Name: Evaluación de los miofilamentos Ca 2+ Sensibilidad cardíaca subyacente excitación-contracción de acoplamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a evaluar la sensibilidad de los miofilamentos al Ca²⁺ en cardiomiocitos de rata usando Fura-2 AM y microscopía de fluorescencia. Este protocolo integra manejo de calcio y rendimiento contractil para estudiar el acoplamiento excitación-contracción en corazones sanos y enfermos.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa Básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2013068067); por el Programa de Graduados Cerebro Corea 21 del Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología, el Hospital de la Universidad Nacional de Seúl, la Sociedad Coreana de Hipertensión (2013), el Fondo de Investigación de SK Telecom de Corea (n. ° 3420130290) y de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF 31460265; SNCF 81260035).

El protocolo está de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de la Salud de la ONU (NIH Publication No. 85-23, revisada en 1996). Fue aprobado por el Comité Institucional de animales Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad Nacional de Seúl (aprobación del IACUC no .: SNU-101213-1). 1. Preparación de búfer (Materiales y Equipo de mesa) <ol><li> Preparar 300 ml de solución de aislamiento fresco en el día del experimento (en mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl 2, 3,5; glucosa, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; taurina, 20; pH 7,4 con NaOH). </li><li> Preparar 100 ml de solución de almacenamiento fresco en el día del experimento (en mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO 4 5; CaCl 2 0,2; de sodio-piruvato 5; glucosa 5,5; taurina 20; HEPES 10; manitol 29; pH 7,4 con NaOH). </li><li> Preparar 1 litro de solución de perfusión (en mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MgCl 2, 1; HEPES, 10; glucosa, 5,5; CaCl 2, 1,8; manitol, 14,5; pH 7,4 con NaOH). </li><li> Preparar 30 ml de solución de colagenasa 1 mediante la adición de colagenasa (1 mg / ml), la proteasa (0,1 mg / ml), albúmina de suero bovino (BSA, 1.67mg / ml), y Ca 2+ (0,05 mM) a 25 ml de aislamiento solución. </li><li> Preparar 20 ml de solución de colagenasa 2 mediante la adición de colagenasa (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml), y Ca 2+ (0,05 mM) a 16,7 ml de solución de aislamiento. </li><li> Preparar 40 ml de solución de BSA mediante la adición de 0,4 g de BSA a 40 ml de solución de aislamiento. Separada 10 ml y 30 ml en dos vasos de precipitados. Añadir Ca 2 + a 30 ml de solución de BSA de modo que la concentración final de Ca2 + en la solución de BSA es de 1 mM. </li></ol> 2. Preparación para el aislamiento de miocitos ventriculares izquierda (LV) <ol><li> Transferir 8-12 ratas semanas de edad, macho Sprague-Dawley (SD) en jaulas de transporte no contaminantes de las instalaciones de animales a la sala de preparación y aislamiento. </li><li> MARIDOcomer dos baños de agua a 37 ° C. Nota: Utilice un baño de agua para el agua - depósito con camisa y los tubos de perfusión del sistema de perfusión Langendorff. Utilice el otro baño de agua para agitar troncos de tejido miocárdico con el fin de separar los miocitos individuales. </li><li> Añadir 5 ml y 3,3 ml de solución de BSA (sin Ca 2 +) a 25 ml de solución de colagenasa 1 y 16,7 ml de solución de colagenasa 2 para compensar el volumen a 30 ml y 20 ml, respectivamente. </li><li> Añadir solución de aislamiento (100 ml) y solución de colagenasa 1 (30 ml) a la columna 1 (Col. 1) y la columna 2 (Col. 2) en el sistema de perfusión de Langendorff, respectivamente (Figura 1A). </li><li> Oxigenar la solución de aislamiento y solución de colagenasa 1 en Col. 1 y Col. 2 a través del tubo de conexión de oxígeno en el sistema de perfusión Langendorff (Figura 1A). Del mismo modo, la solución de colagenasa de compuestos oxigenados 2 y la solución de BSA en el baño de agua en agitación con 100% de O 2 a través de latubo de conexión de oxígeno. </li></ol> 3. Aislamiento de miocitos LV <ol><li> Anestesiar una rata SD a través de inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (30 mg / kg) y confirmar el estado anestésico por toe pellizcos y la falta de retirada reflexión. </li><li> Mover la rata a una bandeja de disección. En la posición de decúbito supino, asegurar las cuatro patas a los lados del cuerpo con cinta adhesiva. </li><li> Aplicar incisiones axiales mediados de torácicos con tijeras quirúrgicas para abrir el pecho, asegurando de no dañar el corazón. Utilice otro par de tijeras limpias para diseccionar el corazón de los vasos de conexión (por ejemplo, superior e inferior vena cava, vasos pulmonares y aorta) y la membrana pericárdica 13. </li><li> Dejar una porción de la aorta de una longitud suficiente (5-8 mm), sujetar la aorta con unas pinzas finas, y montar rápidamente la cánula del sistema de perfusión Langendorff dentro de 1 min (Figura 1A). Ate hilo de sutura 4/0 firmemente sobre la aorta. </li><li&gt; Activar la válvula en Col. 1 y perfundir el corazón aislado con la solución de aislamiento pre-calentado y oxigenada durante 10 minutos (tasa de perfusión: 12-14 ml / min). Cierre la válvula en la Col. 1, encienda la válvula en Col. 2 y perfundir el corazón con una solución de colagenasa 1 durante 8 - 10 minutos a. </li><li> Desmontar el corazón digerido mediante la reducción de la aorta y la transfiere mediante la celebración de la aorta con una pinza en el matraz que contenía solución de aislamiento fresco (Figura 1Bi). Utilice unas tijeras finas y pinzas para cortar la mayor parte de la pared libre del VI (incluyendo el septo) en trozos más pequeños (~ 22 mm, la figura 1Bii). </li><li> Transferir las piezas en un matraz que contenía colagenasa solución fresca caliente previamente oxigenada 2 (Figura 1Biii). Agitar durante 10 min. Mantenga la entrega de oxígeno a la solución de colagenasa que contiene miocitos-2. </li><li> Mueva el miocito - suspensión a un tubo de centrífuga de 10 ml usando goteros con una pera de succión y añadir Ca 2+ - que contiene solución de BSA (1: 1 en volumen). Centrifugar a 30 g durante 2 min y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento de los miocitos en 5 ml de solución de BSA. Centrífuga y desechar el sobrenadante. </li><li> Dispersar los gránulos de miocitos y mantener miocitos en 10 ml de solución de almacenamiento de pre-oxigenada a TA (Figura 1Biv-vi). </li><li> Repita los procedimientos (pasos 3.7 a 3.9) con el tejido LV restante en el matraz. Nota: Mantenga la repetición de los procedimientos (pasos 3.7 a 3.9) de nuevo hasta que la mayoría del tejido LV desaparece para obtener un buen rendimiento de los miocitos. </li><li> Mantener los miocitos en solución de almacenamiento para 6-8 horas a RT hasta que el final de los experimentos. </li></ol> 4. Las mediciones simultáneas de Ca2 + intracelular transitorios y miocitos Contracción <ol><li> miocitos carga de voltaje con el éster de acetoximetilo Fura-2 de AM (2 M). Nota: Realizar todos los procedimientos de carga y experimentos con miocitos cargados en un tubo oscuro (Figura 1Bvii). <ol><li> Centrifuge la suspensión de miocitos (1 ml) a 2000 xg durante 10 seg. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento de los miocitos en 1 ml de solución de Tyrode con una baja concentración de Ca2 + (250 mM, Materiales y Equipos de mesa). </li><li> Añadir Fura-2AM y poloxámero 407 (2 l), se dispersan suavemente la suspensión de miocitos, y mantener la mezcla a temperatura ambiente de (20 - 24º C) durante 15 minutos (Figura 1Bvii). </li><li> Se centrifuga la mezcla durante 5 seg, desechar el sobrenadante y dispersar el sedimento de los miocitos en 1 ml de solución de perfusión que contiene 500 mM de Ca2 +. Después de 10 min, se centrifuga la mezcla durante 5 seg y descartar el sobrenadante. </li><li> Añadir solución de perfusión fresco (500 mM Ca 2 +, 1 ml) y mantener el Fura-2AM - pellet miocitos cargado en esta solución para grabaciones. </li></ol></li><li> Medición de la contracción de los miocitos LV y Ca2 + intracelular <ol><li> Antes de grabar, llenar el tubo de perfusión que se ejecuta a través de unacamisa de agua con la solución de Tyrode, que es pre-calienta a 36 ° C </li><li> Coloque unas pocas gotas de la Fura 02 a.m. - cargado suspensión de miocitos LV en la cámara de un microscopio de fluorescencia invertido durante 5 - 8 minutos. perfundir lentamente la solución de Tyrode (2.2 ml / min). </li><li> Presione el botón &quot;Inicio&quot; en el panel frontal del estimulador digital para iniciar la estimulación de campo (2 Hz). Nota: El voltaje de salida (10 V, 5 ms de duración) se aplica a los miocitos en la cámara a través de hilos de platino colocados a cada lado de la cámara. <ol><li> Seleccione los miocitos que se contraen de manera estable (no se presentan los hiper o hipo-contracción) para la grabación. </li></ol></li><li> Ajuste el miocitos de elección en la posición horizontal del sarcómero sistema de detección basado en vídeo y ajustar el enfoque del microscopio para obtener imágenes óptimas de sarcómeros. Coloque la caja rectangular de color púrpura en la zona en que sarcómeros claras están claramente observadas hasta que el promediode longitud del sarcómero (pico rojo) muestra un pico agudo singular (Figura 2A, la imagen inferior). </li><li> Registrar los cambios en la longitud del sarcómero en respuesta a la estimulación de campo (Figura 2 A y B). Nota: Utilice los miocitos cargados dentro de 1 - 2 horas. </li><li> Ajuste de la abertura de la cámara de manera que el campo en el sistema de detección de sarcómero basado en vídeo es el tamaño del miocito (Figura 2A). Estimular el miocito con excitación a 360 nm / 380 nm y emisión a 510 nm (frecuencia de adquisición 1000 Hz). Grabar el acortamiento del sarcómero y la relación Fura2 AM con la estimulación de campo (Figura 2B). </li></ol></li></ol> 5. Evaluación de la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + <ol><li> Se promedian las longitudes del sarcómero y Ca 2 + transitorios en estado estacionario (10 - 20 restos) y trazar el bucle de fase plana de la relación de Fura-2 frente a la longitud del sarcómero de la misma miocitos (ambos con valor medidos y delta cambios; Figura 2C). </li><li> En cada parcela, definir la relación Fura -2 a 50% de relajación (CE 50, Figura 2C). Comparar tanto el bucle y CE 50 de cada intervención. </li></ol>

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<li>Ashley, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+nitric+oxide+synthase+1+regulates+basal+and+beta-adrenergic+contractility+in+murine+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes.</a> Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

A continuación, describimos los protocolos para evaluar los cambios de la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + en los miocitos cardíacos aislados única y hacemos hincapié en la importancia de medir este parámetro junto con las propiedades electrofisiológicas, intracelular de Ca 2 + transitorios, y la dinámica de los miofilamentos. Esto se debe a las grabaciones de uno o dos de los parámetros no pueden explicar los mecanismos subyacentes de la contracción cardíaca y la relajación. A...

Acoplamiento excitación-contracción cardiaca (CE) es el esquema fundamental para el análisis de las propiedades mecánicas del miocardio, es decir, la función contráctil del corazón 1,2. Acoplamiento CE se inicia por despolarización de la membrana secundaria a las actividades de los canales de iones sarcolema (por ejemplo, el canal de Na + dependiente de voltaje, que se puede medir a través de técnicas de patch-clamp). La posterior activación de voltaje de tipo L de Ca 2 + canales (LTCCs) y Ca 2 + afluencia través LTCCs desencadenar la mayor parte de la liberación de Ca2 + a través de receptores de rianodina (RyRs), el aumento de la concentración citosólica de Ca2 + desde el nanomolar (nM ) a nivel micromolar (M). Este aumento en Ca 2+ citosólico promueve Ca 2+ unión a la troponina C (TnC) en filamentos delgados y provoca cambios conformacionales del complejo de filamentos para facilitar la interacción actina-miosina y alcanza myocardiAl contracción del 3. Por el contrario, la citosólica de Ca 2+ se re-especialmente captado de nuevo en el retículo sarcoplásmico (SR) a través de la Ca2 + -ATPasa en SR (SERCA2a) o se extruye fuera de la miocitos a través del intercambiador Na + 2 + / Ca y el plasmalemmal Ca 2 + ATPasa 1,2. En consecuencia, la disminución de Ca 2+ citosólico instiga a cambios conformacionales de filamentos delgados de nuevo a su estado original, lo que resulta en la disociación de actina-miosina y la relajación de los miocitos 1-3. En este esquema, la actividad de la SERCA2a se considera generalmente para determinar la velocidad de relajación del miocardio, ya que representa el 70 - 90% de eliminación citosólica de Ca2 + en la mayoría de las células del corazón de mamífero 1. Como tal, la manipulación anormal de Ca2 + por LTCC, RyR y SERCA2a, etc. ha sido considerado como los principales mecanismos de deterioro de la contractilidad y la relajación en el corazón enfermo 1-4. 2+ libre que funciona como el mensajero en cuentas de acoplamiento de la CE de alrededor del 1% del total de Ca 2+ intracelular y la mayoría de Ca2 + está obligado a Ca2 + intracelular tampones 5,6. Esto es debido al hecho de que varios de Ca 2 + tampones son abundantes en los miocitos cardíacos, por ejemplo, los fosfolípidos de membrana, ATP, fosfocreatina, calmodulina, parvalbúmina, miofibrilla TnC, miosina, SERCA2a, y calsecuestrina en la SR. 5,6,7. Entre ellos, la SERCA2a y TNC son los predominantes Ca 2+ tampones 5,6,7. Además, Ca 2 + vinculante a sus buffers es un proceso dinámico durante contracción (por ejemplo, 30-50% de Ca 2 + se une a TnC y se disocian de ella durante Ca 2 + transitorios 7) y el cambio en el Ca 2+ causa adicional de unión &quot;liberar&quot; de Ca2 + libre en el citosol, los resultados en las alteraciones del Ca2 + intracelular concentration. En consecuencia, la perturbación del nivel intracelular de Ca2 + induce movimientos anormales myofilament, que son los precursores de la disfunción contráctil y arritmias 8,9. Muchos factores (tanto fisiológicas como patológicas) pueden ser las fuentes de modificaciones post-transcripcional de proteínas myofilament, que influyen en myofilament Ca 2+ búfer y myofilament Ca 2 + sensibilidad 8-10. Recientemente, se informó de que las mutaciones en las proteínas myofilament aumentan el Ca2 + intracelular y la afinidad de unión de manipulación de Ca2 +, lo que provocó la potenciación dependiente de pausa de Ca 2 + transitorios, la liberación anormal de Ca2 +, y arritmias 8. De acuerdo con este concepto, también hemos demostrado que los miofilamentos de Ca2 + desensibilización en corazones de ratas con hipertensión secundaria a la regulación de la óxido nítrico sintasa neuronal se asocia con diastólica elevada y sistólica niveles de Ca2 +11, que a su vez, aumenta la vulnerabilidad de la LTCC a Ca 2 + -dependiente de inactivación 12. Por lo tanto, la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + es un regulador &quot;activa&quot; de la homeostasis intracelular y la función contráctil de los miocitos Ca 2+. Se ha hecho necesario para analizar las interacciones entre los miofilamentos y Ca 2+ manejo de proteínas para la investigación a fondo de los miocitos CE acoplamiento y la función cardiaca. A continuación, se describe un protocolo que evalúa los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + en los miocitos cardíacos aislados. Análisis exhaustivo de perfil intracelular de Ca2 +, la sensibilidad y la contracción de los miofilamentos de Ca2 + se desvela los nuevos mecanismos de la mecánica miocárdica subyacente.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley rata</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 semanas</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodio</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Corea)</td><td>AHN901</td><td>Código de seguro:645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Piruvato</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Fetal Bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Sondas moleculares</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 Solución al 20% en DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua agitado</td><td>Chang Shin Modelo científico</td><td>: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Constructor experimental</td><td>Adquisición y análisis de datos de acoplamiento de CE en miocitos</td></tr><tr><td>Calcio de miocitos y Sistema de registro de contractilidad</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua circulante</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia de miocitos</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencia & Detección de video</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencia & Interfaz del sistema</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz de excitación</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara ARC de alta intensidad Fuente de alimentación</td><td>Cairn Reseach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controlador de rueda de filtro</td><td>IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador digital</td> Sistemas <td>médicos Corportion</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>Composiciones de soluciones experimentales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentración (mmol) 135</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentración (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentración (mmol) 5</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentración (mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentración (mmol) 3.5</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td></td><td>CB2742654 Concentración (mmol) 20</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; </td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Concentración (mmol) 0.4</td></tr><tr><td>Solución de almacenamiento (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentración (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentración (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentración (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentración (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentración (mmol) 0.2</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentración (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Concentración (mmol) 5</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Concentración (mmol) 5</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentración (mmol) 20</td></tr><tr><td>Solución de perfusión (solución de tirodo, pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentración (mmol) 141.4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentración (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Concentración (mmol) 0.33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentración (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentración (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentración (mmol) 1.8&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Para la carga de Fura 2AM, las concentraciones de CaCl2 son 0,25 mM y 0,5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentración (mmol) 1</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentración (mmol) 14.5</td></tr><tr><td>Solución de Collangenasa 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de aislamiento (30 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina fetal bovina (solución BSA 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Concentración (mmol) 1,67 mg/mL</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 2</td><td>Worthington</td><td></td><td>LS004177 Concentración (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Proteasa</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Concentración (mmol) 0,1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentración (mmol) 0,05 mM</td></tr><tr><td>Solución de colangenasa 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de aislamiento ( 20 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina fetal bovina (solución BSA, 3,3 mL)</td><td>Concentración (mmol)</td><td></td><td></td> 1,67 mg/mL</tr><tr><td>Colagenasa tipo 2</td>, <td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentración (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentración (mmol) 0,05 mM</td></tr> Solución <tr><td></td><td></td><td></td>de aislamiento de<td>BSA</td></tr><tr><td>( 40mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Fetal Bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Concentración (mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentración (mmol) 1mM</td></tr></tbody></table>

evaluación de los miofilamentos ca<sup&gt; 2+</sup&gt; sensibilidad cardíaca subyacente excitación-contracción de acoplamiento

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

La insuficiencia cardíaca y arritmias cardíacas son las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Sin embargo, el mecanismo de la patogénesis y el mal funcionamiento del miocardio en el corazón enfermo aún no ha sido aclarado. Evidencia convincente reciente demuestra que los cambios en la sensibilidad a la myofilament Ca 2+ afectan Ca intracelular 2+ actividades homeostasis y de los canales iónicos en los miocitos cardiacos, los mecanismos esenciales responsables de potencial de acción cardíaco y la contracción en corazones sanos y enfermos. De hecho, las actividades de los canales iónicos y transportadores subyacentes potenciales de acción cardiacos (por ejemplo, Na +, Ca2 + y canales de K + y el intercambiador de Na + -Ca 2+) y Ca 2 + manejo proteínas intracelulares (por ejemplo., Receptores de rianodina y Ca 2 + -ATPasa en retículo sarcoplásmico (SERCA2a) o fosfolamban y su fosforilación) se miden convencionalmente para Evalucomieron los mecanismos fundamentales de acoplamiento excitación-contracción cardiaca (CE). Ambas actividades eléctricas en la membrana y cambios intracelulares de Ca 2+ son las señales de disparo de acoplamiento CE, mientras que los miofilamentos es la unidad funcional de la contracción y la relajación, y la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + es imprescindible en la aplicación de los resultados de las miofibrillas. Sin embargo, pocos estudios incorporan sensibilidad myofilament Ca 2+ en el análisis funcional del miocardio a menos que sea el foco del estudio. A continuación, se describe un protocolo que mide el acortamiento del sarcómero / re-alargamiento y el nivel intracelular de Ca2 + con Fura-2 de AM (detección radiométrica) y evaluar los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + en los miocitos cardíacos de corazones de ratas. El objetivo principal es hacer hincapié en que myofilament Ca 2 + sensibilidad debe ser tomado en consideración en el acoplamiento CE para el análisis mecanicista. investigación exhaustiva de ien los canales iónicos, transportadores, manejo intracelular de Ca2 +, y la sensibilidad de los miofilamentos de Ca2 + que subyacen en la contractilidad de los miocitos en corazones sanos y enfermos proporcionará información valiosa para el diseño de estrategias más eficaces de traslación y de valor terapéutico.

miocitos LV están aisladas de corazones normales e hipertensos de rata. Miocitos en forma de varilla con estrías claros (que representa sarcómeros) y contracciones estables en respuesta a la estimulación de campo se consideran ser los miocitos óptimas y se seleccionan para las grabaciones (Figura 2A). En el ejemplo mostrado en la FIGURA 2A, un Fura 2 a.m. RESORTE LV miocitos se coloca horizontalmente y la abertura de la cámara se ajusta para que el mioci...

Este artículo describe un protocolo que evalúa los cambios en la sensibilidad del miofilamento Ca2+ durante la contracción en miocitos cardíacos aislados del corazón de rata. Junto con la electrofisiología cardíaca, los niveles de Ca2+ del citosol sistólico/diastólico y la contracción/relajación, esta medición es imprescindible para respaldar los mecanismos que median el acoplamiento de excitación-contracción cardíaca en corazones sanos y enfermos.

Evaluación de los miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidad cardíaca subyacente excitación-contracción de acoplamiento

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la sensibilidad al calcio de los miofilamentos para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos que subyacen a la contracción en corazones sanos y enfermos. Este método puede ayudar a responder preguntas relacionadas con la congestión cardíaca y la insuficiencia cardíaca. La principal ventaja de esta técnica es que, junto con los canales iónicos, los transportadores iónicos y el manejo intercelular del calcio, proporciona una comprensión integral del mecanismo que subyace a la contractilidad del corazón de ratón en condiciones sanas y patológicas del corazón.Para comenzar este procedimiento, caliente dos baños de agua a 37 grados Celsius. Añada cinco mililitros de solución de BSA sin calcio a 25 mililitros de solución de colagenasa uno y 3,3 mililitros de solución de BSA sin calcio a 16,7 mililitros de solución de colagenasa dos. Luego, añada 100 mililitros de solución de aislamiento a la columna uno y 30 mililitros de solución de colagenasa uno a la columna dos en el sistema de perfusión Langendorff.Oxigene la solución de aislamiento y la solución de colagenasa en la columna uno y la columna dos, respectivamente, mediante el tubo de conexión de oxígeno del sistema de perfusión Langendorff. De manera similar, oxigene la solución de colagenasa dos y la solución de albúmina sérica bovina (BSA) en el baño de agua con agitación con oxígeno al 100 % mediante el tubo de conexión de oxígeno. En este paso, tras anestesiar una rata SD mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico, confirme el estado anestésico mediante la compresión del dedo del pie y la ausencia del reflejo de retirada.A continuación, transfiera la rata a una bandeja de disección. En posición supina, sujete las cuatro patas a los lados del cuerpo con cinta adhesiva. Luego, sujete la aorta con pinzas finas y monte inmediatamente la cánula del sistema de perfusión Langendorff.A continuación, ate firmemente el hilo de sutura sobre la aorta. Encienda la válvula de la columna uno y perfunda el corazón aislado con solución de aislamiento precalentada y oxigenada durante 10 minutos. Posteriormente, encienda la válvula de la columna dos y perfunda el corazón con la solución de colagenasa uno durante ocho a 10 minutos.A continuación, retire el corazón digerido cortando la aorta y transfiéralo al matraz que contiene la solución de aislamiento fresca. Utilizando tijeras finas y pinzas, corte la mayor parte de la pared libre del ventrículo izquierdo, incluyendo el septo, en trozos más pequeños. Luego, transfiera los tejidos a un matraz que contenga la solución fresca de colagenasa dos, previamente calentada y oxigenada.Luego, agítelos durante 10 minutos y mantenga la solución de colagenasa que contiene miocitos oxigenada. Posteriormente, transfiera la suspensión de miocitos a un tubo de centrífuga de 10 mililitros y agregue la solución de albúmina sérica bovina (BSA) que contiene calcio. Centrifúguela durante dos minutos.Después de dos minutos, deseche el sobrenadante y re-suspenda el pellet de miocitos en cinco mililitros de solución de BSA. Luego, centrifugue y deseche nuevamente el sobrenadante. A continuación, disperse el pellet de miocitos y mantenga los miocitos en 10 mililitros de solución de almacenamiento preoxigenada a temperatura ambiente hasta el final del experimento.Ahora, cargue los miocitos ventriculares izquierdos con dos micromoles por litro del éster acetoximetil Fura-2AM. Centrifugue un mililitro de la suspensión de miocitos durante 10 segundos. Luego, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento de miocitos en un mililitro de solución de Tyrode con baja concentración de calcio.Posteriormente, agregue Fura-2AM y dos microlitros de poloxámero 407 a los miocitos. Dispersar suavemente la suspensión de miocitos y mantener la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, centrifugar la mezcla durante cinco segundos.Deseche el sobrenadante y disperse el pellet de miocitos en un mililitro de solución de perfusión que contenga 500 micro-molar de calcio. Después de 10 minutos, centrifugue la mezcla durante cinco segundos y deseche el sobrenadante. A continuación, agregue solución de perfusión fresca y mantenga el pellet de miocitos cargado con Fura-2AM en esta solución para las grabaciones.Antes de comenzar la grabación, llene el tubo de perfusión que pasa a través de la camisa de agua con la solución de Tyrode a 36 grados Celsius. Posteriormente, coloque unas gotas de la suspensión de miocitos ventriculares izquierdos cargados con Fura-2AM en la cámara de un microscopio de fluorescencia invertido y espere de cinco a ocho minutos. Perfunda lentamente con la solución de Tyrode a 2,2 mililitros por minuto.Luego, presione el botón de inicio en el panel frontal del estimulador digital para comenzar la estimulación de campo a dos hercios. Seleccione los miocitos que se contraen de manera estable para la grabación. Aquí se muestran los trazos brutos del acortamiento del sarcómero y la medición de la relación Fura-2 en miocitos ventriculares izquierdos de ratas falsas y hipertensas.Aquí se muestran las trazas promedio de la longitud del sarcómero y las señales de Fura-2. Y aquí se presentan las gráficas del plano de fases de la relación de Fura-2 frente a la longitud del sarcómero en los dos grupos. El bucle de la trayectoria se desplaza hacia la derecha y el EC50 tiende a ser mayor en la hipertensión, lo que sugiere una desensibilización del calcio en el filamento contráctil.Antes de realizar este procedimiento, es importante recordar probar el cortio, los miocitos aislados, detectando la contracción del miocito sin la carga de Fura-2AM. Además, siempre verifique la contracción del miocito después de la carga con Fura-2AM para evitar la sobrecarga. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como las técnicas de patch clamp para responder preguntas adicionales.Por ejemplo, un tipo de actividad del canal de calcio, es decir, el acoplamiento excitación-contracción en el miocito. Tras su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el futuro de la fisiología cardíaca exploren nuevos conocimientos sobre las enfermedades del corazón en humanos. Tras adquirir experiencia rutinaria, debería tener una buena comprensión de cómo analizar la actividad del canal de calcio en el miofilamento.Con el fin de comprender mejor los mecanismos que median el acoplamiento excitación-contracción cardíaco en corazones sanos y enfermos.

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Biología

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En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

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Este protocolo tiene como objetivo describir paso a paso la técnica de extracción y evaluación de la función cardíaca utilizando cardiomiocitos despellejados. Esta metodología permite la medición y la agudomodulación de la función de miofilamento utilizando pequeñas biopsias congeladas que se pueden recoger de diferentes lugares cardíacos, desde ratones hasta hombres.

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Presentamos un protocolo para evaluar los efectos electromecánicos de la activación de GtACR1 en cardiomiocitos de conejo. Proporcionamos información detallada sobre el aislamiento celular, el cultivo y la transducción adenoviral, y sobre experimentos funcionales con las técnicas de abrazadera de parche y fibra de carbono.

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Aquí se presenta un protocolo para evaluar las propiedades contráctiles de los miofibriles musculares estriados con resolución nano-Newton. El protocolo emplea una configuración con una sonda de fuerza óptica basada en interferometría. Esta configuración genera datos con una alta relación señal-ruido y permite la evaluación de la cinética contráctil de myofibrils.

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Este protocolo presenta una colección de datos geométricos de sarcómeros, calcio y macroscópicos de una trabécula cardíaca que se contrae activamente ex vivo. Estas mediciones simultáneas son posibles gracias a la integración de tres modalidades de imagen.

Imágenes tomográficas simultáneas de campo brillante, fluorescencia y coherencia óptica de trabéculas cardíacas contacciones ex vivo

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Este protocolo describe cómo medir la contractilidad en cardiomiocitos primarios humanos adultos de corazones de donantes con el sistema MyoBLAZER, una plataforma fiable para evaluar los cambios en la contractilidad inducidos por fármacos durante el desarrollo preclínico.

Medición de la contractilidad cardíaca en cardiomiocitos primarios humanos adultos aislados

La fluorometría funcional dirigida al sitio es un método para estudiar los movimientos del dominio de la proteína en tiempo real. La modificación de esta técnica para su aplicación en células nativas ahora permite la detección y el seguimiento de movimientos de un solo sensor de voltaje de canales Ca2+ dependientes de voltaje en fibras musculares esqueléticas aisladas murinas.

Fluorometría funcional dirigida al sitio en células nativas para estudiar la excitabilidad del músculo esquelético

Aprende a evaluar la sensibilidad de los miofilamentos al Ca²⁺ en cardiomiocitos de rata usando Fura-2 AM y microscopía de fluorescencia. Este protocolo integra manejo de calcio y rendimiento contractil para estudiar el acoplamiento excitación-contracción en corazones sanos y enfermos.

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