La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

El objetivo general de esta técnica de microinyección es generar peces espinosos transgénicos y editados genéticamente para probar la función del gen y el potenciador. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la genética evolutiva y del desarrollo, como cómo funcionan los genes y los potenciadores para generar patrones corporales. La principal ventaja de esta técnica es que genera de manera eficiente peces transgénicos para análisis genéticos funcionales.

Después de preparar dos plásmidos y ARNm de acuerdo con el protocolo de texto, extraiga al menos cuatro agujas de micropipeta de vidrio de borosilicato. Almacene verticalmente en un frasco de almacenamiento capilar con los extremos afilados hacia abajo. Para fertilizar hasta cien huevos espinosos, agregue 50 microlitros de solución de esperma y use la punta de una pipeta para remover suavemente y asegurarse de que todos los óvulos estén fertilizados.

Mientras trabaja con hielo, rellene al menos tres agujas pipeteando 0,5 microlitros de solución inyectable en el extremo romo de la aguja y deje que drene. Mientras tanto, encienda la luz de transiluminación para el microscopio de disección y coloque una placa de vidrio de 13 centímetros cuadrados sobre la base de luz del microscopio con una hoja de sierra de yeso de 15 centímetros encima de la placa de vidrio. Oriente la sierra perpendicular al aparato de inyección con las muescas hacia el soporte de la aguja, luego encienda la caja de control y asegúrese de que la presión esté ajustada a aproximadamente 175 kilopascales.

Establezca la duración de la inyección en 180 milisegundos. A continuación, afloje el soporte de la aguja, luego inserte una aguja llena en el soporte hasta que se pueda sentir la resistencia del soporte de goma y apriete el soporte de la aguja hasta que quede apretado con los dedos. A continuación, ajuste el ángulo de la aguja a aproximadamente 45 grados.

Utilice los controles del micromanipulador para ajustar la aguja de modo que el extremo quede centrado en el campo de visión. Acérquese a un aumento de aproximadamente 40x y concéntrese en la punta de la aguja, que no debe tocar el vidrio de abajo. Con pinzas de relojero, agarre la punta de la aguja a dos o tres pinzas del ancho del extremo y rompa suavemente la punta en un ángulo de 60 grados.

A continuación, presione el pedal de inyección varias veces para comprobar si la aguja está rota. Después de unos pocos toques, deberían comenzar a salir pequeñas gotas rojas por el extremo. Utilice una pipeta de transferencia desechable para colocar unas gotas de agua espinosa en la placa de vidrio.

Baje suavemente la aguja en el agua, luego aumente la contrapresión hasta que un leve chorro de líquido rosado emerja de la aguja. Retraiga la aguja tanto como sea posible para que no se dañe mientras prepara los embriones. Aproximadamente 25 minutos después de la fertilización, use dos puntas de pipeta de 10 microlitros para extraer de cinco a 10 embriones de la nidada y transferirlos a la placa de vidrio.

Con las puntas de pipeta, separe suavemente los embriones en hendiduras individuales de la hoja de sierra con precaución para no perforar los embriones. A continuación, con una pipeta de transferencia, agregue suficiente agua espinosa para cubrir los embriones. Luego, después de tres a cinco segundos, retire la mayor parte del agua dejando solo un pequeño volumen que cubra cada embrión.

Comenzando con el embrión más alejado, deslice la placa de vidrio y acérquese al embrión para que ocupe aproximadamente el 25 por ciento del campo de visión. Baje la aguja en el campo de visión, luego use una punta de pipeta de 10 microlitros para rotar suavemente el embrión e identificar el blastómero, una protuberancia granulada, ligeramente amarilla y elevada de citoplasma en la parte superior de la yema. Gire el embrión de modo que el blastómero quede directamente perpendicular al extremo de la aguja.

Baje la aguja aplicando presión lenta y uniformemente para perforar el corion e inserte la aguja en el citoplasma sin empujarla a través de la yema subyacente. Pise el pedal tres o cuatro veces para inyectar, de modo que un bolo rojo con bordes ligeramente difusos llene aproximadamente 1/8 del diámetro del citoplasma. Tener una aguja afilada perpendicular al corion facilitará este paso.

Limitar la cantidad de agua agregada ayudará a mantener el corion suave. Y, por último, dirigirse al citoplasma aumentará la probabilidad de obtener un animal transgénico. Utilice los controles del micromanipulador para retraer la aguja y, con la punta de la pipeta de 10 microlitros, sujete el embrión si se pega a la aguja.

Después de retraer la aguja, deslice la placa de vidrio para alinear el siguiente embrión con la aguja y repita la inyección. Cuando se hayan inyectado todos los embriones, utilice la pipeta de transferencia con el extremo cortado para añadir agua a la placa. A continuación, utiliza una pipeta de transferencia para recoger los embriones y colocarlos en una placa de Petri de 150 milímetros llena de agua espinosa.

Incubar los embriones a 18 grados centígrados. Un día después de la inyección, vierta suavemente el agua espinosa y reemplácela con agua dulce. Compruebe si hay embriones muertos o malformados y retírelos para evitar la contaminación.

Como se ilustra aquí, para los transgenes que tienen actividad potenciadora, la inyección exitosa da como resultado una expresión celular específica del transgén. Por ejemplo, en las aletas pectoral y media y en la notocorda. Los peces inyectados pueden ser cruzados para producir líneas estables, como esta línea estable que impulsa la expresión de GFP en el corazón embrionario a los cuatro días después de la fertilización.

En el caso de un potenciador activo, entre el 40 y el 50 por ciento de los embriones mostrarán expresión transgénica específica del tejido, por ejemplo, en las aletas mediana y pectoral. Hasta el 100 por ciento de los peces F0 positivos para GFP que expresan transgenes de dos plásmidos producen descendencia transgénica. Sin embargo, el porcentaje de descendientes portadores del transgén varía ampliamente, desde menos del uno por ciento hasta el 72 por ciento.

Guardar solo embriones inyectados positivos para GFP generalmente aumenta la eficiencia de la transmisión. Solo hasta el 10 por ciento de los embriones espinosos inyectados por F0 muestran fluorescencia en los tejidos esperados. Además, la tasa de transmisión de los dorsales es menor que la de las construcciones de plásmidos.

Con solo hasta el 14 por ciento de los espinosos apantallados transmitiendo la espalda. En contraste con la baja eficiencia de la transgénesis posterior, entre el 70 y el 100 por ciento de los peces inyectados con garras tienen lesiones en mosaico. En este caso, un amplicón de PCR sin cortar en cada uno de los embriones inyectados indica que algunas células de cada embrión portan lesiones en el locus diana.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en poco más de una hora para una nidada de 100 embriones si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se requiere práctica y paciencia para mejorar la técnica y la supervivencia del embrión. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la microscopía confocal, para responder a más preguntas sobre patrones detallados de expresión de potenciadores.

Además, los peces editados con genoma se pueden cultivar en cruz para estudiar los fenotipos resultantes de las mutaciones inducidas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la genética evolutiva y del desarrollo estudiaran la regulación y la función de los genes en los espinosos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inyectar embriones espinosos para la transgénesis y la edición del genoma.