De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de

El objetivo general de esta purificación es obtener la proteína de activación de neutrófilos de Helicobacter pylori, o HP-NAP, funcional en su forma nativa, con alta pureza y alto rendimiento, utilizando cromatografía por lotes en modo negativo con resina de intercambio iónico di-etil amino-etil. La principal ventaja de esta técnica es que la HP-NAP puede purificarse en su forma nativa en un solo paso, con alta pureza y alto rendimiento. La purificación negativa de la HP-NAP comienza con un procedimiento de unión por lotes, en el cual la fracción proteica soluble proveniente de lisados bacterianos se añade a la resina DEAE.

Se incuba la mezcla para permitir que las proteínas se unan por completo a la resina. La HP-NAP presente en la fracción no unida se obtiene luego mediante centrifugación o flujo gravitatorio. Las implicaciones de esta técnica son la prevención, el tratamiento y el pronóstico de enfermedades asociadas con Helicobacter pylori, así como la terapia contra el cáncer, en una proporción de 10:1.

Debido a las propiedades inmunogénicas e inmunomoduladoras de HP-NAP. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades. Porque HP-NAP se agrega fácilmente durante la esterilización.

Demostrará el procedimiento Zhi-Wei Hong, un estudiante de posgrado de nuestro laboratorio. Trabajando a cuatro grados Celsius, suspendemos 50 mililitros de la pasta celular preparada según se describe en el protocolo del texto en 20 mililitros de tampón tris con baja salinidad a pH 9,0 con mezcla de inhibidores de proteasa. Es fundamental mantener la muestra a cuatro grados Celsius para permitir que el procedimiento evite la agregación de proteínas.

Rompa las células bacterianas pasando la suspensión bacteriana a través de un homogeneizador de alta presión operado a un rango de 15.000 a 20.000 PSI durante siete veces a cuatro grados Celsius. Después de la lisis bacteriana, se debe centrifugar inmediatamente. Transfiera las muestras homogeneizadas a un tubo de centrífuga.

Centrifugar inmediatamente el lisado celular a 30.000 ×g a cuatro grados Celsius durante una hora para separar las fracciones proteicas solubles e insolubles utilizando una ultracentrífuga. Tras la centrifugación, transferir el sobrenadante como fracción proteica soluble a un vaso de precipitados. Medir la concentración proteica de la fracción proteica soluble mediante el método de Bradford utilizando un kit comercial con albúmina sérica bovina como estándar, según las instrucciones del fabricante.

Luego, agregue 177,6 µL de HCl 1 N a 20 mL de la fracción de proteína soluble para ajustar su valor de pH de pH 9,0 a pH 8,0. Agregue Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, y 50 mL de cloruro de sodio a la solución de proteína para obtener una concentración final de proteína de 0,5 mg/mL. Para preparar 15 mL de resina DEAE, suspenda 0,6 g de polvo seco de resina DEAE en 30 mL de tampón Tris-HCl a temperatura ambiente durante al menos un día.

Centrifugar la resina a 10.000 veces G a cuatro grados Celsius durante un minuto y luego retirar y descartar el sobrenadante. A continuación, añadir 15 mililitros de tampón Tris-HCl. Después de repetir los pasos de centrifugación y resuspensión cuatro veces más, almacenar los 15 mililitros de resina sedimentada a cuatro grados Celsius para su uso posterior.

Trabajando a cuatro grados Celsius, agregue 45 mililitros de las proteínas solubles preparadas a mililitros de la resina y transfiera a un vaso de precipitados de 100 mililitros con barra de agitación. Agite la suspensión de proteína-resina utilizando una placa magnética a cuatro grados Celsius durante una hora. A continuación, vierta la suspensión de proteína-resina en una columna de plástico o vidrio equipada con una llave de paso y permita que la resina sedimente por gravedad.

Abra la llave para permitir que la solución de proteína fluya a través de la columna por gravedad hasta que el nivel del líquido en la columna esté justo por encima de la resina. Recoja el flujo saliente como la fracción no unida, que contiene la proteína activadora de neutrófilos purificada. Añada 15 mililitros del tampón Tris-HCl frío a la columna.

Abra nuevamente la llave de paso para permitir que el tampón de lavado fluya a través de la columna por gravedad hasta que el nivel del líquido en la columna esté justo por encima de la resina. Recopile el flujo saliente como la fracción de lavado. Repita el lavado con tampón frío con hielo cuatro veces más para recolectar fracciones de lavado adicionales.

Luego, agregue 15 mililitros de Tris-HCl 20 milimolar frío con hielo, pH 8,0, con cloruro de sodio 1 molar al cilindro. Recopile el flujo descendente como las fracciones de elución, como antes. Repita los pasos de elución otras cuatro veces para recopilar fracciones de elución adicionales.

El efecto del pH sobre la solubilidad de HP-NAP en el lisado de E. coli se muestra aquí. La cantidad de HP-NAP detectada en esta fracción soluble aumentó notablemente entre pH 7,5 y 9,5. La recuperación del HP-NAP recombinante fue casi completa en la fracción soluble tras la lisis celular a pH 9,0.

Aquí se muestra el efecto del pH sobre la purificación negativa de HP-NAP recombinante expresado en E.coli mediante resinas DEAE en modo lote. A pH 8,0, solo una pequeña cantidad de HP-NAP estuvo presente en la fracción de elución. La cantidad de HP-NAP presente en las fracciones no unidas fue la más alta a pH 8,0.

La cantidad optimizada de proteínas cargadas sobre la resina DEAE es de 1,5 miligramos de proteína por mililitro de resina para lograr la capacidad máxima de la resina para absorber las impurezas de E.coli. A pH 8,0, muy pocas proteínas distintas de HP-NAP en su forma nativa se recuperan en la fracción no unida utilizando resinas DEAE en modo lote. La pureza de HP-NAP fue superior al 95 por ciento.

El HP-NAP purificado se pliega en un multímero con una estructura secundaria de hélice alfa, tal como lo muestra el cromatograma de filtración en gel y el espectro de dicromismo circular en el ultravioleta lejano. Un ensayo de quimioluminiscencia dependiente de luminol revela que el HP-NAP purificado es capaz de inducir la producción de especies reactivas de oxígeno por los neutrófilos. Una vez dominadas, estas técnicas pueden realizarse en menos de cinco horas si se llevan a cabo adecuadamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar HP-NAP funcional en su forma nativa con alto rendimiento y pureza, utilizando cromatografía por lotes en modo negativo con resina DEAE e intercambio iónico. Al intentar este procedimiento, es importante recordar el uso de tampones con el pH adecuado en el paso de esterilización durante la cromatografía por lotes. Tuvimos la idea de este método cuando intentamos aplicar otros enfoques cromatográficos en lugar de la filtración para purificar HP-NAP en su forma nativa.

Aunque este método está diseñado para aplicarse mediante HP-NAP recombinante expresado en E.coli, también puede utilizarse en otros sistemas de expresión bacteriana, como per-sida sep-tidas. La demostración visual de esta medida es código rápido.

Además, los pasos de esterilización y cromatografía por lotes son difíciles de aprender, ya que estos pasos deben realizarse a cuatro grados Celsius sin ningún retraso en el tiempo. Si una proteína diseñada para purificación es adecuada para nuestra cromatografía de intercambio en modo negativo, este procedimiento también podría adaptarse como punto de partida para el desarrollo de un proceso de purificación.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación clínica exploraran la posibilidad de utilizar HP-NAP en la terapia contra el cáncer, así como en el desarrollo de vacunas, fármacos y diagnósticos para enfermedades asociadas con Helicobacter pylori.