Name: los Ex Vivo Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a cultivar organoides intestinales de ratón ex vivo y analizar la expresión génica tras el tratamiento con PAMPs y Listeria monocytogenes. Este protocolo mejora la precisión en inmunología mucosa.

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Los autores desean agradecer a la Dra. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel y Bettina Heid por las discusiones técnicas. Los autores agradecen al Dr. Nanda Nanthakumar por proporcionar las células Caco-2. Los autores también agradecen al Programa de Oportunidades Académicas Multiculturales (MAOP) de Virginia Tech. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales K01DK092355 (a I.C.A.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La cultura y el mantenimiento de organoides intestinal es un procedimiento que puede ser dominado por cualquier persona con la técnica de cultivo de tejidos adecuados. Hay sutilezas en pases en comparación con las células que crece en una monocapa más convencional, pero estas sutilezas no son difíciles de superar. Los pasos críticos de este método implican ser capaz de cultivar las organoides a una densidad suficientemente alta para la siembra óptima. Los experimentos deben ser escalados hacia abajo con organoides como ...

La capacidad de la cosecha y organoides cultivo primario se han descrito para el intestino delgado, colon, páncreas, el hígado y el cerebro y son emocionantes avances pertinentes a la comprensión de un fenómeno más fisiológicamente representante para la biología del tejido 1-5. Los primeros métodos que describen la cultura y el mantenimiento de pequeñas organoides intestinales se informó por Sato et al. Fuera del laboratorio de Hans Clevers 1. Con anterioridad a este método, la recolección y cultivo de células epiteliales intestinales primarias demostró ser limitado e ineficaz para sostener el crecimiento de las células epiteliales. Los métodos incluyen la disociación del tejido por medio de incubación con enzimas, como la colagenasa y dispasa, lo que en última instancia conducir a la derivación de células de fibroblastos primarios mezclados 6. Estas condiciones también podrían tener duración limitada en el mantenimiento del cultivo de células epiteliales. Un mínimo o ningún nicho de células epiteliales formarían, como las células epiteliales entrarían en la apoptosis debido a lala falta de factores de crecimiento apropiados o pérdida de la integridad de contacto, denominado anokis 7. El advenimiento del sistema de cultivo 3D-organoide ha proporcionado un método para las células intestinales primarias de cultivo que contenían un espectro de tipos de células intestinales en cultivo sostenido 1. Estos organoides epiteliales tienen ventajas sobre las líneas de células es que son compuestos de varias células diferenciadas, y imitan mejor el órgano que se derivan de 8 in vivo. El proceso para en última instancia &quot;crecer un mini intestinal en un plato&quot; ha demostrado ser una herramienta valiosa para la evaluación de la respuesta del epitelio intestinal bajo diferentes estímulos. La investigación de la interacción de las células intestinales primarias con patrones moleculares asociados a patógenos microbianos (PAMPs) es relevante para el campo de la inmunología como estos patrones moleculares pueden regular diversas respuestas de tanto el anfitrión como microbio 9. No sólo pueden ahora los investigadores explorar estas interacciones con los organoides ratón, peropuede cultivarse a partir de los seres humanos, así como 2. Esta tecnología tiene el potencial de alterar drásticamente la medicina personalizada y es tentador especular acerca de los avances que esta técnica hará posible en un futuro próximo. El objetivo general de este método es el de proporcionar un protocolo para el cultivo, la expansión, y el tratamiento de organoides intestinales con una variedad de estímulos. Tales estímulos en última instancia, pueden variar de vacunas, PAMPs bacterianas, patógenos vivos, gastrointestinal (GI) y la terapéutica del cáncer. El aislamiento y la cultura de organoides intestinales de ratón ha sido adaptado de Sato et al. Aunque hay ligeras desviaciones del método original, el producto final es organoid cultura aún se logra cuando se sigue este protocolo. Este método se centra en la descripción de una técnica adecuada para la normalización adecuada cuando se trabaja con las estructuras celulares no homogéneos, que deben tenerse en cuenta cuando se realiza un ensayo basado en células nocre oscuro.

<table><tbody><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td> <td>(Sección 1,3,6) O marca equivalente</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>Thermo</td><td></td> <td>(Sección 1,3)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td> <td>(Sección 1,6) Para células Caco-2 y HEK293 Rspondin1</td></tr><tr><td>Línea</td><td></td><td></td> <td>celular secretora de HEK293T-Rspondin1(Sección 1) Descrito y modificado de Kim, K.A. et al. Las partículas lentivirales contenían ADNc RSPO1(NM_138683) ORF clonado en una red troncal pReceiver-Lv105 ordenada y comprada a medida en GeneCopoeia.</td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td> <td>(Sección 1) O marca equivalente</td></tr><tr><td>T-175 Frasco</td><td>Corning 431079</td><td></td><td>(Sección 1) O marca equivalente;</td></tr><tr><td>Matriz de proteínas</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>(Sección 2,3,4,5,6) Matrigel Factor de Crecimiento Reducido&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's (DPBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td> <td>(Sección 2,3)</td></tr> <tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td> <td>(Sección 2,3) DMEM/F12</td></tr><tr><td>Avanzado Corning 24 Placas TC de Pocillos</td><td>Corning</td><td>3524</td> <td>(Sección 2)</td></tr> <tr><td>N2 Suplemento 100x&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048(</td><td>Sección 2)</td></tr><tr><td>B27 sin vitamina A 50x&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida</td><td>12587-010&nbsp;</td><td>(Sección 2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td> <td>(Sección 2)</td></tr><tr><td>Suplemento de glutamina (Glutamax)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td> <td>(Sección 2) Puede combinarse con DMEM / F12</td></tr><tr><td>avanzado HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td> <td>(Sección 2) Puede combinarse con DMEM avanzado / F12 &nbsp;</td></tr><tr><td>10ml Pipeta Serológica</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>(Sección 2) O marca equivalente</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>(Sección 2) Stock = 100 mg/ml</td></tr><tr><td>N-Acetil-L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>(Sección 2) Stock = 1M</td></tr><tr><td>Ratón Recombinante EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td><td>(Sección 2) Stock = 500 mg/ml</td></tr><tr><td>Rocker Variable</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>(Sección 3)</td></tr><tr><td>tijeras</td><td></td><td></td> de disección<td>(Sección 3)</td></tr><tr><td>pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>(Sección 3)<td>portaobjetos de vidrio</td><td>(Sección 3)</td></tr><tr><td>pinzas</td><td></td><td></td> de disección<td>(Sección 3)</td></tr><tr><td>Pipeta serológica</td><td>Falcón de</td><td></td> 25 ml<td>(Sección 3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td><td>(Sección 3) 0,5 M o alternativa</td></tr><tr><td>Placa de Petri estéril EDTA de grado TC de 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>(Sección 3) O placa TC</td></tr> de tamaño igual 1 <tr><td>ml Jeringa</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>(Sección 4)</td></tr><tr><td>Aguja deslizante de precisión</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td> <td>(Sección 4) 23G x 1 1/4 (0,6 mm x 30 mm)</td></tr><tr><td>Flagelina de Bacillus subtilis</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&nbsp;</td><td>(Sección 5,6)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(Sección 5,6)&nbsp;( Murray&nbsp; et&nbsp;al.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td> <td>(Sección 5,6)O marca equivalente</td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>211065</td><td>(Sección 5)</td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td> <td>(Sección 5)</td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td> <td>(Sección 6)</td></tr><tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>(sección 6)</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td> <td>(Sección 6)</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td> Dispositivos <td></td><td>Moleecuares</td> <td>(Sección 6)</td></tr><tr><td>96 Placa de ensayo de pozos</td><td>Corning</td><td>3603</td> <td>(Sección 6) Placa negra, fondo transparente Tratado</td></tr> TC <tr><td>Tinte nuclear Tinte</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td> <td>(sección 6) Matraz Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>(Sección 6) O</td></tr><tr><td>tubo cónico de 15 ml</td> de marca equivalente <td>Falcon</td><td>352096</td><td>(Sección 1,3) O</td></tr><tr><td>tubo de polipropileno de 1,7 ml</td> de marca equivalente <td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>O marca equivalente</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>O marca equivalente</td></tr><tr><td>TNF-alpha&nbsp;</td>Kit de <td>ensayo de expresión génica Mm 00443260_g1 Taqman de</td> <td>Applied Biosystems</td><td></td></tr><tr><td>IL-6&nbsp;</td>Kit de <td>ensayo de expresión génica Taqman</td>de <td>Applied Biosystems</td><td>(Mm 00446190_m1</td></tr><tr><td>IL-1beta Kit de ensayo de</td> expresión génica <td>Mm 00434228_m1</td><td>Taqman</td>de <td>Applied Biosystems</td></tr><tr><td>IL-18 Kit de ensayo de</td> expresión génica <td>Mm 00434225_m1</td><td>Taqman</td>de <td>Applied Biosystems</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Kit de ensayo de expresión génica Hs</td><td>99999901_s1 Taqman</td></tr><tr><td>7500 Sistema de PCR rápido en tiempo real</td><td>Ciclo</td> maestro de gradiente Nexus de Applied Biosystems <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master</td><td>4352042</td><td></td>Mix Kit de <td></td></tr><tr><td>transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td> de Life <td>Technologies Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos, 0,1 mL</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>Ratón recombinante R-Espondina 1 Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/ml</td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

los<em&gt; ex vivo</em&gt; cultura y reconocimiento de patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

organoides intestinales primarias son un sistema modelo valioso que tiene el potencial de impactar significativamente el campo de la inmunología de la mucosa. Sin embargo, la complejidad de las características de crecimiento de organoides llevan advertencias importantes para el investigador. En concreto, los patrones de crecimiento de cada individuo organoide son muy variables y crear una población heterogénea de células epiteliales en cultivo. Con tales advertencias, las prácticas de cultivo de tejidos comunes no pueden ser simplemente aplican al sistema organoide debido a la complejidad de la estructura celular. Contando y enchapado basándose únicamente en el número de células, que es común para las células separadas individualmente, tales como líneas celulares, no es un método fiable para organoides menos que se aplique alguna técnica de normalización. La normalización de contenido total de proteínas se hace compleja debido a la proteína de la matriz residente. Estas características en términos de número de células, forma y tipo de célula deben tenerse en cuenta al evaluar con secretadatiendas de campaña de los medios de organoid. Este protocolo se ha generado para establecer un procedimiento sencillo para la cultura y tratar pequeños organoides intestinales con patógenos microbianos y patógenos asociados a patrones moleculares (PAMPs). También hace hincapié en las técnicas de normalización que se deben aplicar al análisis de proteínas se llevan a cabo después de un desafío.

Cuando se sigue este protocolo para cultivar organoides intestinales, característicos organoides en forma de esfera estarán presentes después de la cosecha. La adición de R-spondin1 medio condicionado diaria iniciará el crecimiento y el florecimiento de los organoides. El crecimiento de organoides se muestra en la Figura 1A - F, y es representativa de organoides intestinales en los días 1, 2, 4, 5, 6 y el día 14. Figura 1F</stron...

Aquí, se describe un protocolo para la cosecha, mantener y tratar de ratón pequeñas organoides intestinales con patrones patógenos asociados moleculares (PAMPs) y Listeria monocytogenes, así como énfasis en la expresión génica y las técnicas de normalización adecuados para las proteínas.

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los efectos del desafío patógeno sobre organoides del intestino delgado, haciendo hincapié en las técnicas de normalización respecto al número total de células. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en los campos de la inmunología innata y mucosal al proporcionar un medio para investigar in vitro las interacciones huésped-patógeno entre bacterias y células epiteliales intestinales. Fundamental para este procedimiento es el método de normalización respecto al número total de células, una necesidad al medir proteínas secretadas por organoides mediante técnicas como el ELISA. Para obtener críptas del intestino delgado de ratón para el cultivo de organoides, comience utilizando una lámina de vidrio estéril para raspar suavemente las vellosidades de la superficie luminal del intestino delgado. A continuación, use tijeras de disección para cortar el tejido en tiras de 1-2 centímetros de longitud, y coloque las tiras en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS frío con hielo. Mezcle el contenido mediante inversión suave y permita que el tejido se sedimente en el fondo del tubo. Luego, aspire el PBS

the-ex-vivo-culture-pattern-recognition-receptor-stimulation-mouse

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Un método simple para establecer organoide del tumor de colon murino primaria se describe. Este método utiliza la característica de que las células de tumor de colon sobrevivir y crecer en organoides en medios que contienen factores de crecimiento limitadas, mientras que el colon normal epiteliales no lo hacen.

In vitro organoide Cultura de tumores de colon primarios Ratón

La tecnología de imagen mejorada está permitiendo la obtención de imágenes tridimensionales de los órganos durante el desarrollo. Aquí describimos un sistema de cultivo de órganos completo que permite obtener imágenes en vivo de las vellosidades en desarrollo en el intestino fetal del ratón.

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para Ex Vivo Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

Pequeñas organoides las criptas intestinales cultivadas ex vivo proporcionan un sistema de cultivo de tejidos que recapitula el crecimiento de las criptas dependientes de células madre y su nicho. Hemos establecido un método para analizar el perfil metabólico en tiempo real en organoides cripta ratón primaria. Encontramos organoides mantienen propiedades fisiológicas definidas por su origen.

Bienes Análisis Tiempo de perfil metabólico en Ex Vivo Culturas ratón intestinal Cripta organoides

En este protocolo de vídeo damos una explicación paso a paso de la transducción lentiviral en organoides del epitelio intestinal primario y del procesamiento y análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica.

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

El cultivo de órganos ex vivo permite la investigación de procesos biológicos en el contexto de la arquitectura de tejidos intactos. Aquí, presentamos un método de cultivo ex vivo del colon de ratón, que se puede utilizar para estudiar la inmunidad innata y la defensa antimicrobiana del huésped en el intestino.

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organo cultura y su uso en estudios de defensa antimicrobiana de host

Este artículo presenta un método único para analizar las interacciones huésped-microbioma utilizando un nuevo sistema de cultivo de órganos intestinales para experimentos ex vivo.

Un sistema de cultivo de órganos intestinales intestinales para analizar las interacciones huésped-microbiota

Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para establecer organoides murinos del intestino delgado, aislar las células linfoides innatas tipo 1 de la lámina propia del intestino delgado murino y establecer cocultivos tridimensionales (3D) entre ambos tipos de células para estudiar las interacciones bidireccionales entre las células epiteliales intestinales y las células linfoides innatas tipo 1.

Cocultivo de organoides epiteliales del intestino delgado murino con células linfoides innatas

El presente protocolo describe el establecimiento de un sistema organoide colónico murino para estudiar la actividad y el funcionamiento de las células madre colónicas en un modelo knockout de claudina-7.

Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

Describimos un protocolo para aislar criptas murinas del intestino delgado y cultivar organoides 3D intestinales de las criptas. Además, describimos un método para generar organoides a partir de una sola célula madre intestinal en ausencia de un nicho celular subepitelial.

El cultivo 3D de organoides a partir de criptas intestinales murinas y una sola célula madre para la investigación de organoides

Aprende a cultivar organoides intestinales de ratón ex vivo y analizar la expresión génica tras el tratamiento con PAMPs y Listeria monocytogenes. Este protocolo mejora la precisión en inmunología mucosa.

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