Formando polímerosomas de tamaño gigante Uso de rehidratación asistida-Gel

El objetivo general de este método de rehidratación asistida por gel es formar de forma robusta vesículas poliméricas gigantes unilamelares intactas en las que se pueda controlar fácilmente la distribución del tamaño de las vesículas. Este método ofrece una alternativa robusta para la formación de vesículas poliméricas, que pueden utilizarse para investigar las propiedades físicas de la membrana y luego integrar esas vesículas en aplicaciones de bioingeniería. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de producir fácilmente cientos de vesículas poliméricas gigantes intactas mucho más rápidamente y de una manera menos laboriosa que las técnicas tradicionales.

Entonces, la idea surgió cuando nos enteramos de la técnica de rehidratación asistida por gel para formar vesículas lipídicas gigantes. Sin embargo, nuestros métodos actuales para formar polimerosomas gigantes son desafiantes y, a menudo, de bajo rendimiento, por lo que decidimos utilizar esta metodología como un enfoque alternativo. Comience la preparación de la solución polimérica agitando cinco miligramos de copolímero dibloque PEO-PBD en un mililitro de cloroformo en un vial de vidrio hasta que se disuelva por completo.

Agregue una solución de cinco miligramos por mililitro de polímero y cloroformo y una solución de un miligramo por mililitro de lípidos y cloroformo marcados con fluorescencia a un nuevo vial hasta obtener una concentración final de 99.5 por ciento molar de polímero y 0.5 por ciento de lípidos. Para minimizar la evaporación, transfiera la solución de polímero a un vial hermético con una tapa resistente al cloroformo y guárdelo a 20 grados centígrados para su uso posterior. Para comenzar la preparación de la película de agarosa, agregue 50 mililitros de agua y 0,5 gramos de agarosa estándar a un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros.

Hervir durante un minuto en el microondas. Antes de continuar, enfríe la solución de agarosa a entre 65 y 75 grados centígrados para evitar una mala adherencia o aglomeración. A continuación, corte el extremo de una punta de pipeta de 1000 microlitros y utilícela para pipetear 300 microlitros de la solución de agarosa en un cubreobjetos de vidrio cuadrado de 25 mililitros.

Mientras usa guantes, sujete el borde del cubreobjetos y extienda la agarosa de manera uniforme por toda la superficie con el borde largo de otra punta de pipeta de 1000 microlitros. Coloque el cubreobjetos con el lado de la agarosa hacia arriba sobre el parafilm e incube a 37 grados centígrados durante al menos una hora. A continuación, pipeteando 30 microlitros de la solución polimérica previamente preparada en el cubreobjetos recubierto de película de agarosa.

Sostenga el borde deslizante de la cubierta con los dedos enguantados y extienda la solución de polímero sobre la película de agarosa con un movimiento circular usando el borde largo de una aguja de calibre 18. Termine colocando el cubreobjetos con el polímero hacia arriba en una placa de Petri de plástico dentro de un desecador al vacío. Evacúe el desecador durante al menos una hora para eliminar cualquier disolvente residual.

Para formar polímeros, primero adhiera un pozo de cubierta al lado de polímero del cubreobjetos recubierto presionando suavemente hasta que se forme un sello hermético. Luego, agregue de 200 a 500 microlitros de solución de rehidratación a la cámara. A continuación, coloque una toallita de laboratorio enrollada en húmedo a lo largo del borde interior de una placa de Petri de vidrio para formar una cámara de humedad.

Coloque el cubreobjetos con la tapa adherida bien en el plato y cúbralo con una tapa. Cubra la placa de Petri con papel de aluminio para minimizar el fotoblanqueo y luego colóquela en una placa caliente a 40 grados centígrados durante al menos 30 minutos para completar la formación de polímeros. Para comenzar el proceso de obtención de imágenes FRAP, coloque el cubreobjetos con el pozo de cubierta adherido en la platina de un microscopio de fluorescencia invertida equipado con un condensador ajustable.

A continuación, seleccione un conjunto de filtros basado en el lípido fluorescente utilizado y obtenga imágenes de los polimerosomas en la superficie superior del cubreobjetos utilizando un objetivo de aceite 100X. Para caracterizar la fluidez de la membrana utilizando FRAP, primero concéntrese en un polimeroso, luego cierre el condensador del microscopio a una apertura pequeña y asegúrese de que los bordes del polimeroso se encuentren dentro del campo de imagen. Posteriormente, aumente la exposición de la cámara, elimine todos los filtros de densidad neutra y permita que la región de interés se blanquee fotográficamente durante 30 a 60 segundos.

Finalmente, apague la lámpara y abra completamente el condensador. Disminuya la exposición a la configuración inicial y capture imágenes cada 30 segundos durante tres minutos. Abra el software de análisis de imágenes en la computadora del microscopio y cargue las imágenes adquiridas de los polimersomas.

Establezca la escala para la medición abriendo el menú desplegable Analizar y seleccionando la opción Establecer escala. Introduzca las unidades de calibración adecuadas para la distancia en píxeles, la distancia conocida y la unidad de longitud y, a continuación, seleccione Aceptar. A continuación, utilice la caja de herramientas de línea y dibuje una línea que abarque el diámetro de un polimero seleccionado.

Mida el diámetro del polimerosoma abriendo el menú desplegable Analizar y seleccionando Medir. Para facilitar el análisis, utilice el control más D para imprimir la línea de medición en la imagen antes de pasar al siguiente polímero. Continúe midiendo polimerosomas utilizando el procedimiento anterior y agregue cada medición a la ventana de datos hasta que se complete.

Por último, guarde los datos haciendo clic en Archivo y Guardar como.Haga clic en Guardar en la ventana que se abre y, a continuación, abra el archivo de resultados como una hoja de cálculo para analizar los datos. Los polimerosomas formados a partir de películas poliméricas de PEO-PBD rehidratadas con varios tampones se obtuvieron mediante microscopía de fluorescencia. Las imágenes muestran que los polimerosomas no son homogéneos en tamaño bajo las diferentes condiciones de rehidratación, con un diámetro típicamente inferior a 10 micrómetros.

Las imágenes de epifluorescencia de los polimerosomas formados en el agua a diferentes temperaturas muestran que a medida que aumenta la temperatura de rehidratación, se forman polimerosomas más grandes. Se calcularon los diámetros promedio para más de 100 polimerosomas formados en agua a diferentes temperaturas de rehidratación. A 24 grados centígrados, el diámetro medio fue de 2,93 micrómetros, aumentando hasta los 14,04 micrómetros a 70 grados centígrados.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante mantener los polimerosomas en solución en todo momento. Asegúrese de que el cubrebocas esté bien sujeto, al cubreobjetos para evitar fugas de la solución de rehidratación y el secado de los polimerosos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar métodos como la microscopía electrónica para comprender las propiedades estructurales adicionales de los polimerosomas. Esta técnica allana el camino para la investigación en biología sintética y bioingeniería para explorar los polimerosomas como una alternativa robusta y químicamente adaptable a las membranas lipídicas para la investigación y la interfaz abiótico-biótica, la investigación de administración de fármacos y los sistemas de protocélulas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo formar polímeros gigantes de manera robusta utilizando la rehidratación asistida por gel, ajustar el tamaño general de las vesículas y caracterizar la integridad de su membrana.

No olvide que trabajar con cloroformo o agarosa y agujas puede ser peligroso. Preste mucha atención mientras realiza estos procedimientos. Tome precauciones, como trabajar en una campana extractora y use gafas y guantes en todo momento.