Name: Generación de células epiteliales de las vías respiratorias del ratón ESC-Obtenido usando Descelularizado pulmón andamios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprende a diferenciar células madre embrionarias de ratón en epitelio maduro de vías respiratorias usando andamios pulmonares descelularizados en 3D. Este método mejora la especificación del linaje pulmonar en condiciones definidas sin suero.

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Deseamos agradecer al Dr. Rossant y el Dr. Bilodeau para el CES mCherry NKX2-1 utilizado en los experimentos representados en las figuras 1-3. FACS se realizó en las instalaciones de SickKids-UHN Citometría de Flujo. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de funcionamiento de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y una subvención de la infraestructura (CSCCD) de la Fundación Canadiense de la Innovación.

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales del Hospital for Sick Children Research Institute. 1. Preparación Andamios <ol><li> Descelularización de pulmones <ol><li> La eutanasia a las ratas Wistar adultas utilizando cámara de CO 2. Lugar de los animales en la cámara y empezar a 100% la exposición al CO 2 a una velocidad de llenado del 10-30% del volumen de la cámara por minuto. <ol><li> Observar animales de la inconsciencia; esto ocurrirá después de aproximadamente 2-3 minutos. Si la inconsciencia no se produce en este período de tiempo, comprobar la tasa y el sello de la cámara de llenado. Después de la inconsciencia, observar animales de color de los ojos se desvaneció y la falta de respiración. Si se observan tanto, mantener el CO 2 de llenado durante 1-2 minutos y luego retirar los animales de la cámara para el procedimiento. </li></ol></li><li> Asegure animal para la disección de la superficie mediante la fijación de las patas delanteras y patas traseras, y rocíe el pecho y la zona del abdomen con 70% de etanol. Acceder al corazón y luNGS mediante la apertura de la cavidad torácica mediante una incisión vertical a lo largo del esternón. </li><li> Hacer pequeñas incisiones a través de diafragma primero para hacer que los pulmones se retraigan, reduciendo la posibilidad de perforar los pulmones. Ligar la vena cava inferior con una sutura y colocar una pequeña incisión en la aurícula izquierda con pequeñas tijeras de disección. </li><li> Usando una jeringa de 10 ml preparada con una aguja 25 G lleno de solución salina equilibrada heparinizada de Hank (HBSS) (10 U / ml de heparina en HBSS), iniciar la perfusión pulmonar mediante la inserción de la aguja en el ventrículo derecho para empujar el tampón a través de la circulación pulmonar (velocidad de 2 ml / min). Continuar este procedimiento hasta que los pulmones se vuelven blancos y el fluido que fluye desde la aurícula izquierda salga clara. </li><li> Tras la perfusión, exponer la tráquea y canular con un catéter de plástico cerca del cartílago tiroides y seguro en su lugar con una sutura. </li><li> Configuración de un sistema de perfusión por gravedad mediante la fijación de una jeringa de 10 ml a un soporte vertical y la abrazadera. Retire y démbolo de la jeringa iscard. Protección del punto máximo de llenado de cilindro de la jeringa a 20 cm por encima de los pulmones. Coloque una llave de paso de dos vías para el extremo de la jeringa, y un largo tubo de plástico para el otro extremo de la llave de paso para la entrega de solución de descelularización a la tráquea canulado. Verter la solución en la jeringa y permita que la solución para llenar tubo de plástico unido y el catéter. <ol><li> Lavado de los pulmones llenando a capacidad pulmonar total (aproximadamente 12 ml) durante 1 min y retirar el catéter de plástico de la tráquea para permitir que el fluido fluya fuera de los pulmones. No llenar jeringas más de 10 ml cuando lavaging pulmones para mantener la presión por debajo de 20 cm de H2O </li></ol></li><li> Repetir el lavado de pulmones ocho veces con solución de descelularización, seguido de 10 lavados con solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Diseccionar la tráquea y los pulmones libre de la cavidad del cuello y el pecho y retirar del animal. Mantener el tejido en PBS frío a 4 ° C hasta su preparación para sí vibratomectioning. </li></ol></li><li> generación de sección gruesa <ol><li> Preparar aproximadamente 15 ml de 2% y 4% (w / v) de agarosa, y lo suficientemente 6% (w / v) de agarosa para incrustar todos los lóbulos en pequeños bloques rectangulares. Disuelva el polvo de agarosa de bajo punto de fusión en PBS en el microondas. La transferencia de la agarosa para tubos de 50 ml en un bloque de calor y mantener la temperatura por encima de 40 ° C para evitar la gelificación. </li><li> Diseccionar pulmonar descelularizado al final de cada bronquio lobar para separar cada lóbulo (craneal, medio, accesorio, y los lóbulos caudal derecho y el lóbulo izquierdo) usando unas tijeras pequeñas. Pat secar cada lóbulo usando hojas absorbentes para eliminar el exceso de PBS y colocar dentro de 2% (w / v) de agarosa, mientras que en el bloque de calentamiento. </li><li> Retire cada lóbulo después de 5 minutos de recubrimiento de agarosa, colocar en una placa de Petri y dejar que la superficie del gel por 1 min en un plato frío. </li><li> colocar suavemente lóbulos de nuevo en 4% (w / v) de agarosa, fresco después de 5 min, y repetir recubrimiento una vez más con el 6% (w / v) de agarosa. </li><li> Después de co secuencialIONES de cada lóbulo, incrustar cada lóbulo separado en 6% (w / v) de agarosa usando moldes de base de metal con al menos 3 mm de agarosa que rodea el tejido de los bordes. Orient cada lóbulo usando fórceps mediante el posicionamiento más grande borde plano del lóbulo en la superficie del molde de metal hacia el experimentador. Este borde será el lado fijo a la placa de muestra para vibratome seccionamiento. </li><li> Permitir a los bloques de gel en placa fría durante al menos 30 minutos antes de seccionar con vibratome. Guarde los bloques en una cámara húmeda durante un máximo de 12 horas a 4 ° C antes de seccionar vibratome. </li><li> Configuración del vibrátomo llenando la cámara de seccionamiento con PBS frío 12. Mantener la temperatura fría a lo largo de seccionamiento con el baño de hielo circundante. Retire los bloques de moldes de metal y el uso de una hoja de afeitar para cortar el exceso de agarosa que rodea lóbulos, mientras se mantiene aproximadamente 3 mm desde el borde del tejido. </li><li> Fijar tejido al centro de la placa de muestra usando un adhesivo, y sumergir la placa en tél PBS-llenado cámara de seccionamiento. Configuración de seccionamiento límites en vibratome mediante la selección de los siguientes valores de la velocidad, amplitud, y espesor respectivamente: 0,2 mm / seg, 1,85 mm, y 350 micras. Nota: Tanto la sección longitudinal y transversal de la orientación del lóbulo son aceptables. </li><li> Sección cada lóbulo completamente. Manualmente secciones cortadas gratis con pequeñas tijeras si un tramo no está separado por hoja al final de la secuencia de la sección. Recoger las secciones de andamios con cuidado y mantenerse en PBS en hielo hasta el siguiente paso. Nota: Secciones generados incluirán tanto en las zonas proximal y distal del pulmón y ambas fuentes se pueden utilizar para recelularización; sin embargo, la mayor parte de la superficie abarcará pulmón distal. </li></ol></li><li> Descontaminación de las secciones de andamios <ol><li> Transferir las secciones de andamios de espesor 350 micrones de PBS para tubos de microcentrífuga (hasta 30 secciones / tubo) y se trata con nucleasa (90 U / ml en PBS) (ver Lista de Materiales) por 12 - 24 horas a temperatura ambiente, enun rotador. </li><li> Después del tratamiento con nucleasa, las secciones de transferencia utilizando fórceps para nuevos tubos de microcentrífuga y se trata con solución antimicrobiana (200 U / ml de penicilina estreptomicina y 25 mg / ml de anfotericina B en PBS) en condiciones estériles durante 6 horas a temperatura ambiente, en un rotador. Nota: Los andamios se pueden almacenar en solución antimicrobiana durante un máximo de una semana a 4 ° C antes de su uso. </li><li> Después de la etapa de descontaminación con solución antimicrobiana, enjuague andamios dos veces con PBS en condiciones estériles y transferir a suero libre de medio de diferenciación (SFDM) antes de la siembra con células. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de células Endodérmico <ol><li> El endodermo definitivo de inducción <ol><li> Mantener las líneas de ratón ESC menores, cultivo libre de suero sin alimentador usando condiciones 2i 13. Iniciar la inducción endodermo mediante la eliminación de las células pluripotentes a partir de la cultura adherentes mediante tripsinización. </li><li> Resuspender las células en SFDM y las semillas a una densidad de 20.000células / ml en placas adherentes bajas durante tres días sin cambio de medio para permitir la formación de EB. </li><li> Después de tres días transfieren suavemente las EB en 50 ml tubos cónicos con una pipeta de 10 ml y dejar que se recogen en la parte inferior durante 3 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Adecuadamente el material aspirado y añadir medios SFDM fresco suplementado con 50 ng / ml de activina A. </li><li> Se siembran las células posterior en las placas adherentes bajas en una proporción 1: 2 densidad y la cultura durante tres días adicionales para alcanzar una diferenciación endodermo definitivo. </li></ol></li><li> enriquecimiento de endodermo definitivo <ol><li> Recoger el día 6 EBS, disociar con tripsina y la etiqueta de c-KIT y la expresión de CXCR4 utilizando anticuerpos conjugados fluorescentes 14. </li><li> Ordenar las células marcadas utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para la expresión de ambos marcadores para obtener una población enriquecida endodermo definitivo 15. </li></ol></li></ol> 3. Configuración recelularización <ol><li> interfase aire-líquidoconfiguración de la cultura <ol><li> Transferir cada sección de esqueleto descelularizado (paso 1.2.9) de SFDM a una membrana flotante hidrófobo (8 micras de tamaño de poro) usando pinzas estériles. Asegurar andamio secciones se distribuyen de manera uniforme en la membrana. </li><li> Preparar 6- o placas de 12 pocillos, llenando los pocillos con 1 o 0,5 ml de SFDM, respectivamente. Con cuidado, coloque las membranas en los pozos, lo que permite la membrana flote en la parte superior de los medios de comunicación, la creación de una configuración de la cultura aire-líquido. </li></ol></li><li> La siembra de los andamios 3D <ol><li> FACS siguientes marcadores de endodermo definitivo (paso 2.2.2) cuentan células clasificadas utilizando un hemocitómetro, dejen de girar a 400 xg durante 5 minutos y se vuelve a suspender en SFDM. Resuspender las células para obtener un volumen que contiene aproximadamente 100.000 células / 10 l / andamios. </li><li> Para recellularize andamios, pipeta de 10 l de células directamente en cada sección preparada desde el paso 3.1.2. </li><li> Sustitución de los medios SFDM en cultivos cada 48 horas. Aspirar los viejos medios de comunicación mediante la celebración de la placa con una ligera inclinacióna fin de no perturbar la cultura. Añadir lentamente SFDM fresco a la cultura a lo largo del lado del pozo para evitar el hundimiento de la membrana flotante. </li><li> Mantener los cultivos al aire líquido hasta por 21 días para lograr la diferenciación de las células sembradas en los epitelios de las vías respiratorias madura. Nota: recelularizado secciones pueden ser procesadas para la tinción de tejidos y de inmunofluorescencia microscopía (IF) en cualquier punto de tiempo durante el cultivo celular 16. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+dynamics+in+development+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine.</a> J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).</li>
<li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li>
<li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+lung+de-cellularization+protocol+supports+embryonic+stem+cell+differentiation+in+vitro+and+following+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation.</a> Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+purified+lung+and+thyroid+progenitors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Gilpin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Lung+Epithelial+Specification+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+on+Decellularized+Lung+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Annal.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix.</a> Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).</li>
<li>Princivalle, M., De Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+roles+of+heparan+sulfate+proteoglycans%3A+a+comparative+review+in+Drosophila%2C+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human.</a> Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).</li>
<li>Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+lung+morphogenesis%3A+The+elephant+in+the+room%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+Part+C%2C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room.</a> Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li>
<li>Ying, Q. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Fox, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Culture+and+FGF+Signaling+Drive+Differentiation+of+Murine+Pluripotent+Cells+to+Distal+Lung+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Shojaie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+lung+scaffolds+direct+differentiation+of+endoderm+to+functional+airway+epithelial+cells%3A+requirement+of+matrix-bound+HS+proteoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans.</a> Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).</li>
<li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Derivation+of+Purified+Lung+and+Thyroid+Progenitors+from+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+mouse+embryo+atlas+based+on+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT.</a> Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).</li>
</ol>

No hay intereses financieros en competencia para declarar.

El protocolo descrito aquí genera epitelios de las vías respiratorias derivadas de CES maduros utilizando sólo los andamios pulmón natural para dirigir la diferenciación con ningún otro suplementación. Esta configuración se define la cultura, y barato, y reproducible libre de suero. No se requiere un factor de crecimiento de la suplementación del medio de diferenciación base. Métodos publicados anteriormente para la generación de células epiteliales de pulmón de células madre derivadas han utilizado estrategias de 2 dim...

Diferenciación dirigida de células pluripotentes a la estirpe de pulmón depende de eventos de señalización precisos en el microambiente 1,2. Debido a la naturaleza dinámica de este proceso que ha sido un reto para imitar los acontecimientos precisos de la organogénesis de pulmón in vitro. Los informes recientes han utilizado estrategias de restricción de linaje por etapas con el factor de crecimiento soluble suplementación de los cultivos de dos dimensiones para lograr la diferenciación de pulmón 3-8. En protocolos de diferenciación por etapas, las células pluripotentes, si las células madre embrionarias (ESC) o células madre pluripotentes inducidas, se diferenciaron primero en la capa de germen de endodermo definitivo. células endodérmicas fueron empujados posteriormente a un destino endodermo anterior y, posteriormente, a las células progenitoras de pulmón, como se identifica por la expresión del factor de transcripción que contiene homeodominio-NKX2-1. Estos progenitores de pulmón se diferenciaron adicionalmente a proximal (vía aérea) o células epiteliales de pulmón distales (alveolares) wiTH continuó suplementos de factores de crecimiento. Tales estrategias de 2 dimensiones han tenido cierto éxito en la generación de las células epiteliales del pulmón, sin embargo, hay varias limitaciones, incluyendo las eficiencias poco claros, la posible contaminación de otros de origen endodérmico, la falta de una estructura de 3 dimensiones (3D), y en algunos casos uso de cultivos indefinidos con suplementos de suero. Cultura de pluripotentes células diferenciadas o en andamios pulmonares descelularizados se utiliza cada vez más como un ensayo para evaluar el potencial regenerativo de las células sembradas en la formación de estructuras epiteliales del pulmón 3,5,6,8,9. Tales informes cultura células sembradas en andamios con factor de crecimiento continuo o de suplementos de suero. desarrollo de pulmón implica la división, migración, la expresión génica y la diferenciación de las células individuales en respuesta a señales ambientales. La matriz extracelular (ECM) es un entramado de glicoproteínas que además de proporcionar soporte estructural, dirige tissue morfogénesis mediante la integración y la regulación de estos procesos 10,11. Al utilizar el andamio ECM de pulmón como una plataforma natural para la cultura endodermo para imitar mejor el entorno de desarrollo de pulmón in vivo, hemos generado células madre epiteliales de las vías respiratorias derivadas de células en un cultivo definido 3D-ajuste con alta eficiencia y reproducibilidad. Rata andamios ECM pulmonares fueron generados por descelularización, así como células endodérmicas derivados de ESC de ratón fueron generados y posteriormente sembradas en estos andamios. expresión dual de CXCR4 y proteínas c-KIT indica una identidad celular endodermo definitivo y células positivas tanto para Sox2 y expresión NKX2-1 son identificadas como células de las vías respiratorias (pulmonares proximales) progenitoras. Las células del endodermo definitivo se cultivaron en la interfase aire-líquido (ALI) para un máximo de tres semanas para generar células epiteliales de las vías respiratorias funcional in vitro. Este protocolo promueve la diferenciación de pulmón linaje de definitiva endodermo a los 7 días, observados con la aparición de NKX2-1 + / + Sox2 progenitores tempranos pulmonares proximales. Para el día 14 y 21 de las poblaciones de células epiteliales de las vías respiratorias maduros cultivo emergen incluyendo ciliadas (TUBB4A +), club (SCGB1A1 +) y células basales con semejanza morfológica y funcional de las vías respiratorias de ratones nativos (+ TRP63, KRT5 +). Este protocolo demuestra la importancia del microambiente 3D de matriz para lograr la diferenciación robusto a las vías respiratorias células epiteliales.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes>Reactivos</solución ></td>perfusión fuerte Sigma H0777 10 U/ml heparina Solución de perfusión Gibco 14170112 disuelto en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS-)Solución de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>descelularización</td><td>BioShop</td><td>CHA003</td><td>8&nbsp; mM CHAPS Solución de</td></tr><tr><td>descelularización</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td>25&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>Solución de descelularización</td><td>BioShop</td><td>SOD002</td><td>1&nbsp; M NaCl</td></tr><tr><td>Solución de descelularización</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>disuelta en PBS</td></tr><tr><td>Benzonase nucleasa</td><td>Novagen</td><td>70664-3</td><td>90&nbsp; U/ml de benzonasa nucleasa&nbsp;</td></tr><tr><td>Benzonasa nucleasa</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>diluida en PBS</td></tr><tr><td>Solución antimicrobiana&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>200&nbsp; U/ml de solución antimicrobiana de penicilina estreptomicina</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290</td><td>25&nbsp; &mu; g/ml de anfotericina B</td></tr><tr><td>solución antimicrobiana&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>diluido en PBS</td></tr><tr><td>Tripsinización&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>TrypLE</td></tr><tr><td>Medios de diferenciación libres de suero (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>IMDM 2440-053, F12 11765-054</td><td>Proporción 3:1 de IMDM y Jamón' s medio F12 modificado</td></tr><tr><td>Medios de diferenciación libres de suero (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>12587-010 Suplemento de</td><td>B27 (dilución 50x)</td></tr><tr><td>Medios de diferenciación libre de suero (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Suplemento de N2 (dilución 100x)</td></tr><tr><td>Medios de diferenciación libre de suero (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>Albúmina sérica bovina al 0,05% (fracción V)</td></tr><tr><td>Medios de diferenciación libre sérico (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>200&nbsp; mM Glutamax</td></tr><tr><td>Medios de diferenciación libres de suero (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>4&nbsp; &mu; M monotioglicerol</td></tr><tr><td>Medios de diferenciación libre sérico (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>A4403&nbsp;</td><td>0.05&nbsp; mg/ml ácido ascóbico</td></tr><tr><td>Inducción endodermo</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF</td><td>Activina A</td></tr><tr><td><Anticuerpos fuertes></CDH1 fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Ratón BD Bioscience</td><td>610181</td> s<td>, no conjugado, 1:100</td></tr><tr><td>C-KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>558163</td><td>rata, PE-Cy7, 1:100</td></tr><tr><td>CXCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>558644</td><td>Rata, APC, 1:100</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab24647</td><td>Conejo, no conjugado, 1:1.000</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>Conejo, no conjugado, 1:200</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td>Conejo, no conjugado, 1:200</td></tr><tr><td>SCGB1A1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9772&nbsp;</td><td>Cabra, no conjugada, 1:1.000</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>R& D Sistemas</td><td>AF2018&nbsp;</td><td>Cabra, no conjugada, 1:400</td></tr><tr><td>TRP63</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8431</td><td>Ratón, no conjugado, 1:200</td></tr><tr><td>TUBB4A</td><td>BioGenex</td><td>MU178-UC</td><td>Ratón, no conjugado, 1:500</td></tr><tr><td>Cabra IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>Burro, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Ratón IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>Burro, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Ratón IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Burro, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>Conejo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Burro, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Conejo IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>Burro, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td><fuerte>Otros materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de baja adherencia</td><td>Nunc Z721050</td><td>&nbsp;</td><td>Placas de unión de celda baja,&nbsp; 6 pocillos&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Membranas de interfaz aire-líquido&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>110614</td><td>membrana nucleóforo hidrofóbica, 8&nbsp; &mu; m tamaño de poro</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica VT1200S</td><td>&nbsp;</td><td>Leica Vibratome</td></tr><tr><td>Adhesivo de tejido</td><td>Ted Pella</td><td>10033</td><td>Adhesivo de tejido Pelco</td></tr></tbody></table>

generación de células epiteliales de las vías respiratorias del ratón esc-obtenido usando descelularizado pulmón andamios

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Pulmón diferenciación linaje requiere la integración de las señales ambientales complejos que incluyen el factor de crecimiento de señalización, las interacciones célula-célula y las interacciones célula-matriz. Debido a esta complejidad, la recapitulación del desarrollo del pulmón in vitro para promover la diferenciación de las células madre a las células epiteliales del pulmón ha sido un reto. En este protocolo, los andamios de pulmón descelularizados se utilizan para imitar el entorno de 3 dimensiones del pulmón y generar células epiteliales de las vías respiratorias derivadas de células madre. células madre embrionarias de ratón se diferencian en primer lugar al linaje endodermo utilizando un método de cultivo cuerpo embrioides (EB) con las células del endodermo activina A. continuación, se siembran en los andamios descelularizado y se cultivaron a la interfaz aire-líquido hasta por 21 días. Esta técnica promueve la diferenciación de las células sembradas a las células epiteliales de las vías respiratorias funcional (células ciliadas, células club, y células basales) sin suplementación adicional del factor de crecimiento. Esta configuración se define la cultura, Seru-M libre, barato y reproducible. Aunque no existe una contaminación limitada de linajes endodermo no pulmonares en la cultura, este protocolo sólo genera poblaciones epiteliales de las vías respiratorias y no da lugar a las células del epitelio alveolar. epitelios de las vías respiratorias generados con este protocolo se pueden utilizar para estudiar las interacciones célula-matriz durante la organogénesis de pulmón y para el modelado de la enfermedad o plataformas de descubrimiento de medicamentos de patologías relacionadas con las vías respiratorias, tales como fibrosis quística.

Como se describe en este protocolo, la diferenciación robusta del endodermo definitivo para madurar las vías respiratorias células epiteliales, se pueden obtener mediante el cultivo prolongado de células sembradas en las secciones de andamios de pulmón descelularizados. Se recomienda que los andamios descelularizados caracterizarse para asegurar (1) células huésped se eliminan por completo, y (2) proteínas de la matriz extracelular se conservan antes de utilizar andamios para la diferenc...

Este protocolo dirige eficientemente madre embrionarias de ratón endodermo definitivo derivado de las células de las vías respiratorias para madurar las células epiteliales. Esta técnica utiliza la diferenciación 3 dimensiones andamios pulmonares descelularizados para dirigir especificación linaje de pulmón, en un entorno de cultivo definido, libre de suero.

Generación de células epiteliales de las vías respiratorias del ratón ESC-Obtenido usando Descelularizado pulmón andamios

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

El objetivo general de este procedimiento es dirigir la diferenciación de células madre embrionarias de ratón hacia células epiteliales de las vías respiratorias maduras, utilizando un sistema de cultivo tridimensional con andamiajes pulmonares descelularizados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo pulmonar, como el papel de las contracciones matriz-celulares y la señalización de factores de crecimiento durante la diferenciación hacia la linaje pulmonar. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un sistema de cultivo 3D en un entorno definido y libre de suero, logrando una diferenciación epitelial de las vías respiratorias robusta con contaminación limitada por otras líneas endodérmicas. Tras la eutanasia de una rata Wistar adulta, según el protocolo descrito, sujete el animal a una superficie de disección fijando las patas delanteras y traseras, y use etanol al 70 % para rociar el tórax y el abdomen. Realice una incisión justo por debajo de la caja torácica. Corte la piel y exponga el diafragma. A continuación, haga pequeñas incisiones en el diafragma para provocar la retracción de los pulmones, reduciendo así el riesgo de perforarlos. Luego, realice una incisión vertical a lo largo del esternón y abra la cavidad torácica para acceder al corazón y a los pulmones. Con una sutura, ligue la vena cava inferior y use pequeñas tijeras de disección para hacer una pequeña incisión en la aurícula izquierda. Utilizando una jeringa preparada de 10 ml con una aguja de calibre 25 llena con solución salina equilibrada de Hank con heparina, inicie la perfusión pulmonar insertando la aguja en el ventrículo derecho y empujando el tampón a través de la circulación pulmonar. Continúe la perfusión hasta que los pulmones adquieran un color blanco y el líquido que fluye desde la aurícula izquierda salga transparente. Tras la perfusión, exponga la tráquea y haga una pequeña incisión cerca del cartílago tiroides para la canulación. Luego, canule la tráquea con un catéter plástico y use una sutura para fijarlo en su lugar. Ahora, prepare un sistema de perfusión por gravedad sujetando una jeringa de 10 ml a un soporte universal con pinza. A continuación, retire y deseche el émbolo de la jeringa. Fije el punto máximo de llenado del cuerpo de la jeringa a 20 cm por encima de los pulmones, luego conecte una llave de paso de dos vías al extremo de la jeringa y un tubo plástico largo al otro extremo de la llave. Retire suavemente el catéter de la tráquea y conéctelo al extremo del tubo plástico. Vierta la solución descelularizante en la jeringa y permita que la solución llene completamente el tubo plástico y el catéter conectados. Vuelva a colocar el catéter lleno de solución en la tráquea y lave los pulmones llenándolos hasta la capacidad pulmonar total durante un minuto. Luego, retire el catéter de la tráquea para permitir que el líquido salga de los pulmones. Repita el lavado pulmonar ocho veces con la solución descelularizante, seguido de diez enjuagues con PBS. Los pulmones aparecerán blancos tras completar los pasos de lavado. A continuación, diseccione la tráquea y los pulmones del cuello y la cavidad torácica. Retire el tejido excesivo de los pulmones diseccionados, incluyendo el esófago y el corazón, y transfiera los pulmones a PBS frío hasta su preparación para el corte con vibrátomo. Para preparar secciones gruesas, prepare aproximadamente 15 ml de agarosa al 2 % y al 4 % de punto de fusión bajo en PBS, y suficiente agarosa al 6 % para embeber todos los lóbulos en pequeños bloques rectangulares. Tras transferir la agarosa a tubos de 15 ml, coloque los tubos en un bloque calefactor y mantenga la temperatura por encima de 40 grados centígrados para evitar la gelificación. Con tijeras pequeñas, diseccione el pulmón descelularizado en el extremo de cada bronquio lobular y separe cada lóbulo. Luego, use hojas absorbentes para eliminar el exceso de PBS y transfiera los lóbulos a agarosa al 2 % sobre el bloque calefactor durante cinco minutos para recubrir el tejido. Tras transferir cada lóbulo a una placa de Petri, coloque la placa sobre una placa fría y permita que la superficie se geles durante un minuto. Coloque suavemente los lóbulos en agarosa al 4 %, y tras incubar durante cinco minutos y enfriar, repita el recubrimiento con agarosa al 6 %. Tras el recubrimiento, use moldes metálicos base para embeber cada lóbulo por separado en agarosa al 6 %, con al menos 3 ml de agarosa rodeando el tejido desde los bordes. A continuación, con pinzas, oriente cada lóbulo colocando el borde plano más grande del tejido en la superficie del molde metálico, orientado hacia el experimentador, y complete el embebido usando casetes plásticos. Deje que los bloques se gelesen sobre una placa fría durante al menos 30 minutos antes del corte con vibrátomo. Alternativamente, almacene los bloques en una cámara humedecida hasta por 12 horas a cuatro grados centígrados antes del corte con vibrátomo. Para preparar secciones, configure el vibrátomo llenando la cámara de corte con PBS frío. Prepare un baño de hielo circundante para mantener una temperatura fría durante todo el proceso de corte. Ahora, retire los bloques de los moldes metálicos y use una cuchilla de afeitar para recortar el exceso de agarosa que rodea los lóbulos, manteniendo aproximadamente tres milímetros desde el borde del tejido. Con adhesivo, fije el tejido al centro de la placa de muestra y sumerja la placa en la cámara de corte llena de PBS. Coloque la cuchilla de corte en el vibrátomo. Establezca los límites de corte en el vibrátomo seleccionando respectivamente los siguientes valores de velocidad, amplitud y grosor. Corte completamente cada lóbulo, y si las secciones no se separan completamente entre sí, use tijeras pequeñas para cortar manualmente las secciones. Luego, recoja cuidadosamente las secciones del andamiaje y transfiéralas a PBS frío. Con pinzas, libere suavemente cada sección del agarosa circundante. Para descontaminar las secciones del andamiaje, tras transferirlas de PBS a tubos de microcentrifugado, añada 90 unidades por mililitro de nucleasa en PBS e incube en un rotador a temperatura ambiente durante 12 a 24 horas. Tras transferir las secciones a nuevos tubos de microcentrifugado, según el protocolo descrito, bajo condiciones estériles añada solución antimicrobiana e incube en un rotador a temperatura ambiente durante seis horas. Luego, bajo condiciones estériles, use PBS para enjuagar los andamiajes dos veces y transfiéralos a medio libre de suero, o SFDM, antes de sembrar las células. Para establecer un cultivo en interfase aire-líquido, use pinzas estériles para colocar membranas hidrófobas en una placa de Petri. A continuación, transfiera cada sección de andamiaje descelularizado desde SFDM a una membrana, asegurándose de que las secciones queden distribuidas uniformemente sobre la membrana. Prepare placas de seis o doce pocillos llenando los pocillos con 1 ml o 0,5 ml de SFDM, respectivamente. Luego, coloque suavemente las membranas en los pocillos, permitiendo que la membrana flote sobre el medio, creando así un sistema de cultivo en interfase aire-líquido. Para sembrar los andamiajes 3D, tras la preparación de células endodérmicas y la clasificación de células activadas por fluorescencia para enriquecer el endodermo definitivo, use un hemocitómetro para contar las células clasificadas. Centrifugue las células a 400 G durante cinco minutos. Con SFDM, re-suspenda las células sedimentadas a aproximadamente 100 000 células en 10

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Research

Investigación

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Bioengineering

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