lograr un acuerdo aproximado en ambas ubicaciones. Utilice la pestaña Coordenadas del menú Escenario e introduzca un valor de inclinación en la coordenada T.

Ahora, gire el espécimen 90 grados introduciendo este valor en el campo de coordenadas R. Luego, repita el proceso de inclinación hasta que todas las posiciones estén enfocadas aproximadamente a la misma distancia de trabajo. La técnica descrita se aplicó a tejidos cardíacos de un donante de trasplante de corazón humano no utilizado.

La matriz cardíaca humana es un intrincado tejido de proteínas reticuladas que tiene un patrón en forma de panal en una sección transversal. Cada estructura de panal tiene aproximadamente 40 micras de ancho, normalmente eludiendo un solo miocito. Cuando están conectados por discos intercalados, se pueden visualizar varios miocitos cardio como una varilla que corre a lo largo a través de una forma de túnel.

Además de proporcionar información estructural, un SEM de tejidos descelularizados puede permitir una evaluación cualitativa significativa en respuesta a lesiones o formas no lesivas de miocardiopatía, como los tejidos cardíacos infartados de un cerdo. En un estudio separado, se demostró que la isoforma GGF2 de NRG-1 beta es un tratamiento terapéutico potencial para la insuficiencia cardíaca. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo procesar tejido, tejido cardíaco, para el microscopio electrónico de barrido, incluida la técnica para exponer la superficie de interés y para montar la muestra.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otras técnicas como la espectrometría de masas, la secuenciación de ARN y varios otros ensayos para medir las proteínas de la matriz extracelular y otros responsables de la señalización y otros fenómenos de observación organizacional. Además, no olvide que el tetróxido de osmio es un producto químico peligroso, debido al potencial de fijación de vapor de las membranas mucosas. Recuerde siempre trabajar en una campana extractora con guantes de nitrilo, utilizando un protector contra salpicaduras o una hoja de capucha.