La disección y-montaje plana del esqueleto branquial de tres espinas Stickleback

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar y montar en plano el esqueleto branquial de espinoso. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del desarrollo, la genética y la evolución, como por ejemplo cómo los animales se adaptan a nuevos ambientes y cómo surge la variación en la morfología adulta durante el desarrollo.

La principal ventaja de esta técnica consiste en que, al diseccionar y montar en plano el esqueleto branquial, se puede visualizar una variedad de caracteres tróficos que no pueden estudiarse en preparaciones de montaje completo. Antes de comenzar, revise la morfología esquelética de la cabeza del espinoso de tres espinas. Después de preparar el pez para la disección, comience insertando una pinza fina número cinco en el lateral del ojo, con un ángulo de 45 grados, para perforar la membrana que cubre el ojo.

A continuación, retire la membrana del ojo, como si fuera la tapa de un envase de yogur. Luego, inserte las pinzas abiertas detrás del ojo, sujete el nervio óptico y extraiga el ojo. Tenga cuidado de no perforar el ojo, ya que podría liberar melanina.

Repita este proceso con el ojo del lado opuesto. Luego, coloque la hoja de unas tijeras pequeñas debajo del lado posterior de la aleta opérculo y corte el tejido blando dorsalmente por encima del opérculo, en dirección hacia la cuenca del ojo. A continuación, corte a través del hueso frontal, que se encuentra dorsal a la cuenca del ojo.

Luego, corte a través del hueso parasfenoideo en la línea media, alrededor del centro de la órbita ocular. Repita el corte del opérculo en el lado opuesto. Para los siguientes pasos, las espinas pélvicas pueden utilizarse como asas.

Se despliegan, tirando suavemente de ellos directamente alejándolos del cuerpo. Ahora, inserte la pinza debajo del opérculo y retire lentamente la cara del cuerpo, recortando cualquier tejido blando que aún esté adherido durante el proceso.

Tenga cuidado alrededor de los rastrillos branquiales y tenga cuidado de no alterarlos. Es fácil agarrar accidentalmente el primer hueso ceratobranquial junto con el Percoll al retirar el esqueleto facial. Observe debajo del Percoll mientras lo separa hacia adelante para asegurarse de no estar sujetando algo adicional.

Ahora, con pinzas, separe los ceratohiales de ambos lados del basihial en la línea media, mientras retira y elimina el esqueleto facial craneal anterior. Repita en el lado opuesto. El esqueleto facial craneal anterior incluye toda la mandíbula, todo el esqueleto hioides, los elementos dorsales y condrales subyacentes y la parte anterior del cráneo.

A continuación, inserte fórceps cerrados justo por debajo del tubo digestivo y arrástrelos hacia la parte anterior, separando cuidadosamente los músculos y ligamentos restantes que se encuentran unidos al esqueleto branquial durante el procedimiento. Luego, utilice la punta de los fórceps cerrados para raspar los músculos que unen el esqueleto branquial dorsal con la caja craneana ventral.

Raspe con un movimiento de posterior a anterior. Repita el proceso de eliminación del músculo en el lado opuesto del espinoso. A continuación, retire el esqueleto branquial sujetando la base del tubo digestivo y tirando hacia delante.

Seccione el tubo intestinal mediante un corte perpendicular, posterior al quinto ceratobranquial. Un error común consiste en sujetar el tubo intestinal demasiado anterior, lo que deja el tubo frontal ventral muy atrás. Asegúrese de sujetar profundamente en la parte posterior de la cavidad torácica y siempre puede eliminar el exceso de tubo intestinal más adelante.

Después de eliminar cualquier fragmento óseo restante del cráneo en el lado dorsal del esqueleto branquial, inserte tijeras en la cesta branquial y realice un corte dorsal entre los conjuntos bilaterales de placas dentales dorsales. Mantenga este corte centrado para evitar dañar las placas dentales dorsales.

A continuación, realice dos cortes laterales superficiales en la luz intestinal elástica en el extremo posterior del esqueleto branquial. En el extremo anterior del tubo intestinal, para ayudar a abrir el esqueleto branquial.

Ahora, transfiera el esqueleto a un tubo de microcentrífuga cargado con glicerol al 50 por ciento y hidróxido de potasio al punto dos cinco por ciento para una limpieza suave. O bien, transfiéralo a glicerol puro si no se requiere una limpieza adicional. Si es necesario volver a teñir, los detalles se proporcionan en el protocolo del texto.

Para prepararse para el montaje, cambie la solución a glicerol puro y agite el tubo durante al menos cinco minutos. Luego, retire el esqueleto branquial y colóquelo cerca del fondo de una cubreobjetos de vidrio de 22 por 60 milímetros con el lado dorsal hacia arriba. Ahora, transfiera unas gotas de glicerol sobre el esqueleto.

A continuación, enrolle dos pequeñas bolas de arcilla de modelar y coloque una en cada extremo del cubreobjetos; funcionan como espaciadores. Luego, coloque suavemente un segundo cubreobjetos sobre la preparación, ejerciendo suficiente presión para aplanar el esqueleto branquial anterior. Ahora, separe la aleta dorsal izquierda, incluyendo las placas dentales dorsales, y deslice la aleta entre los cubreobjetos.

Luego, haga lo mismo con la aleta dorsal derecha. Y empuje todo el esqueleto branquial lejos del borde del cubreobjetos. Para completar el procedimiento, presione ligeramente la parte superior del cubreobjetos para aplanar las bolitas de arcilla.

Justo lo suficiente para que mantengan el esqueleto branquial montado en posición plana. Pero no tanto que lo aplaste. Si durante el proceso se obstruye una fila de ganchos, deslice la pinza entre las laminillas y reoriente el ceratobranquial o toda la preparación.

Cuando se monta plano en glicerol puro, la preparación puede almacenarse plana a temperatura ambiente durante al menos una década. Este protocolo da como resultado un esqueleto branquial diseccionado y montado plano, donde una variedad de rasgos tróficos importantes puede ser cronificada.

Desde una vista dorsal, todas las hileras de branquiespinas, todas las placas dentales faríngeas y casi todos los huesos branquiales pueden visualizarse y cronificarse fácilmente. El rojo de alizarina S también fluoresce con un filtro rojo de ródamina o similar, lo que permite la doble marcación con otros marcadores y métodos alternativos de visualización. En esta imagen, las branquiespinas están marcadas con símbolos de intercalación.

Los dientes se marcan con cabezas de flecha y los huesos con asteriscos. Una vez dominada, la disección puede realizarse en unos pocos minutos y puede efectuarse en cientos de animales relativamente rápido. Y aunque hemos demostrado una disección del esqueleto branquial de espinoso, esperamos que este procedimiento pueda utilizarse como guía para una variedad de especies de peces.

Al diseccionar el esqueleto branquial, podemos visualizar rápida y fácilmente una variedad de rasgos tróficos importantes, no visibles en preparaciones completas, lo que permite una mejor comprensión del desarrollo y la evolución del esqueleto craneofacial.