Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

El objetivo general de este procedimiento es describir cómo realizar registros de patch-clamp de células enteras en cortes de cerebro recién disecados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la forma en que las manipulaciones experimentales de control alteran la actividad de neuronas específicas en regiones específicas del cerebro. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona el medio para identificar una preparación X vivo de cambios duraderos en las funciones neuronales que se han desarrollado en animales despiertos intactos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las funciones neuronales en cortes de cerebro, también se puede aplicar a otros sistemas, como las células en cultivo y las neuronas in vivo. El demostrador del procedimiento será Francisco García-Oscos, un estudiante de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, con una pipeta de transferencia de plástico con punta recortada, extraiga suavemente un trozo de cerebro de la cámara de recuperación.

Coloque la pipeta de transferencia en la cámara de registro y exprima suavemente el corte de la pipeta sobre el revestimiento deslizante de la cubierta en la parte inferior de la cámara. A continuación, utilizando el objetivo 4x del microscopio, coloque el corte de modo que el área deseada se coloque exactamente en el centro de la cámara de registro. Una vez que se haya logrado la posición deseada, asegure la posición del corte de cerebro con la sujeción de corte hacia abajo, también conocida como arpa.

Después de eso, cambie al objetivo de 40x y baje la lente suavemente hasta que entre en contacto con el ACSF en la cámara. A continuación, utilice la rueda de ajuste fino para enfocar el tejido. Cuando el foco esté a nivel de tejido, observe las células en la región objetivo.

Ahora, busque una celda objetivo. Márquelo en la pantalla del ordenador para ayudar a guiar la micropipeta de grabación. Levante la lente del objetivo para dejar suficiente espacio para colocar la micropipeta de grabación.

En este paso, utilizando una jeringa de un mililitro, una aguja de microjeringa no metálica y un filtro dedicado, llene una micropipeta con la solución interna preparada de antemano. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la micropipeta. A continuación, coloque la micropipeta en un portaelectrodos, de modo que la solución entre en contacto con el electrodo de alambre recubierto de cloruro de plata.

Apriete el tapón de la pipeta, de modo que la arandela cónica forme un sello alrededor de la micropipeta. A continuación, aplique presión positiva con la jeringa llena de aire conectada al soporte de pipeta antes de sumergir la micropipeta en el ACSF para evitar que entren residuos. Con el micromanipulador, guíe la pipeta hasta la cámara de modo que quede aproximadamente debajo del centro del objetivo sumergido.

Mientras mueve la micropipeta con el micromanipulador a velocidad media a alta, ubique la micropipeta en la pantalla del ordenador y guíe la micropipeta hacia la ubicación de la célula en el eje XY. Mientras tanto, mida la resistencia de la micropipeta aplicando un paso de voltaje. Aplique presión positiva para eliminar las burbujas de aire u otros objetos extraños que bloqueen la micropipeta.

Después de limpiar la micropipeta, realice una compensación de voltaje para reducir la corriente de la pipeta a cero. Usando la rueda de enfoque fino del microscopio, comience a enfocar hacia abajo mientras baja la micropipeta gradualmente. Enfoque siempre primero hacia abajo y luego baje la micropipeta hasta el plano de enfoque para asegurarse de que la punta de la micropipeta no penetre bruscamente en la rebanada.

Cuando la micropipeta entre en contacto con la superficie de la loncha, reduzca la velocidad del micromanipulador hasta el modo medio bajo. Aplique suavemente una ligera presión positiva para limpiar cualquier residuo en el camino. A continuación, acérquese a la celda, ya sea alternando con los mandos de control XYZ o acercándose en diagonal donde ambos ejes XZ se cambian con la rotación del mando del eje Z.

Cuando la micropipeta esté lo suficientemente cerca de la célula, aparecerá un hoyuelo en la superficie de la célula. Ahora aplique una succión débil y breve a través del tubo que está conectado al tubo de succión del soporte de la pipeta para crear un sello. Mientras se forma un giga-sello, utilice el comandante del amplificador controlado por computadora para llevar el potencial de retención de las células al potencial de reposo fisiológico con el fin de evitar cambios repentinos, una vez que se rompe la membrana.

Después de que se haya formado el giga-sello, compense las capas rápidas o lentas. Aquí es muy importante que la succión aplicada no sea demasiado fuerte. De lo contrario, la membrana puede romperse antes de establecer el sello.

Si el sello permanece estable y por encima de un gigaom, aplique una succión breve y fuerte para romper la membrana plasmática. La succión debe ser breve y más fuerte que la presión aplicada al establecer un sello. Con el fin de romper correctamente la membrana y lograr una configuración estable de toda la célula.

Al cambiar al modo de celda en la prueba de membrana, vea diferentes parámetros de la celda, como la resistencia de entrada, la resistencia en serie y las capacitancias de membrana. Después de lograr la configuración de celda completa, continúe monitoreando estos parámetros durante la grabación. Aquí se muestra un ejemplo de la pendiente de las EPSCs evocadas a partir de una sola cáscara de núcleo accumbens MSN.

Aumentar la temperatura de 24 a 28 y a 32 grados centígrados, aumenta la pendiente de las EPSC evocadas. Aquí, la amplitud de las EPSC evocadas se evalúa en el modo de pinza de voltaje a menos 80 milivoltios. Cuando la resistencia en serie aumenta, la amplitud de EPSCS evocado disminuye.

Y aquí, hay un ejemplo de los rastros de dos neuronas que muestran el efecto de la resistencia de entrada en la capacidad de la neurona para generar picos. Las neuronas están sujetas a corriente y se mantienen a menos 80 milivoltios. Cuando la resistencia de entrada aumenta, el número de potenciales de acción también aumenta.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que es fundamental generar cortes de cerebro saludables. También es importante monitorear los parámetros que pueden influir en la forma de onda de la señal eléctrica, como la resistencia en serie, la resistencia de entrada y la temperatura. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión del aspecto básico de la técnica de grabación de células enteras en cortes de cerebro.