Evaluación de los miofilamentos Ca ²⁺ Sensibilidad cardíaca subyacente excitación-contracción de acoplamiento

Este artículo describe un protocolo que evalúa los cambios en la sensibilidad del miofilamento Ca²⁺ durante la contracción en miocitos cardíacos aislados del corazón de rata. Junto con la electrofisiología cardíaca, los niveles de Ca²⁺ del citosol sistólico/diastólico y la contracción/relajación, esta medición es imprescindible para respaldar los mecanismos que median el acoplamiento de excitación-contracción cardíaca en corazones sanos y enfermos.

El objetivo general de este procedimiento es acceder a la sensibilidad al calcio del miofilamento con el fin de mejorar nuestra comprensión de los mecanismos que subyacen a la contracción en corazones sanos y enfermos. Este método puede ayudar a responder preguntas relacionadas con la congestión cardíaca y la insuficiencia cardíaca. La principal ventaja de esta técnica es que, junto con los canales iónicos, los transportadores iónicos y el manejo del calcio intercelular, proporciona una comprensión completa del mecanismo que subyace a la contractilidad del corazón del ratón en pacientes sanos y enfermos.

Para comenzar este procedimiento, caliente dos baños de agua a 37 grados centígrados. Agregue cinco mililitros de solución de BSA sin calcio a 25 mililitros de solución de colagenasa uno y 3,3 mililitros de solución de BSA sin calcio a 16,7 mililitros de solución de colagenasa dos. A continuación, añada 100 mililitros de solución aislante a la columna uno y 30 mililitros de solución de colagenasa uno a la columna dos en el sistema de perfusión de Langendorff.

Oxigenar la solución de aislamiento y la solución de colagenasa uno en la columna uno y la columna dos a través del tubo de conexión de oxígeno en el sistema de perfusión de Langendorff. Del mismo modo, oxigenar la solución dos de colagenasa y la solución BSA en el baño de agua agitado con oxígeno al 100% a través del tubo de conexión de oxígeno. En este paso, después de anestesiar a una rata SD mediante inyección interperitoneal de pentobarbital sódico, confirmar el estado anestésico mediante el pinzamiento de los dedos del pie y la ausencia de reflejo de retirada.

Después, transfiere la rata a una bandeja de disección. En posición supina, asegure las cuatro patas a los lados del cuerpo con cinta adhesiva. A continuación, pinza la aorta con pinzas finas e inmediatamente monte la cánula del sistema de perfusión de Langendorff.

Después de eso, ate el hilo de sutura firmemente sobre la aorta. Abra la válvula de la columna uno y perfunda el corazón aislado con una solución aislante oxigenada y precalentada durante 10 minutos. Posteriormente, abra la válvula en la columna dos y perfunda el corazón con la solución de colagenasa uno durante ocho a 10 minutos.

A continuación, extraiga el corazón digerido cortando la aorta y transfiéralo al matraz que contiene solución de aislamiento fresca. Con unas tijeras finas y fórceps, corte la mayor parte de la pared libre del VI, incluido el tabique, en trozos más pequeños. A continuación, transfiera los tejidos a un matraz que contenga la solución dos de colagenasa fresca precalentada y oxigenada.

A continuación, agítalos durante 10 minutos y mantén oxigenada la solución de colagenasa que contiene miocitos. Posteriormente, transfiera la suspensión de miocitos a un tubo de centrífuga de 10 mililitros y agregue la solución BSA que contiene calcio. Centrifugar durante dos minutos.

Después de dos minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo de miocitos en cinco mililitros de solución BSA. A continuación, centrifugar y desechar de nuevo el sobrenadante. A continuación, disperse la pastilla de miocitos y manténgala en 10 mililitros de solución de almacenamiento preoxigenada a temperatura ambiente hasta el final del experimento.

Ahora, cargue los miocitos LV con dos micromolares acetoximetil éster Fura-2AM. Centrifugar un mililitro de suspensión de miocitos durante 10 segundos. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de miocitos en un mililitro de solución de Tyrode con una baja concentración de calcio.

Posteriormente, añadir Fura-2AM y dos microlitros de poloxámero 407 a los miocitos. Disperse suavemente la suspensión de miocitos y mantenga la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, centrifuga la mezcla durante cinco segundos.

Deseche el sobrenadante y disperse la pastilla de miocitos en un mililitro de solución de perfusión que contenga 500 micromolares de calcio. Después de 10 minutos, centrifugar la mezcla durante cinco segundos y desechar el sobrenadante. A continuación, agregue una solución de perfusión fresca y mantenga el gránulo de miocitos cargado con Fura-2AM en esta solución para las grabaciones.

Antes de grabar, llene el tubo de perfusión que corre a través de una camisa de agua con la solución Tyrode de 36 grados Celsius. Posteriormente, coloque unas gotas de la suspensión de miocitos LV cargada con Fura-2AM en la cámara de un microscopio de florescencia invertida y espere de cinco a ocho minutos. Perfundirlo lentamente con la solución Tyrode a 2,2 mililitros por minuto.

Luego, presione el botón de inicio en el panel frontal del estimulador digital para iniciar la estimulación de campo a dos hercios. Seleccione los miocitos que se contraen de manera estable para la grabación. Aquí se muestran las trazas crudas del acortamiento del sarcómero y la medición de la relación Fura-2 en miocitos VI de ratas simuladas e hipertensas.

Aquí están las trazas promedio de la longitud del sarcómero y las señales de Fura-2. Y aquí están los gráficos del plano de fase de la relación Fura-2 frente a la longitud del sarcómero en los dos grupos. El bucle de trayectoria se desplaza hacia la derecha y EC50 tiende a ser mayor en hipertensión, lo que sugiere desensibilización al calcio del miofilamento.

Antes de intentar este procedimiento, es importante recordar que se debe analizar el cortio, los miocitos aislados, mediante la detección de la contracción de los miocitos sin carga de Fura-2AM. Además, compruebe siempre la contracción de los miocitos después de la carga de Fura-2AM para evitar la sobrecarga. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las técnicas de fijación de parches, para responder preguntas adicionales.

Por ejemplo, la actividad del canal A ca, es decir, en verbo, el acoplamiento excitación-contracción de miocitos. Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el futuro de la fisiología cardíaca exploren más información sobre las enfermedades cardíacas en los seres humanos. Después de la experiencia rutinaria, debe tener una buena comprensión de cómo analizar la actividad del canal de calcio del miofilamento.

Con el fin de comprender mejor los mecanismos que median el acoplamiento de excitación-contracción cardíaca en corazones sanos y enfermos.