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18 de mayo de 2016
Aquí, se describe un protocolo para la cosecha, mantener y tratar de ratón pequeñas organoides intestinales con patrones patógenos asociados moleculares (PAMPs) y Listeria monocytogenes, así como énfasis en la expresión génica y las técnicas de normalización adecuados para las proteínas.
El objetivo general de este procedimiento es medir los efectos del desafío patógeno sobre organoides del intestino delgado, haciendo hincapié en las técnicas de normalización respecto al número total de células. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología innata y mucosal al proporcionar un medio para investigar in vitro las interacciones huésped-patógeno entre bacterias y células epiteliales intestinales. Fundamental para este procedimiento es el método de normalización respecto al número total de células, una necesidad al medir proteínas secretadas por organoides mediante técnicas como el ELISA. Para obtener críptas del intestino delgado de ratón para el cultivo de organoides, comience utilizando una lámina de vidrio estéril para raspar suavemente las vellosidades de la superficie luminal del intestino delgado. A continuación, use tijeras de disección para cortar el tejido en tiras de 1-2 centímetros de longitud, y coloque las tiras en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS frío con hielo. Mezcle el contenido mediante inversión suave y permita que el tejido se sedimente en el fondo del tubo. Luego, aspire el PBS y lave las tiras tres veces más con 10 mililitros de PBS fresco cada vez, de la misma manera. Al final del último lavado, coloque el tubo en hielo durante diez minutos. A continuación, sustituya el PBS por 25 mililitros de PBS suplementado con 2 milimolar de EDTA, y coloque el tubo en un cubo con hielo sobre una plataforma oscilante durante 45 minutos. Al final de la incubación, permita que las tiras de tejido se sedimenten en el fondo del tubo y sustituya el PBS-EDTA por 10 mililitros de PBS suplementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS). Agite el tubo vigorosamente a mano diez veces. Luego, permita que el tejido se sedimente nuevamente y transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mililitros etiquetado como Fracción 1. Agite el tejido en PBS con FBS cinco veces más, transfiriendo el sobrenadante a un tubo de fracción nuevo cada vez. Después de la última agitación, centrifugue todas las muestras y resuspenda los pellets en cinco mililitros de DMEM/F12 precalentado sin factores de crecimiento añadidos. Vuelva a centrifugar las muestras y aspire cuatro mililitros del sobrenadante de cada tubo. Resuspenda los pellets en el último mililitro del medio restante y use alícuotas de 20 microlitros de cada fracción para visualizar las críptas y los restos celulares en láminas de vidrio. Tras agrupar las fracciones adecuadas para lograr la mayor proporción de críptas respecto a restos, centrifugue las fracciones agrupadas y aspire todo el sobrenadante excepto los últimos 50-100 microlitros. Manteniendo los tubos en hielo, añada 1 mililitro de matriz proteica a las fracciones agrupadas, pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo para evitar la introducción de burbujas de aire. Luego, añada 50 microlitros de la suspensión de matriz proteica/críptas en el centro de cada pocillo de una placa de 37
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Descripción general
Este artículo describe un protocolo para la obtención, mantenimiento y tratamiento de organoides del intestino delgado de ratón con patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y Listeria monocytogenes. Se enfatiza el análisis de expresión génica y las técnicas adecuadas de normalización para el análisis de proteínas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Microbiología
- Biología celular
Antecedentes
- Los organoides intestinales pequeños de ratón son valiosos para estudiar la biología intestinal.
- Los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) desempeñan un papel en las respuestas inmunitarias.
- Comprender la expresión génica es crucial para interpretar los resultados experimentales.
- Las técnicas de normalización son esenciales para un análisis preciso de proteínas.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para trabajar con organoides del intestino delgado de ratón.
- Explorar los efectos de los PAMP y de Listeria monocytogenes sobre estos organoides.
- Destacar la importancia del análisis y la normalización de la expresión génica.
Métodos Utilizados
- Recolección de organoides del intestino delgado de ratón.
- Mantenimiento de cultivos de organoides bajo condiciones específicas.
- Tratamiento de organoides con PAMPs y Listeria monocytogenes.
- Análisis de técnicas de expresión génica y normalización de proteínas.
Resultados principales
- Se logró el mantenimiento y tratamiento exitosos de organoides.
- Se observaron cambios en la expresión génica tras el tratamiento.
- Las técnicas de normalización mejoraron la precisión del análisis de proteínas.
- El protocolo puede aplicarse a diversos estudios relacionados con la biología intestinal.
Conclusiones
- El protocolo descrito es eficaz para el estudio de organoides intestinales.
- Los PAMP y Listeria monocytogenes tienen un impacto significativo en la expresión génica.
- Las técnicas adecuadas de normalización son fundamentales para obtener resultados confiables.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los organoides intestinales de ratón ex vivo proporcionan un sistema fisiológicamente relevante para investigar las interacciones entre el huésped y los patógenos y la señalización inmune innata en tejidos mucosos. El énfasis del protocolo en la normalización respecto al número total de células aborda un desafío crítico para generar datos cuantitativos reproducibles a partir de cultivos de organoides heterogéneos. Esta capacidad respalda la confianza predictiva en el descubrimiento temprano y la validación de dianas para programas terapéuticos centrados en inmunología y en el microbioma.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación mecanicista de las vías de receptores de reconocimiento de patrones en contextos epiteliales primarios.
- Apoya la desactivación de riesgos biológicos mediante la modelización de interacciones complejas entre huésped y patógeno ex vivo.
- Facilita la validación funcional de objetivos para moduladores de la inmunidad innata.
- Mejora la confianza predictiva para el avance de activos en inmunología.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara sistemas de organoides validados para ensayos posteriores de compuestos inmunomoduladores.
- Aborda la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante técnicas rigurosas de normalización.
- Permite la medición cuantitativa de proteínas secretadas, lo que favorece una evaluación confiable de los compuestos.
- Apoya la escalabilidad y reutilización de la plataforma en diversos programas de descubrimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con la biología mucosal relevante para la enfermedad, facilitando la exploración traslacional de biomarcadores.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica en estudios de función inmune y de barrera.
- Reduce los riesgos en las decisiones de avance mediante la modelización de respuestas epiteliales fisiológicamente relevantes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis hasta la identificación de compuestos líder y la validación preclínica, para programas de inmunología mucosal e interacciones huésped-microbio.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la señalización inmune innata y los mecanismos huésped-patógeno.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas reproducibles para el análisis de proteínas secretadas en ensayos con organoides.
- Análisis: Permite la normalización respecto al número total de células, mejorando la comparabilidad entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con la biología mucosal in vivo para alinear biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo basado en organoides reutilizable para carteras de I+D en inmunología y microbioma.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza la normalización y cuantificación en sistemas complejos de organoides.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del proyecto y el avance eficiente en términos de capital de la cartera.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de activos en inmunología y microbioma.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de organoides y biología epitelial.
- Exige acceso a instrumentación especializada para cultivo de tejidos y cuantificación de proteínas.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de normalización y análisis.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes tipos de organoides o modelos de enfermedades.
- La heterogeneidad en el crecimiento de los organoides y en la composición de la matriz puede afectar la reproducibilidad del ensayo.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Mus musculus Small Intestinal Crypt Harvest
3:57
Organoid Plating for Pathogen Associated Molecular Patters (PAMP) and L. monocytogenes Challenge
6:58
Results: Representative Mouse Intestinal Organoid Culture and Stimulation
8:29
Conclusion
