Name: La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprende microinyección para generar peces transgénicos y editar genomas en Gasterosteus aculeatus. Este método permite analizar funciones de genes y potenciadores en genética del desarrollo y evolución.

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Este trabajo fue financiado en parte por el NIH R01 # DE021475 (CTM), una subvención del NIH predoctoral de Formación 5T32GM007127 (PAE), y una beca de investigación de Graduados de la NSF (NAE). Damos las gracias a Kevin Schwalbach para realizar recombinería y las inyecciones de BAC, Nick Donde para la generación de datos de secuenciación de Sanger CRISPR, y Katherine Lipari de información útil sobre el protocolo de inyección.

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<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
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<li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li>
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<li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> EvoDevo. 5 (1), (2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La inyección de embriones de espinosos de una sola célula para la transgénesis o la edición genoma presenta tres retos principales. En primer lugar, en relación con embriones de pez cebra, el pez espinoso embrionaria corion es difícil y, a menudo romper las agujas. Este problema puede superarse parcialmente mediante el uso de micropipetas de vidrio más gruesas y más fuertes y la inyección perpendicular al corion (véase el Protocolo, la Figura 2). Asegurar que tan poco agua como sea posible se añade a lo...

Un componente fundamental de la comprensión de cómo surge la biodiversidad es la determinación de las bases genéticas y de desarrollo de los cambios fenotípicos evolucionado en la naturaleza. El pez espinoso de tres espinas, Gasterosteus aculeatus, se ha revelado como un excelente modelo para estudiar la base genética de la evolución. Espinosos han sufrido muchos cambios evolutivos de adaptación como los peces marinos han colonizado un sinnúmero de ambientes de agua dulce en todo el hemisferio norte, lo que resulta en morfológica dramática, fisiológicos y cambios de conducta 1. Los genomas de individuos de veintiún poblaciones de espinosos se han secuenciado y ensamblado, y un mapa de ligamiento de alta densidad se ha generado para mejorar aún más el conjunto de 2,3. Experimentos de mapeo genéticos han identificado regiones genómicas subyacente fenotipos evolucionado 4-6, y en unos pocos casos, el papel funcional de genes candidatos específicos se han probado 7,8. Un número de regiones genómicas que generan cambios morfológicos se han identificado con prometedores genes candidatos, pero estos candidatos no han sido aún probado funcionalmente 9 - 12 El. Además, los espinosos son modelos comunes para estudios de genética de poblaciones / genómica 13,14, 15 especiación, comportamiento, endocrinología 1 16 17, ecotoxicología, la inmunología y parasitología 18 19. Los estudios futuros en cada uno de estos campos se beneficiarán de la capacidad de realizar manipulaciones genéticas funcionales en los espinosos. Además de la manipulación de sus secuencias de codificación, las funciones de los genes candidatos pueden evaluarse mediante el estudio de sus secuencias cis-regulador y aumentando funcionalmente, disminuyendo o eliminando la expresión del gen candidato. Métodos de microinyección y la transgénesis en los espinosos están bien establecidos 7,8,20 y fueron inicialmente desarrollados usando una meganucleasa mediada21 método descrito por primera vez en 22 medaka. El método de microinyección modificado que aquí se presenta ha sido optimizada tanto para la transgénesis mediada por Tol2 y recientemente desarrollado reactivos de edición del genoma incluyendo Talens y CRISPRs. Se cree que los cambios en los elementos cis-regulador a ser crítica para la evolución morfológica, como cis-regulador cambios pueden evitar las consecuencias negativas de las mutaciones pleiotrópicos 23 de codificación. Por lo tanto, las pruebas y la comparación de secuencias cis-regulador putativo se ha convertido en un objetivo central de un número creciente de estudios evolutivos. Además, la mayoría de las variantes de la enfermedad humanos son variantes de regulación 24,25 y sistemas modelo de vertebrados son muy necesarios para estudiar cis-regulador Función del elemento y la lógica. Los peces que fertilizar sus embriones externamente en un gran número de vertebrados ofrecen sistemas potentes para estudiar -Reglamento cis. El sistema de transposón Tol2, en el que foreign ADN de integrarse en el genoma está flanqueado por Tol2 transposasa sitios de unión y co-inyectados con ARNm transposasa Tol2, funciona con alta eficiencia para la integración con éxito plásmido construye en los genomas de peces 26 - 28. Típicamente, un promotor de potencial se clona aguas arriba de un promotor basal (como hsp70l 29) y el gen reportero fluorescente tal como EGFP (proteína fluorescente verde potenciada) o mCherry en una cadena principal de Tol2 y se inyecta con transposasa mRNA 26. La observación de la expresión del indicador fluorescente, ya sea en embriones o descendientes con transgenes integrados de forma estable inyectados, proporciona información acerca de la regulación espacial y temporal de la expresión génica impulsado por el potenciador putativo. En experimentos adicionales, potenciadores validados se pueden utilizar para conducir la sobreexpresión específica de tejido de genes de interés. Para el análisis de las regiones cis-regulador más grandes, de alta calidad genoma a gran insertobibliotecas IC mediante cromosomas artificiales bacterianos (BAC) se han construido tanto para los peces espinosos marinos y de agua dulce 30. Estos BAC se pueden recombineered para reemplazar un gen con un gen indicador fluorescente en el contexto de un grande (150 a 200 kb) región genómica 31. El indicador fluorescente se expresa entonces en un patrón espacio-temporal según lo determinado por las secuencias reguladoras dentro de la CAV. Para los estudios en los peces, los sitios Tol2 se pueden añadir a la BAC para facilitar la integración genómica 32,33. En etapas posteriores del desarrollo cuando la hibridación in situ es técnicamente difícil, la lectura fluorescente de la BAC se puede utilizar para estudiar los patrones de expresión de genes, como se ha demostrado para la proteína morfogenética ósea 6 stickleback (BMP6) 20. Además, los patrones de expresión fluorescentes en un individuo pueden ser rastreados a través del tiempo, que no se puede lograr con la hibridación in situ. BAC también se puede utilizar para añadir un additional copia de una región genómica para aumentar la dosis de un gen de interés. Para el estudio de la función génica, edición genoma es un campo en expansión explosiva que se puede utilizar para producir cambios dirigidos a secuencias genómicas en una amplia variedad de organismos 34. Transcripción nucleasas efectoras del tipo activador de (Talens) son nucleasas modulares, específicos de secuencia originalmente aisladas a partir de patógenos de plantas que pueden ser diseñados precisamente para unirse directamente a una secuencia genómica de elección y generar una doble hebra romper 35,36. Agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / sistemas CAS fueron encontrados originalmente en bacterias y usan una guía de ARN y la proteína Cas9 para generar una ruptura en una secuencia de ADN diana complementaria a la guía 37. La posterior reparación de la rotura de doble cadena creada por ambos Talens y CRISPRs menudo deja tras de sí una pequeña inserción o deleción, lo que puede alterar la función de la secuencia diana35-37. En los espinosos, Talens se han utilizado para alterar la expresión de genes por la orientación un promotor de 20, y ambos Talens y CRISPRs han producido con éxito mutaciones en las secuencias (datos no publicados) de codificación. Un protocolo detallado para la generación de CRISPRs para uso en el pez cebra se puede utilizar como una guía para desarrollar CRISPRs para los espinosos 38. Transgénicos y genoma experimentos de edición requieren introducción de ácidos nucleicos en un embrión de una célula recién fertilizado. Mediante la introducción de la herramienta de transgén o de edición de genoma temprano en el desarrollo, se maximiza el número de células hijas genéticamente manipulados en el embrión. embriones inyectados se criban entonces visualmente para fluorescencia o molecularmente examinados para modificaciones del genoma. Si las células que contribuyen a la línea germinal están dirigidos con éxito, el transgén o mutación se pueden transmitir a un subconjunto de la descendencia, incluso cuando la letalidad post-inyección es alta. Los peces pueden ser de mosaico o outcrossedentrecruzan y su descendencia tamiza para recuperar los alelos mutantes o un transgén integrado de forma estable de interés. Este protocolo describe métodos para introducir los transgenes y reactivos de edición del genoma en embriones de espinosos de una sola célula y el seguimiento de las modificaciones que darán éxito.

<table><tbody><tr><td>Microscopio estereoscópico con transiluminación</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador manual Instrumentación</td><td>Científica Aplicada</td><td>MM33</td><td>Micromanipulador Marzhauser M33</td></tr><tr><td>Sistema de inyección de presión</td><td>Instrumentación Científica Aplicada</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de contrapresión</td><td>Instrumentación Científica Aplicada</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Kit de soporte de micropipeta</td><td>Instrumentación científica aplicada</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de base magnética</td><td>Instrumentación científica aplicada</td><td>Base magnética</td><td></td></tr><tr><td>Interruptor de pie</td><td>Instrumentación científica aplicada</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Placa de hierro (base magnética)</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Flameado/Marrón Extractor de micropipetas</td><td>Instrumento</td> <td>SutterP-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia desechables</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0,5% rojo fenol en DPBS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P0290</td><td>trazador de inyección</td></tr><tr><td>#5 pinzas, biologie dumoxel&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>para romper agujas</td></tr><tr><td>Tarro de almacenamiento de micropipetas</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>sostiene agujas de</td></tr><tr><td>6", 6 dientes por pulgada sierra de yeso para paneles de yeso</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td> <td>sostiene huevos para inyección</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm placa de vidrio</td><td>cualquier ferretería-Capilares</td> <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>vidrio de borosilicato, 1,0 mm OD/0,58 mm ID&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>* vidrio más duro que el pez cebra capilares de inyección</td></tr><tr><td>150 x 15 mm Placa de Petri</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>criar embriones espinosos</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Placa de Petri</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>almacenar huevos preinyección</td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonato de tricaína/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>anestesia/eutanasia</td></tr><tr><td>para peces Kit de transcripción Sp6</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Para la transcripción de TALENs y ARNm transposasa</td></tr><tr><td>RNeasy kit de limpieza</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>purificar transposasa o ARN TALEN</td></tr><tr><td>QiaQuick PCR kit de limpieza</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>limpiar plásmidos para inyección</td></tr><tr><td>Proteinasa K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>para la preparación de ADN</td></tr><tr><td>Nucleobond BAC 100 kit</td><td>Clontech</td><td>740579</td><td>para la preparación de ADN BAC</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polimerasa</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>contiene tampón de enjuague de endotoxinas</td></tr><tr><td>QIAQuick Extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704&nbsp;</td><td>para secuenciar mutaciones inducidas</td></tr><tr><td>Fenol:cloroformo:Alcohol isoamílico</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (grado de biología molecular)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Tampón de Tris-acetato-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0.5-10 Kb Escalera</td> <td>de ARNThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&nbsp; Espectrofotómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus Escalera de ADN</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PCR de 12 tiras</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

la microinyección de transgénesis y genoma edición en tres espinas espinosos

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

El pez espinoso de tres espinas se ha convertido en un potente sistema para estudiar la base genética de una amplia variedad de características morfológicas, fisiológicas y fenotipos de comportamiento. Las notablemente diversos fenotipos que han evolucionado a medida que las poblaciones marinas se adaptan a un sinnúmero de ambientes de agua dulce, junto con la capacidad de cruzar formas marinas y de agua dulce, proporcionan un sistema de vertebrados rara en la que la genética puede ser utilizado para mapear las regiones genómicas que controlan rasgos evolucionado. Excelentes recursos genómicos ya están disponibles, lo que facilita la disección genética molecular de los cambios evolucionados. Mientras que los experimentos de mapeo generar listas de genes candidatos interesantes, se requieren manipulaciones genéticas funcionales para poner a prueba las funciones de estos genes. La regulación génica puede ser estudiado con plásmidos informadores transgénicos y BACs integrados en el genoma utilizando el sistema de transposasa Tol2. Funciones de los genes candidatos específicos y cis-elementos reguladores pueden evaluarse mediante la inducción específicamutaciones con TALEN y CRISPR / Cas9 reactivos edición genoma. Todos los métodos requieren la introducción de ácidos nucleicos en fertilizados embriones stickleback una sola célula, una tarea que se hizo difícil por el espesor corion de embriones de espinosos y la relativamente pequeña y delgada de blastómeros. Aquí, un protocolo detallado para la microinyección de los ácidos nucleicos en embriones de espinosos se describe para aplicaciones transgénicas y edición de genoma para estudiar la expresión génica y la función, así como técnicas para evaluar el éxito de la transgénesis y recuperar líneas estables.

Para transgenes de genes informadores que tienen potenciador de la actividad, la inyección con éxito dará lugar a la expresión específica, celular del transgén (Figura 4A, 4C). Peces inyectados pueden ser outcrossed para producir líneas estables (ejemplo de una línea estable de BAC se muestra en la Figura 4B). La inyección de ADN en embriones de espinosos típicamente resulta en la letalidad mucho mayor que el ARN solo. Es típico ver hast...

Manipulaciones transgénicas y la edición del genoma son críticos para probar funcionalmente las funciones de los genes y elementos cis-regulador. Aquí se presenta un protocolo de microinyección detallado para la generación de modificaciones genómicas (incluyendo construcciones mediadas por Tol2 fluorescentes transgén reportero, Talens, y CRISPRs) para el modelo emergente de pescado, el espinoso de tres espinas.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

El objetivo general de esta técnica de microinyección es generar peces espinosos transgénicos y con edición del genoma para probar la función de genes y potenciadores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en genética del desarrollo y evolutiva, como cómo los genes y potenciadores funcionan para generar el patrón corporal. La principal ventaja de esta técnica es que genera eficientemente peces transgénicos para el análisis genético funcional.Después de preparar los dos plásmidos y el ARNm según el protocolo descrito en el texto, prepare al menos cuatro agujas de micropipeta a partir de vidrio de borosilicato. Almacénelas en posición vertical en un frasco para almacenamiento de capilares, con las puntas afiladas orientadas hacia abajo. Para fertilizar hasta cien huevos de espinoso, añada 50 microlitros de solución de esperma y utilice una punta de pipeta para mezclar suavemente, asegurándose de que todos los huevos sean fertilizados.Mientras trabaja sobre hielo, rellene al menos tres agujas introduciendo por pipeta 0,5 microlitros de solución de inyección en el extremo romo de la aguja y deje que drene. Mientras tanto, encienda la luz de transiluminación del microscop

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.

Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

Fuente: Chen, S., et al., Cirugía estereotáxica para la manipulación genética en células estriatales de cerebros de ratones neonatales. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la inyección estereotáxica de un vector viral que codifica la recombinasa Cre y la proteína de fluorescencia verde o GFP en el cuerpo estriado de un cachorro de ratón modificado genéticamente para lograr la manipulación génica mediante la extirpación de un casete STOP flanqueado por loxP, activando la proteína de...

Microinyección estereotáctica de un vector viral para la manipulación génica en un cachorro de ratón estriado

En este artículo se demuestra un método para la manipulación de la expresión génica en las células ventriculares del telencéfalo adultos de pez cebra utilizando oligonucleótidos antisentido morpholino. Se presenta este método como un protocolo eficiente y rápida que puede ser utilizado para los estudios funcionales en el cerebro de los vertebrados adultos.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

mutagénesis gen de la orientación es ahora posible en una amplia gama de organismos utilizando técnicas de edición genoma. Aquí, demostramos un protocolo para la mutagénesis dirigida de genes usando activador de la transcripción como nucleasas efectoras (Talens) en Astyanax mexicanus, una especie de peces que incluye a los peces de superficie y cavefish.

Edición genoma en<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Uso de transcripción activador de efector nucleasas (Talens)

La microinyección de ovocitos de ratón se utiliza comúnmente tanto para la transgénesis clásica ( es decir, la integración aleatoria de transgenes) como para la orientación de genes mediados por CRISPR. Este protocolo revisa los últimos avances en microinyección, con especial énfasis en el control de calidad y las estrategias de genotipificación.

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

Microinyección de embriones de Nasonia vitripennis es un método esencial para la generación de modificaciones heredables del genoma. Se describe aquí es un procedimiento detallado para la microinyección y el trasplante de embriones de Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente la manipulación del genoma futuro en este organismo.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.

Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

Aquí, se presenta un protocolo para producir y traseros pescado eléctrico knockout genoma CRISPR/Cas9. En detalle se describen los requisitos requeridos de biología molecular, reproducción y cría para un gimnoiforme y un mormyrid, y técnicas de inyección para producir larvas Indel F0 inducidas por Cas9.

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

El presente protocolo describe la microinyección de cigoto de CRISPR-Cas9 y ADN de donantes para producir eficientemente ratones knock-in y floxed de casetes de genes.

Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones

Aprende microinyección para generar peces transgénicos y editar genomas en Gasterosteus aculeatus. Este método permite analizar funciones de genes y potenciadores en genética del desarrollo y evolución.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

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