Generación de células epiteliales de las vías respiratorias del ratón ESC-Obtenido usando Descelularizado pulmón andamios

El objetivo general de este procedimiento es dirigir la diferenciación de células madre embrionarias de ratón en células epiteliales maduras de las vías respiratorias, utilizando un cultivo 3D configurado con andamios pulmonares descelularizados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el área del desarrollo pulmonar, como el papel de las contracciones de la matriz celular y la señalización del factor de crecimiento durante la diferenciación del linaje pulmonar. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un sistema de cultivo 3D en un entorno definido libre de suero, y logra una diferenciación epitelial robusta de las vías respiratorias con una contaminación limitada de otros linajes de endodermos. Después de sacrificar a una rata wistar adulta, de acuerdo con el protocolo de texto, asegure al animal a una superficie de disección fijando las patas delanteras y traseras, y use etanol al 70% para rociar el pecho y el abdomen. Crea una incisión justo debajo de la caja torácica. Corta la piel y expone el diafragma. Luego, haga pequeñas incisiones a través del diafragma para hacer que los pulmones se retraigan, lo que reduce la posibilidad de perforar los pulmones. A continuación, crea una incisión vertical a lo largo del esternón y abre la cavidad torácica para acceder al corazón y a los pulmones. Luego, con una sutura, ligar la vena cava inferior y usar pequeñas tijeras de disección para colocar una pequeña incisión en la aurícula izquierda. Usando una jeringa preparada de 10 ml con una aguja de calibre 25 llena de solución salina heparinizada de Hank's Balance, inicie la perfusión pulmonar insertando la aguja en el ventrículo derecho y empuje el tampón a través de la circulación pulmonar. Continúe la perfusión hasta que los pulmones se vuelvan blancos y el líquido que fluye de la aurícula izquierda salga claro. Después de la perfusión, exponga la tráquea y haga una pequeña incisión cerca del cartílago tiroideo para la canulación. Luego, con un catéter de plástico, canula la tráquea y use una sutura para asegurarla en su lugar. Ahora, configure un sistema de perfusión por gravedad fijando una jeringa de 10 ml a un soporte de retorta y una abrazadera. Luego, retire y deseche el émbolo de la jeringa. Asegure el punto máximo de llenado en el cilindro de la jeringa a 20 cm por encima de los pulmones, luego conecte una llave de paso bidireccional al extremo de la jeringa y un tubo de plástico largo al otro extremo de la llave de paso. Extraiga suavemente el catéter de la tráquea y conéctelo al extremo del tubo de plástico. Luego, vierta la solución de descelularización en la jeringa y deje que la solución llene completamente el tubo de plástico y el catéter adjuntos. Vuelva a colocar el catéter lleno de solución en la tráquea y lave los pulmones llenándolos hasta su capacidad pulmonar total durante un minuto. Luego, retire el catéter de la tráquea para permitir que el líquido fluya fuera de los pulmones. Repita el lavado de los pulmones ocho veces con solución de descelularización, seguido de diez enjuagues con PBS. Los pulmones aparecerán blancos con la finalización de los pasos de lavado. A continuación, diseccionar la tráquea y los pulmones del cuello y la cavidad torácica. Extraer el exceso de tejido de los pulmones disecados, incluidos el esófago y el corazón, y luego transferir los pulmones al PBS frío hasta que esté listo para la sección con vibratome. Para preparar secciones gruesas, haga aproximadamente 15 ml de agarosa de 2% y 4% de bajo punto de fusión en PBS, y suficiente 6% de agarosa para incrustar todos los lóbulos en pequeños bloques rectangulares. Después de transferir la agarosa a tubos de 15 ml, coloque los tubos en un bloque de calor y mantenga la temperatura por encima de los 40 grados centígrados para evitar la gelificación. Con unas tijeras pequeñas, diseccione el pulmón descelularizado en el extremo de cada bronquio lobar y separe cada lóbulo. A continuación, utilice láminas absorbentes para eliminar el exceso de PBS y transfiera los lóbulos al 2% de agarosa en el bloque calefactor durante cinco minutos para cubrir el tejido. Después de transferir cada lóbulo a una placa de Petri, coloque la placa en una placa fría y deje que la superficie se gelifique durante un minuto. Coloque suavemente los lóbulos en 4% de agarosa y, después de incubar durante cinco minutos y enfriarse, repita el recubrimiento con 6% de agarosa. Después del recubrimiento, use moldes de base de metal para incrustar cada lóbulo por separado en 6% de agarosa, con al menos 3 ml de agarosa rodeando el tejido desde los bordes. A continuación, con pinzas, oriente cada lóbulo colocando el borde plano más grande del tejido en la superficie del molde de metal frente al experimentador, y complete la incrustación con casetes de plástico. Deje que los bloques se gelifiquen en una placa fría durante al menos 30 minutos antes de seccionar el vibratome. Alternativamente, almacene los bloques en una cámara humidificada hasta por 12 horas a cuatro grados centígrados antes del corte del vibratomo. Para preparar las secciones, configure el vibratomo llenando la cámara de sección con PBS frío. Establezca un baño de hielo circundante para mantener una temperatura fría durante todo el corte. Ahora, retira los bloques de los moldes de metal y usa una cuchilla de afeitar para recortar el exceso de agarosa que rodea los lóbulos, mientras te mantienes aproximadamente a tres milímetros del borde del tejido. Con adhesivo, fije el tejido al centro de la placa de muestra y sumerja la placa en la cámara de sección llena de PBS. Cargue la cuchilla de corte en el vibrátomo. Establezca los límites de sección en el vibrátomo, seleccionando los siguientes valores de velocidad, amplitud y grosor respectivamente. Separe cada lóbulo por completo, y si las secciones no están completamente separadas entre sí, use unas tijeras pequeñas para cortar manualmente las secciones. Luego, recoja suavemente las secciones del andamio y transfiéralas a PBS frío. Con pinzas, libere suavemente cada sección de la agarosa circundante. Para descontaminar las secciones del andamio, después de transferirlas de PBS a los tubos de microcentrífuga, agregue 90 unidades por mililitro de nucleasa en PBS e incube en un rotador a temperatura ambiente durante 12 a 24 horas. Después de transferir las secciones a nuevos tubos de microcentrífuga, de acuerdo con el protocolo de texto, en condiciones estériles agregue solución antimicrobiana e incube en un rotador a temperatura ambiente durante seis horas. Luego, en condiciones estériles, use PBS para enjuagar los andamios dos veces y transfiéralos a un medio libre de suero, o SFDM, antes de sembrar con células. Para establecer un cultivo de interfaz aire-líquido, use pinzas estériles para colocar membranas hidrofóbicas en una placa de Petri. Luego, transfiera cada sección de andamio descelularizado de SFDM a una membrana, asegurándose de que las secciones se distribuyan uniformemente en la membrana. Prepare placas de seis o doce pocillos llenando los pocillos con 1 ml o 0,5 ml de SFDM respectivamente. Luego, coloque suavemente las membranas en los pocillos, permitiendo que la membrana flote sobre el medio creando una configuración de cultivo de aire líquido. Para sembrar andamios 3D, después de la preparación de las células endodérmicas y la clasificación de células activadas por fluorescencia, para enriquecer y obtener un endodermo definitivo, use un hemocitómetro para contar las células clasificadas. A continuación, gire las celdas a 400 G durante cinco minutos. Usando SFDM, vuelva a suspender las celdas peletizadas a aproximadamente 100, 000 celdas en 10