Name: Formando polímerosomas de tamaño gigante Uso de rehidratación asistida-Gel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprende a formar polímerosomas gigantes mediante rehidratación asistida por gel usando copolímeros PEO-PBD. Este método rápido permite controlar el tamaño de vesículas para estudios de propiedades de membrana y aplicaciones de bioingeniería.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nos gustaría agradecer al Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez y Dr. Walter F. Paxton por su experiencia técnica, consejos y ayuda en este trabajo. Este trabajo contó con el apoyo del Departamento de Energía de los Estados Unidos, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía, División de Ciencias de los Materiales e Ingeniería (BES-MSE). ACG, DYS y GDB contaron con el apoyo de BES-MSE. Este trabajo se realizó, en parte, en el Centro de Nanotecnologías Integradas, una instalación de usuario de la Oficina de Ciencia operada por la Oficina de Ciencia del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE) (número de proyecto de usuario RA2015A0004, PI: ACG).

1. Polímeros y Agarosa Preparación Nota: Los guantes y una bata de laboratorio se debe usar en todo momento a lo largo de este protocolo. Las gafas de seguridad son igualmente necesarios durante el trabajo con cualquier disolvente orgánico o en cualquier fase con posibles salpicaduras. <ol><li> Preparar una solución de 5 mg / ml de polímero en cloroformo. Añadir 1 ml de cloroformo a 5 mg de poli sólido (óxido de etileno) - poli b- (butadieno) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) de copolímero de dibloque en un vial de vidrio y agitar para disolver completamente. Realizar todos los pasos utilizando cloroformo en una campana de humos química. </li><li> Mezclar en un lípido marcado con fluorescencia (comprado ya disuelto en cloroformo) a una concentración final de 0,5% en moles de polímero sin marcar 99,5% en moles. <ol><li> Por ejemplo, la pipeta ~ 12 l de un lípido 1 mg / ml marcado con fluorescencia en cloroformo en 997,58 l PEO-PBD, EO 22 -BD 37 de polímero en cloroformo (con un peso molecular de 2.950 Daltons) para una concentración final de 0.5% en moles esfingosina marcada mezcla y 99.5% de polímero mol. </li><li> Conserve la solución en un frasco hermético con una tapa cloroformo resistente a -20 ° C. Envuelva la cinta fontaneros en el borde del vial, donde los tornillos de la tapa sobre el vial y asegurar la tapa en el frasco. Envolver otro trozo de cinta fontaneros en el exterior de la tapa y, finalmente, envolver Parafilm en el exterior de la cinta para asegurar una evaporación mínima. </li></ol></li><li> Hacer una solución de agarosa al 1% w / v mediante la mezcla de 0,5 mg de agarosa estándar en 50 ml de agua (o 50 ml 100 mM de sacarosa) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Hervir la solución de agarosa en un microondas estándar para ~ 1 min (o hasta que esté completamente disuelto como se ha señalado por el desmonte de la solución). Nota: La solución de agarosa se puede utilizar después de unos minutos de enfriamiento o se deja solidificar, almacenada y re-fundidos usando el mismo procedimiento. </li></ol> 2. Preparación de película de agarosa <ol><li> Corte el extremo de una punta de pipeta de 1.000 l para evitar la obstrucción. Con la punta de corte, 3 pipeta00 l de solución de agarosa fundida sobre un cuadrado de 25 mm cubreobjetos de cristal directamente desde el fabricante. </li><li> Permitir que la agarosa se enfríe a ~ 65-75 ° C antes de la deposición. Si la agarosa es demasiado frío, comenzará a acumularse en la superficie durante el proceso de difusión. Por el contrario, si la agarosa es demasiado caliente, se requerirá más difusión para adherir la agarosa a la superficie. </li><li> Almacenar casi el borde del cubreobjetos con los dedos enguantados y utilizar el borde largo de la otra punta de la pipeta de 1.000 l para difundir la agarosa de manera uniforme en toda la superficie del cubreobjetos. Mueva la punta de la pipeta de ida y vuelta a través del cubreobjetos hasta que la agarosa se adhiere por completo a y cubre el cubreobjetos. </li><li> Coloque el cubreobjetos de agarosa-revestido sobre un trozo de Parafilm con la agarosa hacia arriba. Una vez se recubren el número deseado de cubreobjetos, coloque el Parafilm con los cubreobjetos en una incubadora a 37 ° para deshidratar la agarosa sobre la superficie durante al menos 1 hr. Nota: La deshidrataciónse determina por la desaparición de la capa visible de agarosa; el cubreobjetos debe tener aspecto liso y claro. Una vez que las películas son totalmente deshidratado, tienda de cubreobjetos con la superficie de agarosa hacia arriba en una placa de Petri de plástico desechable. </li></ol> 3. Formación de película de polímero <ol><li> Pipeta 30 l preparados solución de polímero sobre la película de agarosa. </li><li> Almacenar casi el borde del cubreobjetos con los dedos enguantados y utilizar el borde largo de una aguja de 18 G para extender la solución a través de las películas de agarosa utilizando un movimiento circular de difusión. Continuar la difusión hasta que se evaporó la solución. Nota: Tenga cuidado de la punta de la aguja. </li><li> Colocar las películas de polímero en un lado de polímero placa de Petri de plástico hacia arriba y poner la placa de Petri en un desecador de vacío de la casa estándar cubierto con papel de aluminio (para evitar photobleaching de la esfingosina marcada) durante al menos 1 h para eliminar totalmente cualquier disolvente residual. </li></ol> 4. Formación de Polymersomes <ol><li> Adherir una coverwell, ya sea un polidimetilsiloxano hecho en casa (PDMS) bien (a ~ 0,5 cm de espesor de bloques de PDMS curado con ~ 1 cm de diámetro de la parte media troquelan) o una disponible en el mercado, así que el cubreobjetos recubierto con la película de polímero. Pulse el coverwell suavemente sobre el cubreobjetos recubierto con polímero con el polímero hacia arriba hasta que se forma un sello hermético entre la coverwell y el cubreobjetos. Tenga cuidado de no presionar demasiado y romper el cubreobjetos. </li><li> Añadir la solución de rehidratación 200-500 l (agua está muy bien, pero una serie de tampones o medios de comunicación también funciona) a la cámara (volumen de rehidratación depende del tamaño de la coverwell adherido). </li><li> Crear una cámara de humedad para disminuir la evaporación de la solución de rehidratación. Coloque un Kimwipe laminado, húmedo a lo largo de los bordes de una placa de Petri de vidrio. Coloque la película de polímero con el coverwell adherido a la cámara de humedad y cubrir con una tapa. Cubrir la placa de Petri con papel de aluminio para reducir al mínimo photobleaching. Lugarla placa de Petri sobre una placa caliente ajustada a 40 ° C durante al menos 30 min. </li><li> Ajuste la temperatura de la placa caliente durante la rehidratación a partir 24-70 ° C para ajustar el tamaño de las vesículas formadas (Figura 5). 70 ° C es cerca de la Tm de la agarosa por lo que se debe tener precaución cuando se avanza más allá de esta temperatura. </li></ol> 5. Caracterización de polímerosomas de recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) <ol><li> Mueva el cubreobjetos con el adherido coverwell directamente a un microscopio invertido para la imagen. </li><li> Seleccione el conjunto de filtro adecuado en función de los lípidos fluorescente incluido en la solución de polímero. Para lípidos marcados con rodamina dopados en las soluciones de polímeros, utilizar un filtro de 560/25 nm de excitación y un filtro de 607/36 nm de emisión, o conjuntos de filtros comparables. </li><li> Utilice un objetivo de aceite 100X para concentrarse en la superficie superior del cubreobjetos en la que se adhieren los polímerosomas. Si los polímerosomas son especialmentegrandes (&gt; 20 micras) o si la película de polímero es demasiado gruesa, un objetivo de potencia más bajo (por ejemplo, 40X) se debe utilizar para visualizar mejor los polímerosomas. </li><li> Identificar los polímerosomas utilizando microscopía de fluorescencia. Identificar polímerosomas por la vesícula característica hueco, esférica con un diámetro&gt; 5 micras. </li><li> Caracterizar fluidez de la membrana mediante la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) en un microscopio de fluorescencia que contiene un condensador ajustable. Debido a la naturaleza adherente y apretado embalaje de polímerosomas sobre los sustratos, el movimiento natural de los polímerosomas está limitado, el aumento de la calidad de imagen FRAP. <ol><li> Enfocar el microscopio en el polimersoma de interés. Cierre el condensador a una pequeña región y asegurar que el borde de una polimersoma es dentro de la región de imagen de interés. </li><li> Aumentar la exposición de la cámara y asegurar todos los filtros de densidad neutra se retiran para photobleach efectivamente la región de interés. Permitir que la membrana fl<html> fluorescencia intensidad para photobleach durante 30-60 seg o hasta que la intensidad de la fluorescencia disminuye significativamente. </li><li> Apagar la lámpara y abra completamente el condensador. Disminuir la exposición a los valores de partida y comenzar de inmediato la captura de imágenes cada 30 segundos durante 3 minutos. </li><li> Calcular los coeficientes de difusión de membrana utilizando métodos estándar 12. Si la región blanqueada recupera la intensidad de fluorescencia dentro del 3-5 min, esto indica que la membrana es fluido. </li></ol></li></ol> 6. Caracterización de polimersoma Tamaño <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig6.jpg" /> Figura 6. Proceso para el análisis del tamaño de polímerosomas utilizando software de imagen. Paso a paso las instrucciones sobre cómo medir el diámetro de las vesículas formadas. El usuario debe conocer las unidades de calibración en píxeles / m del microscopio usado.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <ol><li> Abrir las imágenes adquiridas de polímerosomas en el software de análisis de imagen 13. </li><li> Establecer la escala de la imagen haciendo clic en el cuadro desplegable y analice la &quot;escala de conjunto&quot; clic. <ol><li> Calibrar la báscula para el microscopio utilizando métodos estándar (es decir, un micrómetro). </li><li> Rellenar las unidades de calibración y haga clic en &quot;ok&quot;. </li></ol></li><li> Haga clic en la caja de herramientas de línea y dibujar una línea que atraviesa el diámetro de una vesícula. </li><li> Recoge las mediciones de longitud haciendo clic en el cuadro analice desplegable y haciendo clic en &quot;medida&quot;. </li><li> Continuar midiendo las vesículas individuales siguiendo el procedimiento anterior y se añadirá a la ventana de mediciones de datos cada nueva medición. </li><li> Pulse la tecla &quot;Ctrl + D&quot; después de dibujar cada línea y la medición de la longitud para imprimir la línea trazada en elimagen por lo que es fácil el seguimiento de los cuales han sido analizados vesículas. </li></ol>

<ol><li>Streicher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+reconstituted+in+GUVs%3A+A+biomimetic+system+to+study+initial+steps+of+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).</li>
<li>Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Assembly+of+Polymer+Nanotube+Networks+via+Kinesin+Powered+Microtubule+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments.</a> Nanoscale. , (2015).</li>
<li>Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a, Bates, F. S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+dependence+of+polymersome+membrane+structure%2C+elasticity%2C+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability.</a> Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).</li>
<li>Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+polymersome+surfaces%3A+functionalization+with+dendritic+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups.</a> Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).</li>
<li>Egli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+functionalization+of+polymersome+surfaces%3A+A+new+approach+to+surface+immobilization+and+cell+targeting+using+polymersomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).</li>
<li>Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymersome+nanoreactor+with+controllable+permeability+induced+by+stimuli-responsive+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers.</a> Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).</li>
<li>Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxide+ion+flux+and+pH-gradient+driven+ester+hydrolysis+in+polymer+vesicle+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors.</a> Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).</li>
<li>Henderson, I. M., Paxton, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt%2C+shake%2C+fuse+-+Giant+hybrid+polymer%2Flipid+vesicles+through+mechanically+activated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Salt, shake, fuse - Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).</li>
<li>Discher, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+Tough+Vesicles+Made+from+Diblock+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers.</a> Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).</li>
<li>Howse, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Templated+formation+of+giant+polymer+vesicles+with+controlled+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions.</a> Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).</li>
<li>Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in+Solutions+of+Physiologic+Ionic+Strength+Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in+Solutions+of+Physiologic+Ionic+Strength%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength.</a> J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
</ol>

Sandia National Laboratories es un laboratorio de múltiples programas administrado y operado por Sandia Corporation, una subsidiaria de propiedad total de Lockheed Martin Corporation, para la Administración Nacional de Seguridad Nuclear del Departamento de Energía de EE. UU. bajo el contrato DE-AC04-94AL85000.

Polímerosomas están llegando a ser ampliamente explorados como miméticos de membrana biológica. Las propiedades robustas y versátiles de polímeros los hace muy atractivos para los estudios que requieren funcionalización membrana, longevidad y capacidad de respuesta sintonizado. Los métodos tradicionales para la formación de polímerosomas de tamaño gigante 9,10 (&gt; 4 micras) son mano de obra intensiva y requieren equipos costosos y especializados. A continuación, presentamos por primera vez, un método rápido, versátil y robusto para la formación de polímerosomas de tamaño gigante que utilizan reactivos de laboratorio de bajo costo estándar y el equipo. El uso de la rehidratación en gel asistida, polímerosomas unilamelares se pueden formar rápidamente (&lt;30 min), en una variedad de soluciones de rehidratación (incluyendo medios de cultivo celular) y con una variedad de diferentes polímeros (datos no mostrados). No se observó la formación de vesículas multilamelares o asimétricos utilizando esta técnica. A lo largo de este trabajo, se utilizó poli (óxido de etileno) - poli b- (butadieno) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) copolímero de dibloques neutro. Muchas composiciones de polímeros diferentes (incluyendo copolímeros de dos bloques cargados) funcionan bien con este método (que no se muestra). Sin embargo, algunos copolímeros de tres bloques disponibles en el mercado y copolímeros de bloque doble de peso molecular más alto (~&gt; 5.000 Dalton) no forman polímerosomas distintas. Para todos los experimentos en este manuscrito, una baja concentración de lípido marcado se dopado en las soluciones de polímeros sólo para fines de visualización. Otros métodos para la visualización, incluyendo polímeros funcionalizados directamente con un colorante fluorescente también se pueden utilizar. Polímerosomas mismo modo se pueden obtener imágenes con microscopía de campo claro, aunque microscopía de fluorescencia proporciona una mayor resolución. La mayoría de las modificaciones menores en el protocolo normalmente no alteran los resultados. Por ejemplo, pequeñas diferencias en la concentración de la solución de polímero extiende sobre los cubreobjetos no alteran la formación del polímero fILM formado. Aunque no se determinó el intervalo de concentración completa, la formación polimersoma se producirá con éxito con una amplia gama de concentraciones de película de polímero (por ejemplo, 1 a 10 mg / ml). Sin embargo, hay algunas alteraciones de protocolo que no afectan negativamente a la formación de polimersoma. El más notable es que los cubreobjetos de vidrio redondos (en lugar de cuadrada) en consecuencia muy pobre formación de polímerosomas. Atribuimos esto a la capa extremadamente uniforme de agarosa en el cristal que en realidad impide la formación de polímerosomas. Uno de los desafíos más notables de esta técnica es la capacidad de recuperar los polímerosomas de la superficie con un alto rendimiento. Hay ciertos casos en los que la eliminación de los polímerosomas de la superficie original puede ser ventajosa. Debido a la alta fluorescencia de fondo de la película de polímero deshidratado, eliminando polímerosomas individuales y adherirse a limpiar cubreobjetos aumentará la calidad de imagen y caracterización (particialmente durante el análisis FRAP). Para ello, pipeteado suave con una punta de pipeta en la que al final se ha cortado se desorber los polímerosomas de la superficie (aunque el número de vesículas recuperados es significativamente menor que las formadas originalmente). Polímerosomas entonces se pueden colocar en las superficies cubreobjetos modificados, lo que permite la polimersoma para interactuar con el nuevo cubreobjetos. Típicamente, para neutros polímerosomas PEO-PBD, cubreobjetos tratados con ozono durante 15 min permiten que los polímerosomas a caer a la superficie de formación de imágenes. Se requiere modificación de la superficie diferente para diferentes composiciones polimersoma (por ejemplo, negativa o positivamente cargado polímeros). La mayoría de los materiales utilizados en este protocolo son almacenados y utilizados con éxito durante días o semanas. La agarosa solidificada se puede recalienta y volver a utilizar hasta que la agarosa comienza a tener agregados incluso después de la ebullición, o de la agarosa solidificada comienza a secarse. Los cubreobjetos con películas de agarosa secos se pueden almacenar y usodía indefinidamente (por ejemplo, meses). El polímero disuelto en cloroformo se puede almacenar a -20 ° C durante varios meses. Una vez que la película de polímero se seca en las películas de agarosa, sin embargo, las películas necesitan ser almacenados bajo vacío y se utiliza dentro de las dos semanas (no se determinó directamente almacenamiento a largo plazo, pero hay diferencias notables en polímerosomas formadas a partir de películas de polímero mayor que dos semanas). Utilizando el protocolo de rehidratación en gel asistida que aquí se presenta, cientos de polímerosomas forma uniforme-se forman rápidamente con sólo unas pocas horas de trabajo de parto usando equipo estándar de laboratorio y reactivos de bajo costo. Además, polímerosomas se pueden formar en una variedad de soluciones tampón fisiológicas y de composiciones de polímero diferentes (no se muestra). Pequeñas alteraciones en el método no alteran negativamente la formación de polímerosomas, haciendo que la rehidratación en gel con ayuda de una técnica versátil y accesible para los científicos variando de correo técnicaXpertise. La posibilidad de crear fácilmente polímerosomas gigantes en la escala de tamaño de las células es esencial para la construcción de sistemas similares a células artificiales. La facilidad de uso y la versatilidad de la rehidratación en gel asistida para hacer estos polímerosomas ofrece un gran avance en el campo biomimético para la creación de sólidos imita de la membrana celular. Por ejemplo, usando esta técnica, las estrategias para la encapsulación de los diferentes componentes intracelulares, la funcionalización del polímero con las proteínas y la incorporación de proteínas de transporte de membrana de la membrana celular, sólo para nombrar unos pocos, puede ser diseñado para construir células artificiales a base de polimersoma.

Creación de vesículas sintéticas, de tamaño de células gigantes unilamelares (GUVs) es de creciente interés en la reconstrucción in vitro de diferentes procesos celulares para construir un marco para la generación de un sistema de célula de 1,2 como artificial. Mientras GUVs compuestas de membranas lipídicas son excelentes imitadores de membranas naturales, biológicos, que son inestables frente a las fluctuaciones ambientales y tienen una vida útil bastante corta. Debido a estas limitaciones, los copolímeros de bloques anfifílicos se han utilizado como imita de lípidos para formar vesículas de polímero, o polímerosomas. Dentro de este contexto, polímerosomas son ventajosos en el desarrollo de sistemas de células biomiméticos debido a su mayor estabilidad 3, versatilidad química 4,5 y rasgos físicos modificables 6 - 8. Los métodos actuales para formar polímerosomas de tamaño gigante incluyen electroformation 9 y rehidratación con plantilla de 10, ambos de which consumen mucho tiempo, los equipos de trabajo intensivo, requieren competencias específicas y producir bajos rendimientos de polímerosomas gigantes intactas. Un método de rehidratación gel asistida sencilla fue desarrollado recientemente para la producción de lípidos GUVs 11. A continuación, describimos una adaptación de la técnica de rehidratación en gel asistida para crear polímerosomas gigantes con composiciones de polímeros diferentes, tamaño controlado, y en diversas composiciones de amortiguamiento. En pocas palabras, el 1% w / v películas estándar electroforesis en gel de agarosa de ADN se deshidrató en un cubreobjetos de vidrio. soluciones de polímero preparado en cloroformo continuación, se extienden a través de la película de agarosa deshidratado y se dejó evaporar. Después de la eliminación completa del disolvente, las películas de polímero se rehidratan en el tampón de elección con un calentamiento moderado (40-70 ° C) y el gigante (&gt; 4 micras) polímerosomas tamaño se forman dentro de 30 min. Este método produce rápidamente cientos de polímerosomas totalmente intactos y bien formadas utilizando equipos de laboratorio estándar y reagents a un costo mínimo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema que representa el método de rehidratación en gel asistida. Polímerosomas gigantes compuestas de un copolímero de dos bloques se forman después de ~ 30 minutos de rehidratación. El bloque hidrófilo se denota en magenta y el bloque hidrófobo se denota en verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Matraz Erlenmeyer de 125 ml</td><td>VWR</td><td>89000-360</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de calibre 18</td><td>VWR</td><td>BD-305196</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos cuadrados de 25 mm</td><td>VWR</td><td>48366-089</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>A agarosa estándar para electroforesis en gel de ADN</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>288306-2L</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos comerciales</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>70336</td><td>Aisladores de silicona a presión para sellar</td></tr><tr><td>Fiji Software de análisis de imágenes</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Descarga gratuita: http://fiji.sc/Fiji&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Frasco de vidrio con tapa de teflón</td><td>VWR</td><td>66009-556</td><td>1,9 ml de capacidad, caja de 144</td></tr><tr><td>Liss-rodamina B PE Lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150C</td><td>1 mg de lípidos a una concentración de 1 mg/ml en cloroformo</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td>10,2 cm x 38,1 m</td></tr><tr><td>poli(óxido de etileno)-b-poli(butadieno) o PEO-PBD (con un peso molecular de 2.940)</td><td>Fuente polimérica</td><td>P2904-BdEO</td><td><a href="http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf">http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf</a></td></tr><tr><td>Pastic Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de teflón</td><td>VWR</td><td>300001-057</td><td>1/2" de ancho</td></tr></tbody></table>

formando polímerosomas de tamaño gigante uso de rehidratación asistida-gel

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

Las vesículas poliméricas, o polimerosomas, están siendo ampliamente exploradas como análogos sintéticos de las vesículas lipídicas en función de su estabilidad, robustez, propiedades de barrera, versatilidad química y características físicas sintonizables. Sin embargo, los métodos típicos utilizados para preparar vesículas de tamaño gigante (> 4 μm) requieren mucho tiempo y mano de obra, lo que produce un bajo número de polimerosomas intactos. Aquí, presentamos por primera vez el uso de la rehidratación asistida por gel para la formación rápida y de alto rendimiento de vesículas poliméricas gigantes (>4 μm) (polimerosomas). Con este método, los polimerosomas se pueden formar a partir de una amplia gama de soluciones de rehidratación, incluidos varios tampones fisiológicamente compatibles y medios de cultivo celular completos, lo que los hace fácilmente útiles para estudios de biomímesis. Esta técnica también es capaz de producir polimerosomas de forma fiable a partir de diferentes composiciones poliméricas con rendimientos mucho mejores y mucha menos dificultad que los métodos tradicionales. El tamaño del polimersoma se puede ajustar fácilmente alterando la temperatura durante la rehidratación o agregando fluidificantes de membrana a la membrana del polímero, generando polimerosomas de tamaño gigante (>100 μm).

Polímerosomas se formaron mediante el procedimiento descrito anteriormente (Figura 1) y el equipo de laboratorio común se muestra en la Figura 2. Polímerosomas se rehidrataron con agua desionizada (Figura 3) y captación de imagen sobre un microscopio invertido de epifluorescencia en el uso de un objetivo de aceite 100X. Tenga en cuenta que si polímerosomas no son visibles, podrían haber formado en tallas más grandes para capturar con un objetivo de aceite de 100X; puede necesitar ser utilizado en lugar de un objetivo de potencia inferior. Una de las ventajas del uso de la rehidratación en gel asistida es la versatilidad de formar polímerosomas en una variedad de soluciones de rehidratación. Polímerosomas se formaron con éxito en agua desionizada, un medio de mamífero completo de cultivo de células, las soluciones de sacarosa y dos soluciones tampón fisiológicamente relevantes (solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina tamponada con Tris (TBS)), como se muestra en la Figura 4. En condiciones estándar (rehidratacióncon agua a 40 ° C durante 1 hora), mayor que 70 ~ polímerosomas se encuentran típicamente por 40 x 40 m 2 campo de visión. Mientras que la producción de superficie de polímerosomas no es homogénea, hay docenas de campos de visión con este rendimiento representativo docenas. Además, polímerosomas eran estables en solución durante al menos 24 h. tamaño polímerosomas se sintoniza fácilmente mediante rehidratación películas de polímero a temperaturas variables. Polímerosomas formados en agua desionizada a RT tenían un diámetro medio de 2,9 ± 0,7 m. Como la temperatura aumenta durante la rehidratación, el tamaño medio de las polimersomas también aumenta (Tabla 1). A altas temperaturas (&gt; 60 ° C), polímerosomas formadas con tamaños incluso mayores que 100 micras (Figura 5). Todo el procesamiento de la imagen se completó con software de imágenes de código abierto (Figura 6).Imágenes recogidas fueron abiertos en el programa de software. El tamaño de píxel calibrado se ha introducido en la caja de escala establecida. Usando la herramienta de línea, las líneas se dibujan en todos los diámetros. Tras la extracción de cada línea individual, la longitud calibrada se midió y se agrega al cuadro de resultados. A continuación, los datos se pueden trazar en el software matemático de elección (por ejemplo, Excel, Prisma, origen, etc.) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig2.jpg" /> . Figura 2. Cuadro de los materiales de laboratorio comunes y económicos necesarios para la formación de polímerosomas Los elementos necesarios son: Parafilm, un 18,5 g de agujas, de polímero en cloroformo u otro disolvente apropiado, una punta de pipeta de 1.000 l, un matraz Erlenmeyer, pinzas, agarosa, 25 mm cubreobjetos cuadrados, pozos de imagen PDMS y una placa de Petri de vidrio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para</a>ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig3.jpg" /> Figura 3. Imágenes del método de rehidratación gel asistida. Disuelto agarosa se ​​extiende sobre un cubreobjetos cuadrado 25 mm hasta una aún capas de película todo el cubreobjetos. Los cubreobjetos se ponen entonces en una incubadora a 37 ° y la película es deshidratado. Una solución de polímero se deposita sobre la película de agarosa deshidrata y se extendió el uso de una aguja en un movimiento circular. El cubreobjetos se coloca a continuación en un desecador O / N se evapore totalmente cualquier residuo de disolvente. Por último, y cámara de imágenes se adhiere al sustrato y polímeros se rehidratan con solución de elección y se coloca en una placa de Petri a 40 ° C durante por lo menos 25 minutos para permitir la formación de polímerosomas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </p<html> &gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig4.jpg" /> Figura 4. polímerosomas pueden formar en una variedad de diferentes tampones. Películas de polímero PEO-PBD se rehidrataron con el tampón indicado a 40 ° C durante 1 hr. Barra de escala = 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig5.jpg" /> Figura 5. El aumento de la temperatura durante la rehidratación aumenta el tamaño de las polimersomas. Imágenes de epifluorescencia representativos de polímerosomas formados en agua a las temperaturas de rehidratación indicados. El aumento de temperatura produce polímerosomas más grandes. Barra de escala = 10 micras._blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Temperatura (° C) </td><td> Tamaño promedio (m) </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 2,93 ± 0,7 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 5,76 ± 2,5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 6,65 ± 2,4 </td></tr><tr><td> 60 </td><td> 11,46 ± 5,8 </td></tr><tr><td> 70 </td><td> 14.04 ± 7.0 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. El aumento de la temperatura durante la rehidratación resultados en el aumento de tamaño polimersoma. Los diámetros medios de más de 100 polímerosomas en agua por diferentes condiciones de temperatura se calcularon y se representan aquí. El error es la desviación estándar.

Presentamos un protocolo para formar rápidamente vesículas poliméricas gigantes (pGVs). Brevemente, las soluciones poliméricas se deshidratan en películas de agarosa secas adheridas a cubreobjetos. La rehidratación de las películas poliméricas da como resultado una rápida formación de pGV. Este método avanza enormemente en la preparación de vesículas gigantes sintéticas para aplicaciones directas en estudios biomiméticos.

Formando polímerosomas de tamaño gigante Uso de rehidratación asistida-Gel

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

El objetivo general de este método de rehidratación asistida por gel es formar de manera robusta vesículas poliméricas gigantes unilaminares intactas, en las que la distribución del tamaño de las vesículas pueda controlarse fácilmente. Este método ofrece una alternativa robusta para la formación de vesículas poliméricas, que pueden utilizarse para investigar las propiedades físicas de la membrana e integrar luego estas vesículas en aplicaciones de bioingeniería. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de producir fácilmente cientos de vesículas poliméricas gigantes intactas de forma mucho más rápida y con menor esfuerzo que las técnicas tradicionales.Entonces, la idea surgió cuando conocimos la técnica de rehidratación asistida por gel para formar vesículas lipídicas gigantes. Sin embargo, nuestros métodos actuales para formar polimerosomas gigantes son difíciles y a menudo tienen bajos rendimientos, por lo que decidimos utilizar esta metodología como un enfoque alternativo. Comience la preparación de la solución polimérica agitando cinco miligramos de copolímero dibloque PEO-PBD en un mililitro de cloroformo en un vial de vidrio hasta que se disuelva completamente.Añada una solución de cinco miligramos por mililitro de polímero y cloroformo y una solución de un miligramo por mililitro de lípido marcado con fluorescencia y cloroformo a un vial nuevo hasta obtener una concentración final de 99,5 por ciento molar de polímero y 0,5 por ciento de lípido. Para minimizar la evaporación, transfiera la solución de polímero a un vial hermético con tapa resistente al cloroformo y guárdelo a 20 grados Celsius para su uso posterior. Para comenzar la preparación de la película de agarosa, añada 50 mililitros de agua y 0,5 gramos de agarosa estándar a un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros.Hervir durante un minuto utilizando un microondas. Antes de continuar, enfríe la solución de agarosa a entre 65 y 75 grados Celsius para evitar una mala adherencia o la formación de grumos. A continuación, corte el extremo de una punta de pipeta de 1000 microlitros y úsela para pipetear 300 microlitros de la solución de agarosa sobre un cubreobjeto cuadrado de vidrio de 25 mililitros.Usando guantes, sostenga el borde de la lámina de cubierta y extienda el agarosa uniformemente sobre toda la superficie utilizando el borde largo de otra punta de pipeta de 1000 microlitros. Coloque la lámina de cubierta con el lado de agarosa hacia arriba sobre parafilm e incúbela a 37 grados Celsius durante al menos una hora. A continuación, pipetee 30 microlitros de la solución polimérica previamente preparada sobre la lámina de cubierta recubierta con película de agarosa.Sostenga el borde de la lámina de cubreobjetos con los dedos enguantados y extienda la solución polimérica sobre la película de agarosa con un movimiento circular utilizando el borde largo de una aguja de calibre 18. Termine colocando la lámina de cubreobjetos con la cara del polímero hacia arriba en una placa de Petri de plástico dentro de un desecador al vacío. Evacúe el desecador durante al menos una hora para eliminar cualquier disolvente residual.Para formar polímerosomas, primero adhiera un pocillo de cubreobjetos al lado del polímero del cubreobjetos recubierto presionando suavemente hasta que se forme un sello hermético. Luego, agregue de 200 a 500 microlitros de solución de rehidratación a la cámara. A continuación, coloque una toalla de laboratorio enrollada y húmeda a lo largo del borde interno de una placa de Petri de vidrio para formar una cámara de humedad.Coloque el cubreobjetos con el pocillo adherido en el recipiente y cúbralo con una tapa. Cubra el recipiente de Petri con papel de aluminio para minimizar el blanqueo fotográfico y luego colóquelo sobre una placa calefactora a 40 grados Celsius durante al menos 30 minutos para completar la formación de los polimerosomas. Para iniciar el proceso de imagenología FRAP, coloque el cubreobjetos con el pocillo adherido sobre la platina de un microscopio de fluorescencia invertido equipado con un condensador ajustable.A continuación, seleccione un conjunto de filtros en función del lípido fluorescente utilizado e imagine los polímerosomas en la superficie superior del cubreobjetos usando un objetivo de inmersión en aceite de 100X. Para caracterizar la fluidez de la membrana mediante FRAP, primero enfoque un polímerosoma, luego cierre el condensador del microscopio hasta una abertura pequeña y asegúrese de que los bordes del polímerosoma queden dentro del campo de la imagen. Posteriormente, aumente el tiempo de exposición de la cámara, retire todos los filtros de densidad neutra y permita que la región de interés se fotoblanquee durante 30 a 60 segundos.Finalmente, apague la lámpara y abra completamente el condensador. Reduzca la exposición a la configuración inicial y capture imágenes cada 30 segundos durante tres minutos. Abra el software de análisis de imágenes en la computadora del microscopio y cargue las imágenes adquiridas de los polímerosomas.Establezca la escala para la medición abriendo el menú desplegable Analizar y seleccionando la opción Establecer escala. Ingrese las unidades de calibración adecuadas para la distancia en píxeles, la distancia conocida y la unidad de longitud, y luego seleccione aceptar. A continuación, utilice la herramienta de línea y dibuje una línea que abarque el diámetro de un polímerosoma seleccionado.Mida el diámetro del polímerosoma abriendo el menú desplegable Analizar y seleccionando Medir. Para facilitar el análisis, use Control más D para imprimir la línea de medición en la imagen antes de pasar al siguiente polímerosoma. Continúe midiendo polímerosomas utilizando el procedimiento anterior y agregue cada medición a la ventana de datos hasta completarla.Finalmente, guarde los datos haciendo clic en Archivo y luego en Guardar como. Haga clic en Guardar en la ventana que se abre y luego abra el archivo de resultados como una hoja de cálculo para analizar los datos. Se obtuvieron imágenes de polímerosomas formados a partir de películas de polímero PEO-PBD rehidratadas con diversos tampones mediante microscopía de fluorescencia. Las imágenes muestran que los polímerosomas presentan tamaños no homogéneos bajo las diferentes condiciones de rehidratación, con un diámetro típicamente inferior a 10 micrómetros.Imágenes de epifluorescencia de polímerosomas formados en agua a diferentes temperaturas muestran que, a medida que aumenta la temperatura de rehidratación, se forman polímerosomas más grandes. Se calcularon los diámetros promedio de más de 100 polímerosomas formados en agua a distintas temperaturas de rehidratación. A 24 grados Celsius, el diámetro promedio fue de 2,93 µm, aumentando hasta 14,04 µm a 70 grados Celsius.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una hora si se lleva a cabo correctamente. Durante el intento de este procedimiento, es importante mantener los polímerosomas en solución en todo momento. Asegúrese de que el pozo de cubierta esté firmemente unido al cubreobjetos para evitar la fuga de la solución de rehidratación y el secado de los polímerosomas.Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar métodos como la microscopía electrónica para comprender propiedades estructurales adicionales de los polímerosomas. Esta técnica allana el camino para la investigación en biología sintética e ingeniería bioquímica, explorando los polímerosomas como una alternativa robusta y químicamente modificable a las membranas lipídicas en la investigación de interfaces abióticas-bióticas, en estudios de entrega de fármacos y en sistemas de protocélulas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo formar de manera robusta polímerosomas gigantes mediante la rehidratación asistida por gel, ajustar el tamaño general de las vesículas y caracterizar la integridad de su membrana.No olvide que trabajar con cloroformo, agarosa o agujas puede ser peligroso. Preste mucha atención al realizar estos procedimientos. Tome precauciones, como trabajar en una campana extractora y usar gafas y guantes en todo momento.

forming-giant-sized-polymersomes-using-gel-assisted-rehydration

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es altamente pH y...

Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.

Reconstitución de una proteína transmembrana, el canal iónico dependiente de voltaje, KvAP, en Gigante vesículas unilamelares para Microscopía y Patch Clamp Estudios

Las vesículas gigantes que contienen componentes altamente empaquetados del tamaño de un micrómetro son modelos celulares útiles. El método de centrifugación en emulsión de agua en aceite es una herramienta sencilla y potente para la preparación de vesículas gigantes con materiales encapsulados.

Preparación de vesículas gigantes Encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite

Nanomateriales ofrecen versátiles mecanismos de entrega terapéutica controlada para aplicaciones aplicadas y ciencia básica, pero su fabricación a menudo requiere conocimientos que no está disponible en laboratorios biomédicos más. Aquí, presentamos protocolos de fabricación escalable y carga terapéutica de diversos nanocarriers uno mismo-montado usando flash nanoprecipitation.

Montaje rápido, escalable y la carga de proteínas bioactivas y los inmunoestimulantes en diversos Nanocarriers sintético vía Flash Nanoprecipitation

En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.

Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro

Este artículo presenta un método simple para la producción expedita de vesículas unilamelares gigantes con proteínas citoesqueléticas encapsuladas. El método demuestra ser útil para la reconstitución ascendente de estructuras citoesqueléticas en confinamiento e interacciones citoesqueleto-membrana.

Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes

Aquí, se presenta un protocolo para la implementación de microscopía de expansión en embriones tempranos de Drosophila para lograr imágenes de superresolución utilizando un microscopio confocal convencional de barrido láser.

Uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de Drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución

Presentamos un protocolo para la reconstitución de proteínas de membrana y encapsulación de enzimas y otros componentes solubles en agua en vesículas lipídicas de tamaño submicrométrico y micrométrico.

Construcción de redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico

Este artículo presenta un método para preparar vesículas unilaminares gigantes compuestas (cGUV) con una estructura de vesícula en vesícula, con conductividad eléctrica personalizada en regiones internas, anulares y externas. La electroformación sintetiza GUV simples, que se transforman en estomatocitos y cGUV mediante choque osmótico, proporcionando un modelo valioso para estudiar la biofísica de las células nucleadas.

Síntesis de vesículas unilamelares gigantes compuestas: un modelo biomimético de células nucleadas

Este artículo presenta una reconstitución simple de redes de citoesqueletos dentro de vesículas gigantes separadas en fase. El método puede generalizarse y aplicarse a la encapsulación o confinamiento de una amplia gama de biomoléculas.

In vitro Reconstitución de redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV) separadas en fase

Aprende a formar polímerosomas gigantes mediante rehidratación asistida por gel usando copolímeros PEO-PBD. Este método rápido permite controlar el tamaño de vesículas para estudios de propiedades de membrana y aplicaciones de bioingeniería.

Formando polímerosomas de tamaño gigante Uso de rehidratación asistida-Gel

Explorar más videos