los Ex Vivo Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

El objetivo general de este procedimiento es medir los efectos del desafío patógeno en los organoides del intestino delgado, con énfasis en las técnicas de normalización frente al número total de células. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología innata y de la mucosa, proporcionando un medio para investigar las interacciones entre las bacterias y los patógenos del huésped con las células epiteliales intestinales in vitro. Esencial para este procedimiento es el método de normalización contra el número total de células, una necesidad cuando se miden las proteínas secretadas por organoides a través de técnicas como ELISA.To las criptas del intestino delgado de ratón para el cultivo de organoides, comenzando por usar un portaobjetos de vidrio estéril para raspar suavemente las vellosidades de la superficie luminal del intestino delgado. A continuación, utilice unas tijeras de disección para cortar el tejido en tiras de 1 a 2 centímetros de longitud. Y coloque las tiras en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS helado. Mezcle el contenido mediante una inversión suave y deje que el contenido del tejido se asiente en el fondo del tubo. Luego, aspire el PBS y lave las tiras tres veces más en 10 mililitros de PBS fresco, cada vez de la misma manera. Al final del lavado final, coloque el tubo en hielo durante diez minutos. Luego, reemplace el PBS con 25 mililitros de PBS suplementado con 2 milimolares de EDTA, en una cubitera sobre una plataforma oscilante durante 45 minutos. Al final de la incubación, deje que las tiras de tejido se depositen en el fondo del tubo y reemplace el PBS-EDTA con 10 mililitros de PBS suplementado con 10% de FBS. Agite el tubo vigorosamente con la mano diez veces. Luego, deje que el tejido se asiente en el fondo del tubo y transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mililitros etiquetado, Fracción 1.Agite los tejidos en PBS FBS cinco veces más. Transfiriendo el sobrenadante a un nuevo tubo de fracción cada vez. Después de la última agitación, centrifugar todas las muestras y resuspender los pellets en cinco mililitros de DMEM/F12 precalentado sin factores de crecimiento añadidos. Ahora, vuelva a centrifugar las muestras y aspire cuatro mililitros del sobrenadante de cada tubo. Vuelva a suspender los gránulos en el último mililitro de medio restante y use 20 alícuotas de microlitros de cada fracción para visualizar las criptas y los escombros en portaobjetos de vidrio. Después de agrupar las fracciones apropiadas para lograr el mayor porcentaje de proporción de cripta a escombros, centrifugar las fracciones agrupadas y aspirar todos los micronadantes, excepto los últimos 50-100. Manteniendo los tubos en hielo, agregue 1 mililitro de matriz de proteínas a las fracciones agrupadas, pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente para evitar la adición de burbujas de aire. A continuación, añade 50 microlitros de la matriz proteica/suspensión de la cripta en el centro de cada pocillo de 37