Name: Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende terapia génica adenoviral para queratopatía diabética usando córneas humanas cultivadas. Este método restaura la curación de heridas y la expresión de marcadores de células madre epiteliales.

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Agradecemos el apoyo financiero de NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), la subvención CTSI UL 1RR033176 (AVL) y las subvenciones del Instituto de Medicina Regenerativa, Centro Médico Cedars-Cedars.

Investigación de Enfermedades Intercambio Nacional (ISRND, Filadelfia, PA) suministra post mortem ojos humanos sanos y diabéticos con autorización y córneas. protocolo de recogida de tejido humano de ISRND es aprobado por el comité directivo y sujetos a los Institutos Nacionales de Salud de supervisión. Esta investigación se ha llevado a cabo bajo la Junta aprobó el Cedars-Sinai Medical Center de Revisión Institucional (IRB) de protocolo exentos EX-1055. Colaborador de los cirujanos de córnea, los Dres. E. Maguen e Y. Rabinowitz, suministran llantas corneoesclerales de descarte para el aislamiento de cultivos epiteliales de la córnea enriquecida de células madre. Esta investigación se ha realizado con arreglo al protocolo aprobado por el IRB Pro00019393. 1. Human Corneal cultivo de órganos Nota: Las córneas normales y diabéticos o los ojos enteros se reciben en el medio de almacenamiento refrigerado de la córnea (por ejemplo, Optisol GS) en un plazo de 48 horas después de la muerte del proveedor nacional ISRND. <ol><li> Retire las córneas de recipiente de almacenamiento con pinzas y se lavo dos veces in el (ABAM) mezcla de antibiótico-antimicótico. En el caso de los ojos enteros, cortar las córneas hacia fuera de los globos con tijeras curvas. Deje por lo menos un borde conjuntival 5 mm y también lavar las córneas en ABAM. </li><li> Preparar la mezcla para ser colocado en la concavidad corneal. Consiste en medio libre de suero mínimo esencial (MEM) que contiene ABAM, 1 mg / ml de ternero piel de colágeno (hechos a partir de una solución madre de 10 mg / ml en ácido 0,1 N acético), 1% de agar, y la insulina-transferrina-selenito complementar 7. </li><li> Microondas esta mezcla a ebullición durante la esterilización y la disolución de agar. Se puede tomar hasta 1 minuto para que todo se disuelva. Deje la tapa del tubo parcialmente abierta, porque la mezcla se desborda con facilidad cuando hierva. Por esta razón, pueden ser necesarios varios ciclos de ebullición, cada uno por 10-15 seg. Enfriar la mezcla a 37-39 ° C. </li><li> Coloque las córneas lado epitelial hacia abajo en placas de 60 mm estériles. Llene la concavidad corneal con aproximadamente 0,5 ml de la mezcla descrita en 1.2. losmezcla se solidifica en las córneas dentro de 2 min. </li><li> Coloque las córneas con el agar en placas estériles de 60 mm y añadir el medio completo que contiene MEM con ABAM, y la insulina-transferrina-selenita de suplemento de 7 (37 ° C) para mantener su nivel aproximadamente en el limbo de la cultura interfase aire-líquido. El volumen medio es de 7-8 ml por plato. </li><li> Colocar los recipientes con las córneas en un incubador de CO2 5% humidificado con una bandeja de agua (de esta manera, el nivel de humedad se mantiene en o por encima de 95%) a 35 ° C (temperatura de la córnea normal). Añadir 100 l de medio (dos gotas) al día en el epitelio para humedecer las córneas. </li><li> Monitorear la morfología de la córnea y la viabilidad de las células epiteliales al microscopio con luz transmitida utilizando un microscopio estándar con un objetivo 4X. Hacerlo una vez al día. </li><li> Cambiar el medio cada tres días. Las córneas pueden ser cultivadas durante al menos tres semanas. Para los experimentos de terapia génica, la cultura de las córneas durante 3-5 días, luego transduce con genes de interés (4.1-4.4), dejar durante otros 3-5 días, dependiendo del transgén y sujeto al protocolo de cicatrización de la herida (2.1-2.4). </li></ol> 2. La curación de la herida epitelial Nota: En las córneas diabéticos, el desbridamiento epitelial por raspado mecánico no es factible debido a la membrana basal del epitelio frágil se separa en el proceso, lo que no ocurre en las córneas normales. Por lo tanto, para mantener las córneas normales y diabéticos bajo condiciones similares de la cicatrización de heridas, la eliminación química del epitelio con n-heptanol se utiliza 19. Este procedimiento elimina el epitelio, pero deja detrás de una membrana basal intacta tanto en las córneas normales y diabéticos. <ol><li> Para llevar a cabo el centro de desbridamiento epitelial 20, coloque un disco de papel de filtro de 5 mm empapado en n-heptanol en la superficie anterior de la córnea central para 75 seg. </li><li> Retire el filtro y se lavan las córneas en un medio completo. Llene la concavidad con 0,5 ml de agar-colágenola mezcla y la cultura como en 1.4. Tras el desbridamiento, las células epiteliales por lo general mueren y se desprenden dejando atrás la membrana basal intacta microscópicamente 7. </li><li> Use 8,5 mm discos para crear grandes heridas epiteliales en los experimentos con solamente la terapia génica limbal. Esto asegurará la participación de las células madre del limbo en el proceso de curación. </li><li> Monitorear la cicatrización de la córnea microscópicamente. Hacer fotografías en 4X y 10X todos los días hasta que el defecto epitelial esté completamente curada. El proceso de curación puede durar de 2 a 15 días dependiendo del estado (normal o diabética) y el tamaño de la herida. Nota: Durante el proceso de curación, se observan células en forma de araña negro en el plano focal superior. Estas células son queratocitos estromales apoptóticos que murieron después de la extracción epitelial 4. La curación se determina que es completa cuando estas células muertas se hacen salvajes por el epitelio de la curación y ya no son visibles (Figura 2, recuadro). </li><li> después de la curaciónfinalización, cortar las córneas a la mitad, incrustarlos en el compuesto y el proceso de PTU para su inmunofluorescencia indirecta en secciones de criostato o por transferencias de Western 16,21. </li></ol> 3. Aislamiento de células limbares y mantenimiento de Stem Cell Cultures enriquecida Nota: Preparar la célula epitelial primaria del limbo vástago (LESC) enriquecida culturas de las llantas corneoesclerales. Las llantas procedentes de donantes sanos y desechados después de los trasplantes de córnea se reciben de los cirujanos que colaboran en el medio de almacenamiento de la córnea estándar (por ejemplo, Optisol). De lo contrario, los cultivos LESC enriquecido se pueden obtener de las llantas extirpados de córneas enteros normales y diabéticos o globos recibidos de NDRI en el medio de almacenamiento corneal. <ol><li> Si se utilizan las córneas enteras o globos, en primer lugar aislar las áreas límbicas. Para ello, coloque la córnea en un plato de plástico estéril con el lado epitelial hacia arriba y retire la zona central con un trépano de 9 mm (cuchillo corneal circular).Descartar esta parte central. Entonces extirpar la zona del limbo utilizando un trépano de 13 mm y deseche la parte externa de la conjuntiva. Para aislar las células utilizan el borde del limbo panecillo parecido. Antes de aislamiento de células, eliminar las células endoteliales y que se adhieren restos de los iris desde el lado interior de la córnea opuesta a la superficie del epitelio con un bastoncillo de algodón estéril. </li><li> Aislar láminas de células limbares mediante tratamiento dispasa. Incubar cada borde corneoscleral con 2,4 U / ml de dispasa II en 1,5 medio libre de suero ml de queratinocitos (KSFM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C durante 2 hr 22. </li><li> aliviar suavemente la capa celular epitelial limbal de la llanta bajo un microscopio estéreo de disección con un fórceps y disociar las células en 1 ml de 0,25% de tripsina - EDTA 0,02% durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Se lavan las células en 10 ml de medio (por ejemplo, Epilife) y sedimentar ellos a 300 xg en una centrífuga de sobremesa durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> º Resuspendercélulas e en medio de cultivo: medio con N2, B27 y suplementos de crecimiento de queratinocitos humanos, y 10 factor de ng / ml de crecimiento epidérmico (EGF). </li><li> Semillas de las células a 3.000-5.000 células / ml en matraces o placas de 60 mm recubiertas con una mezcla de proteínas de la membrana basal humana, incluyendo la fibronectina, el colágeno de tipo IV, y laminina (FCL), en 0,5 a 1 g / cm 2, en el KSFM medio. </li><li> Cultivar las células en un incubador de CO2 humidificado (95% o mayor humedad) a 37 ° C hasta que forman monocapas confluentes totalmente. Esto puede tomar de 1-2 semanas. Nota: Regularmente confirmar la identidad de la célula mediante tinción inmunohistoquímica positiva para los marcadores putativos LESC incluyendo PAX6, queratina (K) 14, K15, K17, y ΔNp63α. Los detalles de tinción incluyendo los anticuerpos primarios se han publicado 8,16-18,22. </li><li> Para el paso de las células confluentes, los tratan con una solución de 1 ml 0,05% de tripsina (dilución 1: 5 de la solución de 0,25%) durante 10 min a 37 ° C. Añadir 5 ml de soja trsolución de inhibidor ypsin (10 mg / ml) diluido 1: 4 en el medio, y centrifugar las células como en 3.5. </li><li> Lavar el sedimento de células en 3 ml de solución de inhibidor de tripsina de soja diluida. La placa de las células sobre FCL-revestido (véase 3.7) o platos de la cámara de diapositivas de vidrio a 2 x 10 4 células / ml. </li></ol> 4. Transducción adenoviral de córneas de órganos cultivados Nota: Los adenovirus recombinantes (AV) incluyen AV-vector (sin gen insertado), AV-CMET (con el marco de lectura abierta del gen c-MET), AV-shM10 (con shRNA de MMP-10), y AV-SHCF ( con shRNA de catepsina F). Son eliminados E1-E3 / tipo 5 AV expresar genes bajo el control de la principal promotor temprano inmediato de citomegalovirus. Los virus de AV-CMET se generan utilizando el vector AV PAD / CMV / V5-DEST 16. Los virus AV-shRNA se generan a medida por subclonación de secuencias shRNA junto con el promotor HH1 secuencia de marca y GFP de iLenti-EGFP vector en una huma incompetente para la replicación (-E1 / -E3)n tipo AV 5 genoma utilizando adeno-4 sistema de expresión 17. <ol><li> Transducir una córnea órgano-cultivadas de cada par con AV-vector y la otra córnea, con una expresión de genes AV-moduladora. Utilice la AV-CMET en 0.8 a 1.25 x 10 8 unidades formadoras de placa (pfu) por córnea en medio de cultivo durante 48 horas a 37 ° C manteniendo las córneas bajo la superficie del medio cada una en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Usa los virus AV-shRNA a 1-2 x 10 8 pfu por córnea. </li><li> Utilice los virus de la transducción en medio completo suplementado con 75 mg citrato de sildenafil / ml. Este reactivo se activa el transporte caveolina facilitar la absorción viral por las células epiteliales 21. Debido a la corta vida media de sildenafilo en soluciones acuosas, volver a agregar la misma cantidad al medio de 4-5 horas más tarde. El tratamiento estándar es de 48 horas. </li><li> Transferir las córneas a nuevos platos con una espátula estéril extremo redondo y cultura en el medio y sin AV manteniendo el nivel medio en el limbo. Después de la adiciónitional 4-8 días en la interfase aire-líquido, el proceso de las córneas tratadas AV-para diversos análisis o prueba para la curación de heridas epiteliales (véase más arriba). Rutinariamente humedecer las córneas durante el cultivo mediante la adición de 100 l de medio (dos gotas) en la parte superior de la córnea. </li><li> Para la transducción de sólo las células limbares, incubar los virus con las córneas en la interfase aire-líquido con el nivel medio en el limbo, para evitar la transducción del epitelio central. </li></ol> 5. Transducción adenoviral de células cultivadas limbares <ol><li> Mantener los cultivos enriquecidos-LESC en el medio con 10 ng / ml de EGF (véase 3.5) en placas de plástico recubiertas con la mezcla FCL a 0,5 g / cm2. </li><li> Transducir células cultivadas que han alcanzado el 70-80% de confluencia con el AV que alberga el gen de proteína fluorescente verde (AV-GFP) o el shRNA-GFP en una gama de multiplicidad de infección revueltos AV-(MOI: 1 a 300 pfu / célula) , en el medio con 2 ng / ml de EGF. Realice la transduction durante 4 horas a 37 ° C en un volumen mínimo (0,2 ml) seguido de 20 horas en 0,5 ml de medio. El sildenafil activador transporte caveolina no es necesario para la transducción de cultivo celular. </li><li> Utilice uno de los siguientes reactivos que facilitan la unión a la superficie celular AV para mejorar la eficacia de transducción AV: o policationes (1 mg / ml de poli-L-lisina o 5 mg / ml de polibreno), o 6 l / reactivo transducción ml ( por ejemplo, ViraDuctin), o 20 l / ml potenciador de la transducción (por ejemplo, ibiBoost). </li><li> Después de reemplazar el medio por el que no tiene el AV, se incuban las células en cultivo durante 4 días, en el incubador de CO2 humidificado y evaluar el nivel de expresión de GFP usando un microscopio de fluorescencia invertida. </li><li> Utilice el ensayo de cicatrización de la herida cero para evaluar la migración celular en los cultivos transducidos AV. Cultivar las células en los portaobjetos de cámara de múltiples pocillos. Hacer las heridas en una monocapa de células por el rascado en un movimiento lineal recta con una pi 200 lpette punta. Después de la herida, cambiar el medio para uno nuevo para eliminar las células separadas. </li><li> Fotografiar las heridas todos los días con una cámara digital conectada a un microscopio invertido con un aumento de 4X. Grabar el momento en que la curación es completa (los bordes de la herida se ponen en contacto a lo largo de toda la herida). </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros.

La córnea parece ser un tejido ideal para la terapia génica debido a su ubicación superficie en la que la entrega de genes, así como la evaluación de la eficacia y efectos secundarios, son fáciles. Sin embargo, una traducción clínica de este enfoque poderoso sigue siendo lento debido a la escasa información sobre las causas genéticas de las enfermedades de la córnea y los objetivos de terapia génica 24. Complicaciones diabéticas, incluyendo alteraciones de la córnea pueden ser en gran parte epigenética en la ...

La enfermedad de la córnea diabética se debe principalmente en el epitelio degenerativa (queratopatía) y cambios nerviosas (neuropatía). A menudo se manifiesta por las alteraciones de la cicatrización de heridas del epitelio y la reducción de nervio corneal 1-4. Se estima que 60-70% diabéticos tienen diversos problemas corneales 1,3. Nuestros estudios han identificado varias proteínas marcadoras con expresión alterada en las córneas diabéticos humanos, incluida la regulación a la baja de los proto-oncogén (receptor del factor de crecimiento de hepatocitos) c-met y la regulación al alza de la metaloproteinasa de matriz 10 (MMP-10) y la catepsina F 5, 6. también hemos documentado de manera significativa disminución de la expresión de varios marcadores de células madre epiteliales putativos en las córneas diabéticos humanos. En los estudios anteriores hemos desarrollado una terapia génica basada en adenoviral para normalizar los niveles de marcadores de la diabetes alterado utilizando el sistema de la córnea diabética humana de cultivo de órganos, que muestra lenta la cicatrización de heridas, diabéticocambios de marcador, y la reducción de la expresión de marcadores de células similares a las córneas ex vivo 7,8 tallo. Esta persistencia de los cambios parece ser debido a la existencia de memoria metabólica epigenética 9. Este sistema de cultivo era más utilizados para la terapia génica. Los objetivos para esta terapia se eligieron a partir de marcadores, ya sea con una expresión reducida en córneas diabéticos (c-met proto-oncogén), o aumento de la expresión (MMP-10 y la catepsina F). La terapia adenoviral (AV) se utilizó en todo el córneas de órganos-cultivadas o sólo la corneoscleral compartimento limbal periférica. Este compartimiento alberga las células madre epiteliales que renuevan el epitelio corneal y participan activamente en la curación de heridas 4,10-15. Aquí, se proporcionan protocolos para el cultivo normal y diabética humana corneal de órganos, la cicatrización de heridas del epitelio, el aislamiento y la caracterización de los cultivos celulares limbal enriquecida de células madre, y células adenoviral y la transducción de la córnea. Nuestraresultados demuestran la factibilidad de este tratamiento para la normalización de la expresión del marcador y la cicatrización de heridas en diabéticos córneas para trasplante posible futuro. También sugieren que la terapia de combinación es la forma más eficaz para restaurar patrón marcador normal y la curación epitelial en la córnea diabética 16-18.

<table><tbody><tr><td>medio esencial mínimo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Optisol-GS&nbsp;</td><td>Bausch & Lomb</td><td>50006-OPT</td><td></td></tr><tr><td>ABAM mezcla de antibióticos y antimicóticos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>colágeno de piel de ternero&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Agar C9791</td><td></td></tr><tr><td>, grado de cultivo de tejidos</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>n-heptanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>72954-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. compuesto&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II&nbsp;</td><td>Roche Applied Science</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>medio libre de suero de queratinocitos (KSFM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>medio EpiLife con calcio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MEPI500CA</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento de medio, 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento medio, 50x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos, 100x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>tripsina 0,25% - EDTA 0,02% con rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>tripsina 0,25% con rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>inhibidor de tripsina de soja&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>suplemento de insulina-transferrina-selenito (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I3146-5ML</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo contra la queratina 14</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53253</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo contra la queratina 15</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47697</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo contra la queratina 17</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-58726</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo contra &Delta; Np63 y alfa;</td>Anticuerpo <td>sc-8609</td><td></td>de <td>Santa Cruz Biotechnology</td></tr><tr><td>contra PAX6</td><td>BioLegend</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo contra nidogen-1</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2570</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo a la integrina y alfa; 3 y beta; 1</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1992</td><td></td></tr><tr><td>fibronectina humana</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>laminina humana</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L4445</td><td></td></tr><tr><td>colágeno humano tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C6745-1ML</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus que expresa MMP-10 shRNA</td><td>Capital BioSciences</td> adenovirus hecho <td></td><td>a medida</td></tr><tr><td>que expresa catepsina F shRNA</td><td>Capital BioSciences</td> adenovirus <td>hecho</td><td></td>a medida</tr><tr><td>que expresa shRNA revuelto y GFP</td><td>Capital BioSciences</td> adenovirus <td>hecho</td><td></td>a medida</tr><tr><td>que expresa c-met</td><td>OriGene (plásmido)</td><td>SC323278</td><td></td></tr><tr><td>adenovirus que expresa GFP</td><td>KeraFAST</td><td>FVQ002</td><td></td></tr><tr><td>citrato de sildenafil, 25 mg</td><td>Pfizer</td><td>de farmacia</td><td></td></tr><tr><td>factor de crecimiento epidérmico&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>polibreno</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>ViraDuctin</td><td>Cell Biolabs</td><td>AD-200</td><td></td></tr><tr><td>ibiBoost</td><td>ibidi, Alemania</td><td>50301</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de extremo redondo Corning&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Placas de Petri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174888</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II portaobjetos de cámara multipocillo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6807</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l puntas de pipeta</td><td>Bioexpress</td><td>P-1233-200</td><td>otros proveedores disponibles</td></tr><tr><td>microscopio invertido &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Diaphot</td><td>otros proveedores/modelos disponibles</td></tr><tr><td>incubadora de CO2 humidificada&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370 (Steri-Cycle)</td><td>otros proveedores/modelos disponibles</td></tr><tr><td>microscopio fluorescente</td><td>Olympus, Japón</td><td>BX-40</td><td>otros proveedores/modelos disponibles</td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico de disección</td><td>Leica, Alemania</td><td>S4 E</td><td>otros proveedores/modelos disponibles</td></tr></tbody></table>

terapia génica adenoviral para diabetic queratopatía: efectos en la curación de heridas y stem cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales limbal

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

El objetivo de este protocolo es describir las alteraciones moleculares en las córneas diabéticos humanos y demostrar cómo pueden ser aliviados mediante terapia génica adenoviral en córneas cultivadas de órganos. La enfermedad de la córnea diabética es una complicación de la diabetes con anomalías frecuentes de los nervios corneales y la curación de heridas epiteliales. También hemos documentado la expresión alterada de manera significativa de varios marcadores de células madre epiteliales putativos en córneas humanas diabéticos. Para aliviar estos cambios, la terapia génica adenoviral se aplicó con éxito el uso de la regulación al alza de la expresión de proto-oncogén c-met y / o la regulación a la baja de la matriz metaloproteinasa-proteinasas 10 (MMP-10) y la catepsina F. Esta terapia acelerado la cicatrización de heridas en diabéticos córneas incluso cuando fue transducida sólo el compartimento de células madre del limbo. Los mejores resultados se obtuvieron con el tratamiento combinado. Para el trasplante posible paciente de las células madre normalizadas, un ejemplo se presenta también de la optimizatien la transducción de genes en cultivos enriquecidos con células madre utilizando potenciadores policatiónicos. Este enfoque puede ser útil no sólo para los genes seleccionados, sino también para los otros mediadores de la cicatrización de la herida corneal epitelial y la función de células madre.

Hemos demostrado previamente que en los cultivos de órganos de la córnea, las diferencias en la expresión de marcadores de la diabetes (por ejemplo, proteínas de la membrana basal y α3β1 integrina) y la cicatrización de heridas entre las córneas normales y diabéticos se conservan. Este sistema de cultivo se sometió a la terapia génica dirigida a la normalización de los niveles de marcadores de la diabetes alterado, c-Met, MMP-10, y catepsina F. <p class="jove_content" fo:kee...

Se presenta un ejemplo de terapia génica adenoviral en las córneas diabéticas humanas cultivadas con órganos para la normalización de la cicatrización tardía de heridas y la expresión marcadamente reducida de marcadores de células madre epiteliales en estas córneas. También se describe la optimización de este proceso en cultivos epiteliales limbales enriquecidos con células madre.

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

El objetivo general de este protocolo experimental es describir las alteraciones moleculares en córneas humanas diabéticas y demostrar cómo pueden aliviarse mediante terapia génica con adenovirus, en córneas cultivadas en órganos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la córnea diabética, como qué alteraciones moleculares subyacen a la cicatrización retardada de heridas epiteliales en el diabetes y la expresión anormal de moléculas de SEM epitelial. La principal ventaja de esta técnica es que permite probar enfoques de terapia génica dirigidos a diversos mediadores de la cicatrización de heridas epiteliales corneales y la función de células madre en córneas en cultivo de órganos.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de otras enfermedades corneales relacionadas con la disfunción de las células madre, ya que hemos demostrado la validez del método para normalizar las células madre corneales ultradiabéticas. Coloque las córneas con el epitelio hacia abajo en placas estériles de 60 milímetros y llene la concavidad con 0,5 mililitros de la mezcla de agar-colágeno. La mezcla se solidifica sobre las córneas en menos de dos minutos

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

Se describe hepática neo-islote formación en STZ (estreptozotocina)-ratones diabéticos inducidos por la transferencia de genes de Neurogenin3 (Ngn3) y betacelulina (BTC) usando ayudante dependiente de vector adenoviral (HDAD) y la inversión de la hiperglucemia. Nuestro método tiene ventajas de dependientes helper-vectores adenovirales con su alta eficiencia en la transducción in vivo y la expresión génica a largo duradera.

Neo-Islet Formación en el hígado de ratones diabéticos por Ayudante dependiente de transferencia adenoviral Gene mediada por vector

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Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

El siguiente artículo proporciona una técnica sencilla, reproducible para crear efectivamente un modelo sostenible de ratón de la insuficiencia límbica (SIL). Este modelo animal es útil para probar y comparar la eficacia de los tratamientos para las enfermedades de las células madre del limbo.

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Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

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En este manuscrito, la inyección subconjuntival se demuestra como un método válido de administración de vectores para tejidos oculares en ratones utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción y una jeringa extraíble hermética al gas acoplada con agujas de microinyección. Este sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular.

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Aprende terapia génica adenoviral para queratopatía diabética usando córneas humanas cultivadas. Este método restaura la curación de heridas y la expresión de marcadores de células madre epiteliales.

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal (Video) | JoVE Journal

Terapia génica adenoviral para Diabetic Queratopatía: Efectos en la curación de heridas y Stem Cell expresión del marcador en córneas de órganos cultivados humanos y células epiteliales Limbal

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