Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

El objetivo general de este protocolo es utilizar imágenes en vivo en vivo para rastrear una infección por tripanosoma en tiempo real, visualizando las etapas tempranas de la infección sanguínea hasta las últimas etapas de infección cerebral en el ratón, imitando la progresión clínica de la enfermedad del sueño. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del tripanosoma, identificando posibles nuevos tratamientos terapéuticos y evaluando la eficacia contra la infección. La principal ventaja de esta técnica es que la evaluación del fármaco puede establecerse en 90 días, frente a los 180 días necesarios para el modelo de rol anterior.

Este protocolo puede proporcionar información sobre la tripanosomiasis africana humana, pero también es aplicable a otros modelos de enfermedades infecciosas como la tuberculosis o la enfermedad de Chagas. Comience colocando de 21 a 25 gramos de ratones hembra CD1 en una caja de calentamiento para dilatar las venas de la cola. Luego, coloque los ratones calentados individualmente en un dispositivo de restricción de plástico y use una aguja de calibre 25 para inyectar 0,2 mililitros de inóculo diluido del tripanosoma brucei GVR35VSL2 por vía intravenosa en la vena de la cola, ejerciendo presión en el lugar de la inyección inmediatamente después para detener el sangrado.

Para controlar la infección a través de microscopía de frotis sanguíneo, coloque cinco microlitros de sangre en un portaobjetos de vidrio. Use un segundo portaobjetos de vidrio para untar suavemente la gota a través del primer portaobjetos, produciendo una película delgada. Deje que los portaobjetos se sequen al aire y luego fije la sangre en metanol al 100%, seguido de 10 minutos en Giemsa.

Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos con agua destilada y déjelos secar al aire. A continuación, cuenta el número de tripanosomas en 10 campos de visión bajo una subjetiva de 100x. Para rastrear la infección mediante imágenes bioluminiscentes, caliente una alícuota de D-luciferina a temperatura ambiente.

Luego, use una aguja de calibre 25 para inyectar intraperitonealmente 150 miligramos por kilogramo de luciferina calentada por animal. A continuación, inicialice la máquina utilizando el software del generador de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, cuando la cámara y la placa calefactada hayan alcanzado las temperaturas adecuadas, coloque grandes separadores negros entre los animales anestesiados para minimizar el sangrado de cualquier señal bioluminiscente brillante.

Imagina a los ratones utilizando una serie de tiempos de exposición con binning medio, un número F y un filtro abierto y un campo de visión E de 12,5 veces 12,5 centímetros. Para asegurar una imagen completa de los ratones, rote a los animales para obtener vistas ventral, dorsal y lateral. El día 21 se tomaron imágenes y se realizó una película de sangre de los ratones como se demostra.

A continuación, dosifique a los animales 40 miligramos por kilogramo de aceturato de diminazina por vía intraperitoneal para eliminar la parasitemia periférica. Después de obtener imágenes de los animales en el día 35, coloque los cerebros extirpados en una sección de plástico negro y prèpet 50 microlitros de 15 miligramos por mililitro de luciferina sobre los tejidos. A continuación, obtenga una imagen del cerebro utilizando los mismos ajustes que se muestran para las imágenes de todo el animal.

Para cuantificar el grado de bioluminiscencia dentro de regiones específicas de interés, o ROI, seleccione la herramienta ROI dentro del software de imágenes y cree un ROI rectangular para la cuantificación de todo el animal. Coloque el ROI sobre la imagen del mouse desde la punta de la nariz hasta la base de la cola, y usando el cuadro del mismo tamaño para cada animal y cada punto de tiempo, mida el flujo total. Para evaluar el ROI del cerebro solo, crea un ROI circular y colócalo sobre la región de la cabeza del animal.

Repita para cada animal y mida el flujo total. A continuación, utilizando la imagen con la bioluminiscencia más alta y la pestaña de ajuste de imagen de la paleta de herramientas, seleccione una escala logarítmica y una escala de colores mínima y máxima adecuadas para la imagen y aplique esta escala a todas las imágenes del experimento. El desarrollo de la infección puede seguirse in vivo mediante mediciones secuenciales de la bioluminiscencia para determinar el grado de infección en los animales en el transcurso de un experimento.

A medida que la infección progresa, se puede observar un aumento en la bioluminiscencia en todos los animales durante los primeros 21 días, ya que la señal se vuelve más diseminada e intensa, con las regiones más altas de bioluminiscencia aparentes en el área del bazo. El día 21, los ratones son tratados con aceturato de diminazina después de la toma de imágenes, como se acaba de demostrar, lo que resulta en niveles bajos de bioluminiscencia presente en el cerebro el día 28, a medida que se elimina la infección periférica. En el día 35, la señal no solo sigue presente en la región de la cabeza, sino que también se ha vuelto más intensa, lo que indica una posible infección cerebral.

La cuantificación tanto de la parasitemia periférica como de la bioluminiscencia permite evaluar la cinética de la enfermedad. Por ejemplo, en este experimento, en el día 7 se observó una señal de bioluminiscencia alta de uno por 10 a los 8 fotones por segundo, mientras que la parasitemia observada fue muy baja dentro de las películas de sangre generadas el mismo día. A los 28 días, la parasitemia se volvió indetectable en los frotis sanguíneos debido al tratamiento con aceturato de diminaceno administrado el día 21, mientras que la bioluminiscencia continuó manteniéndose por encima de los niveles de fondo hasta el día 35, representando la bioluminiscencia observada en la región de la cabeza y confirmando la mayor sensibilidad del análisis de bioluminiscencia sobre la filmación de sangre.

Las imágenes de biouminescencia del propio cerebro revelan diferencias en la carga de infección entre los animales, que no parece localizarse en regiones anatómicas específicas del tejido. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe obtener un buen rango de tiempos de exposición para garantizar datos de imagen de calidad, ya que la sobreexposición, por ejemplo, afecta negativamente a importantes detalles de localización. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos posteriores, como la PCR cuantitativa y la inmunohistoquímica, para responder preguntas adicionales sobre la carga de parásitos cerebrales y la localización de parásitos.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del tripanosoma realizaran la evaluación del fármaco dentro de los 90 días posteriores a la infección, debido a la mejora de la sensibilidad de la detección de recaídas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar las imágenes de bioluminiscencia de la infección por TB brucei para seguir la progresión de la enfermedad desde la sangre hasta la infección en etapa tardía del cerebro.