Name: De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de Helicobacter pylori La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en Escherichia coli En modo batch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a purificar la proteína activadora de neutrófilos de Helicobacter pylori mediante cromatografía de intercambio iónico DEAE en modo batch negativo. Este método de un solo paso logra alta pureza y rendimiento para aplicaciones en vacunas y diagnóstico.

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Agradecemos al Dr. Chao-Sheng Cheng de la Universidad Nacional Tsing Hua, Taiwán, por realizar la medición del dicroísmo circular. También agradecemos a los doctores Evanthia Galanis e Ianko D. Iankov de la Clínica Mayo, EE. UU., por proporcionar el anticuerpo monoclonal anti-HP-NAP. Agradecemos a los Dres. Han-Wen Chang y Chung-Chu Chen del Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwán, por brindar asesoramiento para la aplicación del IRB, al Sr. Te-Lung Tsai del Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwán, por supervisar el análisis de neutrófilos aislados, y a la Sra. Ju-Chen Weng de la Universidad Nacional Tsing Hua, Taiwán, por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 y NSC98-2311-B-007-006-MY3), el Programa Conjunto de Investigación de la Universidad Nacional Tsing Hua y el Hospital Mackay Memorial (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), y el programa de investigación de la Universidad Nacional Tsing Hua (104N2052E1).

La sangre humana se obtuvo de voluntarios sanos con consentimiento informado por escrito antes y aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Nacional Tsing Hua, en Hsinchu, Taiwán. 1. La expresión del recombinante HP-PAN en E. coli <ol><li> Preparar el plásmido pET42a-NAP que contiene la secuencia de ADN de HP-NAP de H. pylori cepa 26695 16 como se describió previamente. Preparar los plásmidos que contienen la secuencia de ADN de HP-NAP con las mutaciones puntuales deseadas como se describe (véase el Protocolo, paso 8). </li><li> Transformar 10 ng de los plásmidos de ADN anteriores en E. coli BL21 (DE3) células competentes por choque térmico durante 45 segundos a 42 ° C, las células consecutivas en caldo lysogeny (LB) placas de agar que contenían 50 mg / ml de kanamicina, e incubar las placas a 37 ° C durante 16 horas. </li><li> Inocular colonias individuales en tubos individuales que contienen 5 ml de caldo LB con 50 mg / ml de kanamicina y crecer como cultivos previos en 37 ° C durante 16 horas con agitación a 170 rpm. </li><li> Inocular 2 ml de las células pre-cultivo anterior en 200 ml de caldo LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina en un matraz de 1 L. Incubar el matraz de cultivo inoculado a 37 ° C durante 2 horas con agitación a 170 rpm hasta que la absorbancia a 600 nm alcanza aproximadamente desde 0,4 hasta 0,5 detectado por un espectrofotómetro UV / VIS. </li><li> Añadir 80 l de 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el cultivo anterior a una concentración final de 0,4 mM para inducir la expresión de HP-NAP. Incubar el cultivo durante 3 horas hasta que la absorbancia a 600 nm alcanza aproximadamente 1/6 a 1/7. </li><li> Centrifugar las células a 6000 xga 4 ° C durante 15 minutos para eliminar el sobrenadante. Almacenar el sedimento de células a -70 ° C hasta la purificación. </li></ol> 2. Preparación de la fracción de proteína soluble que contiene HP-PAN Nota: Todas las siguientes etapas se llevan a cabo a 4 ° C. <ol><li> Resuspender 50 ml de la célula pEllet preparado en el Protocolo de paso 1,6 en 20 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, NaCl 50 mM que contiene 0,13 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,03 mM N-alfa-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK), y 0,03 mM N-tosil-L-phenylalaninyl-clorometilcetona (TPCK) a 4 ° C como se ha descrito previamente 16. </li><li> Romper las células de bacterias haciendo pasar la suspensión bacteriana a través de un homogeneizador de alta presión que funciona a una gama de 15.000 a 20.000 psi durante 7 veces a 4 ° C. </li><li> Centrifugar el lisado de células a 30.000 × g a 4 ° C durante 1 hora para separar las fracciones de proteínas solubles e insolubles mediante el uso de una ultracentrífuga. Transferir el sobrenadante como la fracción de proteína soluble a un vaso de precipitados. </li><li> Medir la concentración de proteína de la fracción de proteína soluble por el método de Bradford utilizando un kit comercial con albúmina de suero bovino (BSA) como el estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Añadir 177,6 l de HCl 1 N en 20 ml de THe fracción de proteína soluble obtenida de Protocolo paso 2.3, para ajustar el valor de pH desde pH 9,0 a pH 8,0. </li><li> Añadir 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM a la solución de proteína de arriba para hacer la concentración de proteínas final sea 0,5 mg / ml. </li></ol> 3. Purificación de recombinante HP-NAP de E. coli mediante cromatografía modo por lotes negativo con resinas de intercambio iónico DEAE <ol><li> Preparar 15 ml de resinas DEAE. <ol><li> Pesar 0,6 g de polvo seco de resinas DEAE y suspenderlo en 30 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM a temperatura ambiente durante al menos 1 día. </li><li> Se centrifuga la resina a 10.000 x g a 4 ° C durante 1 min. </li><li> Retirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 15 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM. </li><li> Repetir los pasos Protocolo 3.1.2 a 3.1.4 de cuatro veces más. </li><li> Almacenar los 15 ml se establecieron resina (suspensión al 50% en 30 ml de tampón Tris) a 4 ° C para su uso posterior. Nota: Todos los siguientes pasoss se llevan a cabo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Añadir 45 ml de las proteínas solubles preparadas en el Protocolo paso 2,6-15 ml de la resina y se agita la suspensión de proteína / resina con un agitador magnético a 4 ° C durante 1 hr. </li><li> Se vierte la suspensión de proteína / resina en una columna de plástico o de vidrio equipado con una llave de paso. Deje que la resina se asiente por gravedad. </li><li> Abrir la llave de paso para permitir que la solución de proteína a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna es justo por encima de la resina. Recoger el flujo a través de como la fracción no unida, que contiene el purificada HP-NAP. </li><li> Añadir 15 ml de helado de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM en la columna. </li><li> Abrir la llave de paso para permitir que el tampón de lavado a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna es justo por encima de la resina. Recoger el flujo a través de como la fracción de lavado. </li><li> Repetir los pasos Protocolo de 3.5 a 3.6 cuatro veces más para recoger las fracciones de lavado adicionales. </li><li> Añadir 15 ml de helado de 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl en una columna. </li><li> Abrir la llave de paso para permitir que el tampón de elución a través de la columna por flujo de gravedad hasta que el nivel de líquido en la columna es justo por encima de la resina. Recoger el flujo a través de como la fracción de elución. </li><li> Repetir los pasos Protocolo de 3,8 a 3,9 cuatro veces más para recoger las fracciones de elución adicionales. </li></ol> 4. El cambio de tampón y la eliminación de endotoxina de HP-PAN purificó mediante cromatografía en modo batch negativa con DEAE Resinas Nota: El purificada HP-NAP expresa en E. coli tiene que ser sometido a intercambio de tampón y la eliminación de endotoxina antes de estimular neutrófilos. <ol><li> Realizar la diálisis para cambiar el tampón de la purificado HP-PAN a la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS), pH 7,2, a 4 ° C mediante el uso de un tubo de diálisis con corte de peso molecular de 14 kDa como se ha descrito previamente 24. </li><li> Se filtra la HP-PAN se dializa a través de un syringfiltro de correo con una membrana cargada positivamente, hidrófila unida a una jeringa desechable de 20 ml a velocidades de flujo entre 2,5 y 4 ml / minuto a 4 ° C para eliminar la endotoxina. </li></ol> 5. Caracterización de las propiedades moleculares de recombinante purificada HP-PAN por dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE), Western Blot, nativo-PAGE, cromatografía de filtración en gel y dicroísmo circular Espectroscopía <ol><li> Analizar el purificada HP-NAP recombinante por SDS-PAGE y transferencia Western con sobrenadantes de cultivo de hibridoma que contiene el anticuerpo monoclonal de ratón MAb 16F4 25 como se describió anteriormente 24. </li><li> Analizar el HP-PAN se purifica mediante nativo-PAGE y cromatografía de filtración en gel para examinar su estado oligomérico como se ha descrito previamente 26. </li><li> Analizar el purificada HP-PAN recombinante mediante espectroscopía de dicroísmo circular para examinar su estructura secundaria como se ha descrito previamente 26. </li></ol> 6. Evaluación de la pureza de HP-PAN por tinción de plata de un gel SDS-PAGE <ol><li> Preparar la solución de fijación, solución, solución de plata, solución de revelado sensibilizante, la solución de parada, y la solución de lavado de acuerdo con las instrucciones del fabricante de un kit de tinción de plata. </li><li> Realizar tinción de plata de un gel SDS-PAGE de acuerdo con las instrucciones del fabricante de un kit de tinción de plata. </li><li> Adquirir la imagen del gel con un sistema de imagen. </li></ol> 7. Medición de la Producción de ROS por los neutrófilos inducida por HP-PAN <ol><li> Aislar los neutrófilos humanos a partir de sangre heparinizada humana mediante sedimentación con dextrano seguido de centrifugación en gradiente de densidad como se describió anteriormente 24. </li><li> Medición de la producción de ROS por los neutrófilos estimulados con HP-NAP mediante el uso de un ensayo de quimioluminiscencia de luminol-dependiente. <ol><li> Encienda un lector de placas y ajustar la temperatura a 37 ° C. Coloque unainferior plato vacío plana de 96 pocillos blanca dentro de la cámara de lector de placas, lo que permite que se caliente a 37 ° C. </li><li> Preparar las mezclas de estímulo en el D-PBS, pH 7,2, que contiene 0,9 mM CaCl 2, 0,5 mM MgCl 2, y 13,3 M 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol) con la presencia y ausencia de 0,67 M-endotoxina eliminado HP-PAN preparado a partir de Protocolo paso 4.2. </li><li> Ajustar la concentración de neutrófilos humanos preparados a partir de Protocolo de paso 7,1 a 2 x 10 6 células / ml en D-PBS, pH 7,2, que contenía glucosa 5 mM. </li><li> Añadir 50 l de suspensión de neutrófilos en cada pocillo de la placa de 96 pocillos tiempo. </li><li> Añadir 150 l de las mezclas preparadas a partir de estímulo Protocolo paso 7.2.2 en los neutrófilos así que contienen en un intervalo de tiempo de 5 segundos por pocillo. </li><li> Medir la emisión de quimioluminiscencia durante 5 segundos por pocillo durante un período de tres horas usando un lector de placas. </li></ol></li></ol> 8.Construcción de plásmidos de ADN que albergan HP-PAN mutantes por Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) a base de mutagénesis directa Nota: mutagénesis directa basada en PCR fue generado básicamente como se ha descrito previamente 27, excepto que los sitios de restricción &quot;silenciosas&quot; fueron introducidos en los cebadores de mutagénesis por mutagénesis dirigida (SDM) software -Ayudar 28. <ol><li> Realizar la reacción de PCR. <ol><li> Añadir 10 ng de plásmido pET42a-NAP, 1 M de pares de cebadores de mutagénesis listados en la Tabla 1, 200 mM de trifosfatos de desoxinucleósidos (dNTP), y 3 unidades de alta fidelidad mezcla de enzimas PCR en un tubo de PCR que contiene agua desionizada, dando una final volumen de 25 l. </li><li> Iniciar los ciclos de PCR en 95 ° C durante 10 minutos para desnaturalizar el ADN molde, y sigue con 12 ciclos de amplificación a 95 ° C durante 1 minuto, Tm sin -5 ° C durante 1 minuto y 72 ° C durante 6 minutos. </li><li> Terminar los ciclos de PCR conuna etapa de recocido en T m pp -5 ° C durante 1 minuto y una etapa de extensión a 72 ° C durante 30 min. </li></ol></li><li> Tratar 15 l de producto de PCR con 0,4 l de enzima de restricción Dpn I a 37 ° C durante 2 horas y luego analizar 2 l del producto de PCR tratado con Dpn I mediante electroforesis en gel de agarosa. </li><li> mutantes de pantalla. <ol><li> Transformar 2 l de producto de PCR en E. coli DH5a células competentes por choque térmico de 45 segundos a 42 ° C. </li><li> Propagar las células transformadas en una placa LB que contiene 50 mg / ml de kanamicina y se incuba la placa a 37 ° C durante 16 horas. </li><li> Aislar el ADN plasmídico de las colonias bacterianas utilizando un kit comercial de lisis alcalina de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Se trata el ADN de plásmido aislado en el Protocolo paso 8.3.3 con enzima de restricción XhoI para verificar la presencia de las mutaciones silenciosas deseado de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> secuencia de laplásmido de ADN verificado por paso Protocolo 8.3.4 con el cebador promotor T7 para confirmar la corrección de las secuencias codificantes de mutantes HP-NAP según el protocolo del fabricante. </li></ol></li></ol>

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<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li>
<li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+%27silent%27+restriction+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li>
</ol>

HWF e YCY son inventores de las patentes TW I 432579 y US 8,673,312 para el método de purificación en un solo paso de la proteína activadora de neutrófilos Helicobacter pylori . Todos los materiales descritos en el manuscrito estarán disponibles para fines de investigación. Los autores confirman que esto no altera su adhesión a todas las políticas de JoVE sobre el intercambio de datos y materiales.

La cromatografía por lotes modo negativo con resinas de intercambio aniónico DEAE que aquí se presenta es adecuado para la purificación de HP-NAP recombinante sobreexpresada en E coli. Los valores de pH de los tampones utilizados en las etapas de lisis celular y la purificación son muy críticos para asegurar la solubilidad de HP-NAP en E. Los lisados ​​de E. coli y la separación eficiente de HP-NAP recombinante a partir de las impurezas de la célula huésped, respectivamente. Las células bacter...

Helicobacter pylori (H. pylori) es una causa importante de gastritis y úlcera péptica. Esta bacteria también ha sido clasificado como un carcinógeno en humanos por parte de la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer, que forma parte de la Organización Mundial de la Salud, en el año 1994. Se ha estimado que la prevalencia de H. pylori es del 70% en los países en desarrollo y del 30-40% en los países industrializados 1. A pesar de que la tasa de infección de H. pylori está disminuyendo en los países industrializados, la tasa de infección de H. pylori en los países en desarrollo sigue siendo alta 2. El tratamiento estándar para erradicar H. pylori consiste en la administración de un inhibidor de la bomba de protones, IBP y dos antibióticos, claritromicina o metronidazol más amoxicilina 3. Sin embargo, el aumento de la resistencia a los antibióticos en H. pylori relacionados con la PI terapia de úlceras insta al desarrollo de nuevas estrategias para prevenir or curar la infección. Desarrollo de la vacunación preventiva y / o terapéutica contra H. pylori podría proporcionar un enfoque alternativo para el control de H. pylori. Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP), un importante factor de virulencia de H pylori, se identificó por primera vez en extractos de agua de H. pylori con la capacidad de activar los neutrófilos a adherirse a las células endoteliales y producir especies de oxígeno reactivas (ROS) 4. La infiltración de neutrófilos de la mucosa gástrica se encuentra en H. pylori pacientes infectados con gastritis activa pueden resultar en la inflamación y el daño tisular del estómago. Por lo tanto, HP-NAP puede jugar un papel patológico mediante la activación de los neutrófilos para inducir inflamación gástrica, lo que hace aún más úlcera o H. pylori -asociado enfermedades gástricas. Sin embargo, HP-PAN es un candidato potencial para aplicaciones clínicas 5,6. Debido a la pro inmunogénica e inmunomoduladorpiedades de HP-NAP, esta proteína se podrían utilizar para desarrollar vacunas, agentes terapéuticos, y herramientas de diagnóstico. Un ensayo clínico se ha realizado para el uso de HP-NAP recombinante como uno de los componentes de una vacuna de proteína contra H. pylori. Esta vacuna consiste en HP-NAP recombinante, asociado a la citotoxina gen A (CagA), y las proteínas vacuolizante citotoxina A (VacA) formulado con hidróxido de aluminio y además se ha demostrado que es segura e inmunogénica en humanos 7. Además, HP-PAN actúa como un potente inmunomodulador para desencadenar T auxiliares de tipo 1 (Th1) -polarized respuestas inmunes para la terapia del cáncer 8 y para regular hacia abajo las respuestas inmunitarias mediadas por Th2 provocadas por reacciones alérgicas e infecciones parasitarias 9,10. Como para el diagnóstico, recombinante ELISA basado en HP-PAN se ha aplicado a la detección de anticuerpos séricos contra HP-NAP en H. pylori pacientes infectados 11. Un estudio mostró que el nivel de anticuerpos HP-PAN-específica en sueros de H. pylori pacientes infectados con cáncer gástrico fue significativamente mayor que la de los pacientes con gastritis crónica 12. Otro estudio también demostró que los anticuerpos séricos contra HP-NAP se asocian con la presencia de no cardia adenocarcinoma gástrico 13. Por lo tanto, recombinante ELISA basado en HP-NAP se puede aplicar a la detección de anticuerpos séricos contra HP-NAP para el pronóstico del cáncer gástrico en H. pylori pacientes infectados. En su conjunto, el HP-PAN purificada podría ser utilizado más para la prevención, tratamiento y pronóstico de la H. pylori -asociado enfermedades, así como la terapia del cáncer. Entre los diversos métodos utilizados para la purificación de recombinante HP-NAP expresado en Escherichia coli (E. coli) en su forma nativa informado hasta ahora, se necesita una cromatografía de filtración en gel segunda etapa de purificación que implica obtener alta pureza HP-NAP 14-16 . Aquí, un método que utiliza cromatografía de modo por lotes negativa condietilaminoetilo (DEAE) resinas de intercambio iónico se describe para la purificación de HP-NAP sobreexpresa en E. coli con alto rendimiento y alta pureza. Esta técnica de purificación se basa en la unión de proteínas y / o impurezas que no sean HP-PAN a la resina de la célula huésped. A pH 8,0, casi no hay otras proteínas, excepto HP-NAP se recuperan de la fracción no unida. Este enfoque purificación utilizando cromatografía de intercambio iónico de DEAE en el modo negativo es simple y ahorrando al permitir la purificación de HP-PAN recombinante mediante cromatografía de un solo paso a través de la recogida de la fracción no unida tiempo. Además de HP-NAP, varias otras biomoléculas, tales como virus 17, la inmunoglobulina G (IgG) 18, la hemoglobina 19, la proteína fosfatasa 20, y el factor de virulencia flagelina 21, también se han informado de que se purificó por cromatografía de intercambio de iones en negativo modo. Se prefiere el modo negativo para la cromatografía de intercambio iónico, si las impurezas son el menorcomponentes presentes en la muestra sometida a purificarse 22. La aplicación de la cromatografía negativo en la purificación de biomoléculas naturales o recombinantes se ha revisado recientemente 23. El presente informe ofrece un paso a paso el protocolo para la expresión de HP-PAN recombinante en E. coli, lisis de las células, y la purificación de HP-NAP usando cromatografía por lotes modo negativo con resinas de intercambio iónico de DEAE. Si una proteína deseada para la purificación es adecuado para cromatografía de intercambio iónico en el modo negativo, el protocolo descrito también podría ser adaptado como punto de partida para el desarrollo de un proceso de purificación.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>preparado como se describe en los datos suplementarios de la Referencia 15&nbsp; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 Kanamicina</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx Isopropilo &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>MD Biomedical Inc</td><td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20</td></tr><tr><td>fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>inhibidor de la proteasa http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-alfa-tosil-L-lisinil-clorometilcetona (TLCK)</td>Inhibidor de la proteasa <td>Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td><td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>N-tosil-L-fenilalaninil-clorometilcetona (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td> Inhibidor de la proteasa <td>T4376</td><td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Estándar de proteínas (albúmina sérica bovina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&nbsp;</td><td>una proteína estándar para Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>DEAE&ndash; Sephadex &nbsp; Forma de cloruro A-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>Tubo</td>de</tr><tr><td>diálisis de espectro http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&region=TW/Por</td><td>Spectrum</td><td>Spectrum 132720</td><td>con corte de peso molecular de 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td></tr><tr><td>Unidades Acrodisc&reg; con Mustang&reg; Membrana E</td><td>Pall MSTG25E3</td><td></td><td>para la eliminación de endotoxinas; operado a caudales que oscilan entre 1 y 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal de ratón MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>levantado contra el HP-NAP purificado de la cepa NCTC 11637 de H. pylori como se describe en la Referencia 23; &nbsp; Un regalo de los doctores Evanthia Galanis e Ianko D. Iankov de Mayo Clinic, EE. UU http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28989335</td><td>para cromatografía de filtración en gel http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td></tr><tr><td>Kit de tinción de plata PlusOne, proteína</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>17-1440-02</td><td>para la centrifugación en gradiente de densidad para purificar neutrófilos humanos http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td></tr><tr><td>Placa blanca de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>protegida de la luz http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Expand &nbsp; Sistema de PCR de plantilla larga</td><td>Sigma-Aldrich 11681834001</td><td></td><td>fuente de mezcla de enzimas de PCR de alta fidelidad http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td></tr><tr><td>E. coli DH5 y alfa;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de producto</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV/VIS de doble haz U-2800</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td>N/A</td><td>fuera del mercado y actualizado a un nuevo modelo http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>homogeneizador de alta presión EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin Inc</td><td></td><td>C315320 http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>Hitachi Koki himac CP80WX ultracentrífuga general</td><td>Hitachi Koki Co</td><td>90106401</td><td>para la separación de las fracciones proteicas solubles e insolubles de lisados de E. coli http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1900-26</td><td>para cromatografía de filtración en gel http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td></tr><tr><td>Aviv modelo 62ADS Espectrofotómetro CD</td><td>Aviv Biomedical</td><td>N/A</td><td>fuera de mercado y actualizado a un nuevo modelo http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td></tr><tr><td>sistema de imagen LAS-3000</td><td>Fujifilm</td><td>N/A</td><td>descatalogado y reemplazado http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>Contador multietiqueta Wallac 1420 (Victor2)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>1420-018</td><td>para detección de quimioluminiscencia http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td></tr></tbody></table>

de un solo paso negativo purificación cromatográfica de<em&gt; helicobacter pylori</em&gt; la proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; escherichia coli</em&gt; en modo batch

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) es un importante factor de virulencia de Helicobacter pylori (H. pylori). Desempeña un papel crítico en H. pylori inducida por inflamación gástrica mediante la activación de varios leucocitos innatos incluyendo neutrófilos, monocitos y mastocitos. Las propiedades inmunogénicas e inmunomoduladoras de HP-NAP lo convierten en un candidato potencial de diagnóstico y de vacuna para H. pylori y un nuevo fármaco candidato para la terapia del cáncer. Con el fin de obtener cantidades sustanciales de purificado HP-NAP utilizado por sus aplicaciones clínicas, un método eficaz para purificar esta proteína con alto rendimiento y pureza necesita ser establecido. En este protocolo, hemos descrito un método para una sola etapa de purificación cromatográfica negativo de HP-NAP recombinante sobreexpresada en Escherichia coli (E. coli) mediante el uso de dietilaminoetilo resinas de intercambio iónico (DEAE) (por ejemplo., Sephadex) iel modo por lotes n. Recombinante HP-PAN constituye casi el 70% del total de proteínas en E. coli y está casi completamente recuperado en la fracción soluble tras la lisis celular a un pH de 9,0. Bajo la condición óptima a pH 8,0, la mayoría de HP-NAP se recupera en la fracción no unida, mientras que las proteínas endógenas de E. coli se eliminan de manera eficiente por la resina. Este método de purificación mediante cromatografía de lote modo negativo con resinas de intercambio iónico DEAE produce funcional HP-NAP de E. coli en su forma nativa con alto rendimiento y pureza. El HP-PAN purificada podría ser utilizado más para la prevención, tratamiento y pronóstico de la H. pylori -asociado enfermedades, así como la terapia del cáncer.

El diagrama esquemático del procedimiento experimental de la purificación negativa de recombinante HP-NAP expresa en E. coli mediante el uso de resinas de intercambio iónico de DEAE en modo por lotes se muestra en la Figura 1. Esta técnica de purificación se basa en la unión de proteínas y / o impurezas que no sean HP-PAN a la resina de la célula huésped. A pH 8,0, casi no hay otras proteínas, excepto HP-NAP en su forma nativa se recuperan de la fracción no unid...

Un método de alto rendimiento para la purificación negativa de un solo paso de Helicobacter pylori recombinante proteína activadora de neutrófilos (HP-PAN) sobreexpresado en Escherichia coli mediante el uso de resinas de dietilaminoetilo en modo batch se describe. HP-PAN purificado por este método es beneficioso para el desarrollo de vacunas, medicamentos o diagnósticos para H. pylori -asociado enfermedades.

De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En modo batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

El objetivo general de esta purificación es obtener la proteína de activación de neutrófilos de Helicobacter pylori, o HP-NAP, funcional en su forma nativa, con alta pureza y alto rendimiento, utilizando cromatografía por lotes en modo negativo con resina de intercambio iónico di-etil amino-etil. La principal ventaja de esta técnica es que la HP-NAP puede purificarse en su forma nativa en un solo paso, con alta pureza y alto rendimiento. La purificación negativa de la HP-NAP comienza con un procedimiento de unión por lotes, en el cual la fracción proteica soluble proveniente de lisados bacterianos se añade a la resina DEAE.Se incuba la mezcla para permitir que las proteínas se unan por completo a la resina. La HP-NAP presente en la fracción no unida se obtiene luego mediante centrifugación o flujo gravitatorio. Las implicaciones de esta técnica son la prevención, el tratamiento y el pronóstico de enfermedades asociadas con Helicobacter pylori, así como la terapia contra el cáncer, en una proporción de 10:1.Debido a las propiedades inmunogénicas e inmunomoduladoras de HP-NAP. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades. Porque HP-NAP se agrega fácilmente durante la esterilización.Demostrará el procedimiento Zhi-Wei Hong, un estudiante de posgrado de nuestro laboratorio. Trabajando a cuatro grados Celsius, suspendemos 50 mililitros de la pasta celular preparada según se describe en el protocolo del texto en 20 mililitros de tampón tris con baja salinidad a pH 9,0 con mezcla de inhibidores de proteasa. Es fundamental mantener la muestra a cuatro grados Celsius para permitir que el procedimiento evite la agregación de proteínas.Rompa las células bacterianas pasando la suspensión bacteriana a través de un homogeneizador de alta presión operado a un rango de 15.000 a 20.000 PSI durante siete veces a cuatro grados Celsius. Después de la lisis bacteriana, se debe centrifugar inmediatamente. Transfiera las muestras homogeneizadas a un tubo de centrífuga.Centrifugar inmediatamente el lisado celular a 30.000 ×g a cuatro grados Celsius durante una hora para separar las fracciones proteicas solubles e insolubles utilizando una ultracentrífuga. Tras la centrifugación, transferir el sobrenadante como fracción proteica soluble a un vaso de precipitados. Medir la concentración proteica de la fracción proteica soluble mediante el método de Bradford utilizando un kit comercial con albúmina sérica bovina como estándar, según las instrucciones del fabricante.Luego, agregue 177,6 µL de HCl 1 N a 20 mL de la fracción de proteína soluble para ajustar su valor de pH de pH 9,0 a pH 8,0. Agregue Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, y 50 mL de cloruro de sodio a la solución de proteína para obtener una concentración final de proteína de 0,5 mg/mL. Para preparar 15 mL de resina DEAE, suspenda 0,6 g de polvo seco de resina DEAE en 30 mL de tampón Tris-HCl a temperatura ambiente durante al menos un día.Centrifugar la resina a 10.000 veces G a cuatro grados Celsius durante un minuto y luego retirar y descartar el sobrenadante. A continuación, añadir 15 mililitros de tampón Tris-HCl. Después de repetir los pasos de centrifugación y resuspensión cuatro veces más, almacenar los 15 mililitros de resina sedimentada a cuatro grados Celsius para su uso posterior.Trabajando a cuatro grados Celsius, agregue 45 mililitros de las proteínas solubles preparadas a mililitros de la resina y transfiera a un vaso de precipitados de 100 mililitros con barra de agitación. Agite la suspensión de proteína-resina utilizando una placa magnética a cuatro grados Celsius durante una hora. A continuación, vierta la suspensión de proteína-resina en una columna de plástico o vidrio equipada con una llave de paso y permita que la resina sedimente por gravedad.Abra la llave para permitir que la solución de proteína fluya a través de la columna por gravedad hasta que el nivel del líquido en la columna esté justo por encima de la resina. Recoja el flujo saliente como la fracción no unida, que contiene la proteína activadora de neutrófilos purificada. Añada 15 mililitros del tampón Tris-HCl frío a la columna.Abra nuevamente la llave de paso para permitir que el tampón de lavado fluya a través de la columna por gravedad hasta que el nivel del líquido en la columna esté justo por encima de la resina. Recopile el flujo saliente como la fracción de lavado. Repita el lavado con tampón frío con hielo cuatro veces más para recolectar fracciones de lavado adicionales.Luego, agregue 15 mililitros de Tris-HCl 20 milimolar frío con hielo, pH 8,0, con cloruro de sodio 1 molar al cilindro. Recopile el flujo descendente como las fracciones de elución, como antes. Repita los pasos de elución otras cuatro veces para recopilar fracciones de elución adicionales.El efecto del pH sobre la solubilidad de HP-NAP en el lisado de E. coli se muestra aquí. La cantidad de HP-NAP detectada en esta fracción soluble aumentó notablemente entre pH 7,5 y 9,5. La recuperación del HP-NAP recombinante fue casi completa en la fracción soluble tras la lisis celular a pH 9,0.Aquí se muestra el efecto del pH sobre la purificación negativa de HP-NAP recombinante expresado en E.coli mediante resinas DEAE en modo lote. A pH 8,0, solo una pequeña cantidad de HP-NAP estuvo presente en la fracción de elución. La cantidad de HP-NAP presente en las fracciones no unidas fue la más alta a pH 8,0.La cantidad optimizada de proteínas cargadas sobre la resina DEAE es de 1,5 miligramos de proteína por mililitro de resina para lograr la capacidad máxima de la resina para absorber las impurezas de E.coli. A pH 8,0, muy pocas proteínas distintas de HP-NAP en su forma nativa se recuperan en la fracción no unida utilizando resinas DEAE en modo lote. La pureza de HP-NAP fue superior al 95 por ciento.El HP-NAP purificado se pliega en un multímero con una estructura secundaria de hélice alfa, tal como lo muestra el cromatograma de filtración en gel y el espectro de dicromismo circular en el ultravioleta lejano. Un ensayo de quimioluminiscencia dependiente de luminol revela que el HP-NAP purificado es capaz de inducir la producción de especies reactivas de oxígeno por los neutrófilos. Una vez dominadas, estas técnicas pueden realizarse en menos de cinco horas si se llevan a cabo adecuadamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar HP-NAP funcional en su forma nativa con alto rendimiento y pureza, utilizando cromatografía por lotes en modo negativo con resina DEAE e intercambio iónico. Al intentar este procedimiento, es importante recordar el uso de tampones con el pH adecuado en el paso de esterilización durante la cromatografía por lotes. Tuvimos la idea de este método cuando intentamos aplicar otros enfoques cromatográficos en lugar de la filtración para purificar HP-NAP en su forma nativa.Aunque este método está diseñado para aplicarse mediante HP-NAP recombinante expresado en E.coli, también puede utilizarse en otros sistemas de expresión bacteriana, como per-sida sep-tidas. La demostración visual de esta medida es código rápido.Además, los pasos de esterilización y cromatografía por lotes son difíciles de aprender, ya que estos pasos deben realizarse a cuatro grados Celsius sin ningún retraso en el tiempo. Si una proteína diseñada para purificación es adecuada para nuestra cromatografía de intercambio en modo negativo, este procedimiento también podría adaptarse como punto de partida para el desarrollo de un proceso de purificación.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación clínica exploraran la posibilidad de utilizar HP-NAP en la terapia contra el cáncer, así como en el desarrollo de vacunas, fármacos y diagnósticos para enfermedades asociadas con Helicobacter pylori.

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