Diseño y Desarrollo de aptámeros y oro nanopartículas basados en ensayos colorimétricos para aplicaciones en-el-campo
23 de junio de 2016
El diseño y desarrollo de un ensayo colorimétrico de nanopartículas aptámero-oro para la detección de moléculas pequeñas para aplicaciones en-el-campo se examinó. Además, una aplicación colorimétrico smart-dispositivo (app) fue validado y se estableció el almacenamiento a largo plazo del ensayo para uso en el campo.
El objetivo general es proporcionar un enfoque general para el desarrollo de un ensayo colorimétrico basado en nanopartículas de áptamo y oro para la detección de moléculas objetivo, y proporcionar enfoques para mejorar el almacenamiento a largo plazo y reducir las tasas de respuesta falsa positiva. Este método responde a preguntas clave en el campo de los ensayos colorimétricos de nanopartículas de oro sobre aptámeros, como la reproducibilidad de los ensayos en el campo para almacenamiento a largo plazo y la reducción de la tasa de respuesta falsa positiva. Estos ensayos pueden ser propensos a problemas de vida útil y respuestas falsas positivas.
En este trabajo, mejoramos ambos temas. Limpia un matraz Erlenmeyer de 500 mililitros y una gran barra agitadora con cinco mililitros de ácido nítrico concentrado y 15 mililitros de ácido clorhídrico concentrado en una campana de seguridad química. Módete toda la superficie del matraz con el lavado ácido.
Luego enjuaga el matraz con agua sin nucleasas y deja que se seque. Añade 100 mililitros de un milimolar de oro tres cloruros. Utiliza una lámina de papel de aluminio para cubrir la parte superior del matraz Erlenmeyer limpiado con ácido y calienta removiendo continuamente en una placa caliente hasta que hierva.
Después, añade 10 mililitros de citrato de sodio 38,8 milimolar. El color cambia de claro o gris a azul oscuro o negro, y finalmente a oscuro a rojo en varios minutos. Sigue removiendo con el fuego apagado durante 10 minutos.
Deja que la suspensión de nanopartículas doradas se enfríe a temperatura ambiente y añade 110 microlitros de DEPC con agitación continua. Cubre todo el matraz con papel de aluminio y deja que el tratamiento DEPC incube durante la noche. Al día siguiente, autoclave de la suspensión de nanopartículas de oro.
Luego enfría hasta temperatura ambiente y filtra a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micras. Guarda la solución de nanopartículas de oro filtrada y autoclavada en la oscuridad a cuatro grados Celsius. Calcula la concentración de nanopartículas de oro tal y como se describe en el protocolo de texto.
Aquí, la concentración se calculó en 10 nanomolares con un tamaño de 15 nanómetros determinado por dispersión dinámica de luz. Compra o sintetiza las secuencias de aptámeros que se unen a la cocaína utilizando la química estándar de fosforamidita. Tras purificar los aptámeros mediante desalación estándar, reconstituir los oligonucleótidos en agua libre de nucleasas en soluciones de stock de 100 micromolares o de un milimolar.
Los apámeros purificados aliquotados pueden almacenarse a 20 grados Celsius durante varios meses. Combinar el ADN con la solución de nanopartículas de oro de 10 nanomolares, variando el volumen de nanopartículas de oro según se desee, para obtener suficiente muestra para realizar la prueba. Incuba la mezcla durante tres o cuatro horas a temperatura ambiente y protégela de la luz.
Añade un volumen igual de 20 milimolares de HEPES, dos milimolares de cloruro de magnesio y un tampón de pH 7,4, y coloca la muestra a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante la noche. La concentración inicial de sal necesaria para inducir la respuesta de color del ensayo mediante titulación de sal se determina con el blank del ensayo. Añadir 20 microlitros de metanol a 180 microlitros de aalícuotas del ensayo aptámero-cloruro de oro en una placa de 96 pozos.
Un paso crítico en el rendimiento de estos ensayos es determinar la concentración de cloruro de sodio para desestabilizar las nanopartículas de oro una vez añadido el objetivo. Titula las muestras con volúmenes crecientes de solución de cloruro de sodio y determina el punto de equivalencia. Aquí, determina el volumen de cloruro de sodio necesario para causar el más mínimo cambio de color mediante observación visual.
Optimizando la respuesta al ensayo, añadir 20 microlitros de moléculas de analito diluidas en metanol a 180 microlitros de aalícuotas de ensayo de nanopartículas aptámero-oro en una placa de 96 pozos a temperatura ambiente. Inmediatamente, añade la concentración de cloruro de sodio determinada en el paso anterior para iniciar la respuesta de color del ensayo. Obtén el mayor cambio de color posible aumentando o disminuyendo la concentración de cloruro de sodio y comparando la respuesta objetivo con la respuesta en blanco.
Utiliza la concentración de cloruro de sodio que proporciona la mayor diferencia de respuesta. Observa o mide la respuesta al ensayo 150 segundos después de añadir cloruro de sodio. Analizar la absorbancia a 650 nanómetros y 530 nanómetros utilizando un espectrofotómetro.
Grafica los resultados como la relación de absorbancia obtenida a 650 nanómetros y 530 nanómetros en función de la concentración del analito. Normaliza la respuesta del ensayo a la señal en blanco. Prepara los componentes del ensayo de nanopartículas de átamero-oro como se describió anteriormente en el vídeo.
Haz soluciones separadas que contengan un gramo por mililitro de trehalosa y un gramo por mililitro de sacarosa en agua sin nucleasas para preparar la solución criogénica. Por tanto, un paso crítico para congelar estos ensayos es determinar cuánta trehalosa y soluciones de sacarosa añadir a las muestras para asegurar la congelación total e incluso la congelación. Elabora una solución que contenga 19,2 miligramos por mililitro de trehalosa y 4,8 miligramos por mililitro de sacarosa con el ensayo de 60 MN4 ADN por nanopartícula de oro a un volumen final de 200 microlitros en tubos microcentrífugas de 1,5 mililitros.
Las concentraciones finales de solución criogénica variarán según la cobertura de ADN. Congela rápidamente las muestras usando un congelador a 146 grados Celsius o en nitrógeno líquido. Guarda las muestras congeladas hasta que se usen.
Para este trabajo, deja las muestras en el congelador a 146 grados Celsius durante la noche y luego transfiere a un congelador a 20 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo. A continuación se muestran resultados representativos de las curvas de titulación de cloruro de sodio para nanopartículas de oro no tratadas y tratadas con ADN con aptámero. La concentración inicial de cloruro de sodio utilizada en el ensayo se determinó mediante titulación.
Aquí se muestran resultados representativos del ensayo colorimétrico de nanopartículas aptámero-oro para cocaína y moléculas de control. Los gráficos revelan el efecto que el aumento de la densidad de cobertura de ADN tiene en la tasa de respuesta falsa positiva del ensayo de cocaína. Aquí se muestran los gráficos de curvas de calibración obtenidos a partir del análisis fotoimagen del ensayo colorimétrico de cocaína.
Fotos obtenidas con smartphones. Aquí se presentan resultados representativos de la respuesta del ensayo colorimétrico de nanopartículas aptámero-oro a la cocaína y moléculas de control. Los datos comparan muestras recién preparadas con muestras almacenadas congeladas hasta cuatro semanas.
Al intentar este procedimiento, es muy importante determinar la concentración adecuada de cloruro de sodio para desestabilizar las nanopartículas de oro y promover el cambio típico de color al añadir el objetivo. Así que, tras ver este vídeo, deberías tener un buen entendimiento de cómo desarrollar ensayos colorimétricos de nanopartículas de oro aptámero para la detección de objetivos de interés. Puedes utilizar los enfoques aquí descritos para reducir las tasas de respuesta a falsos positivos y mantener tus ensayos viables durante más de un mes.
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Descripción general
Este estudio se centra en el desarrollo de un ensayo colorimétrico con nanopartículas de oro y aptámeros para detectar moléculas pequeñas en aplicaciones de campo. También aborda soluciones para el almacenamiento a largo plazo y tiene como objetivo reducir las tasas de falsos positivos en estos ensayos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- bioquímica
- nanotecnología
- química analítica
Antecedentes
- Los ensayos con aptámeros y nanopartículas de oro se utilizan para detectar moléculas diana.
- Estos ensayos enfrentan desafíos relacionados con la vida útil y los falsos positivos.
- Es esencial mejorar la reproducibilidad en condiciones de campo.
- Los métodos de almacenamiento a largo plazo deben validarse para aplicaciones prácticas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo colorimétrico confiable utilizando aptámeros y nanopartículas de oro.
- Mejorar la capacidad de almacenamiento a largo plazo del ensayo.
- Minimizar las respuestas falsos positivas en la detección.
Métodos Utilizados
- La preparación del ensayo implica la limpieza de equipos de laboratorio con ácido.
- Validación de una aplicación para dispositivos inteligentes destinada al análisis colorimétrico.
- Prueba del rendimiento del ensayo en condiciones de campo.
- Establecimiento de protocolos para el almacenamiento a largo plazo del ensayo.
Resultados principales
- El ensayo demostró una reproducibilidad mejorada en pruebas de campo.
- Los métodos de almacenamiento a largo plazo se validaron con éxito.
- Las tasas de falsos positivos se redujeron significativamente.
- La aplicación para dispositivos inteligentes funcionó eficazmente para la detección colorimétrica.
Conclusiones
- El ensayo desarrollado es adecuado para aplicaciones en campo.
- Las mejoras en almacenamiento y precisión aumentan su utilidad práctica.
- Este trabajo contribuye al avance de los métodos de detección basados en nanopartículas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El desarrollo de métodos de detección robustos y aptos para su uso en campo para moléculas pequeñas sigue siendo un desafío crítico en la validación temprana de dianas y en el desarrollo de ensayos. Los ensayos colorimétricos basados en aptámeros y nanopartículas de oro ofrecen una vía para reducir la ambigüedad mecanicista y mejorar la confianza predictiva en los flujos de trabajo de cribado, al permitir lecturas cuantitativas y visuales adaptables a entornos con recursos limitados. Abordar las limitaciones de vida útil en anaquel y las tasas de falsos positivos apoya directamente los esfuerzos de biomarcadores traslacionales y la fiabilidad de modelos preclínicos, asegurando la consistencia del ensayo a través de las distintas etapas del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante respuestas colorimétricas específicas del blanco que aclaran las interacciones de unión.
- Valor operativo: Reduce las señales falsas positivas mediante la pasivación superficial del aptámero, mejorando la especificidad del ensayo en matrices complejas.
- Valor predictivo: Facilita la identificación de compuestos iniciales al proporcionar relaciones normalizadas de absorbancia (650nm/530nm) como lecturas cuantitativas para la detección del blanco dependiente de la concentración.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera curvas de respuesta calibradas mediante análisis de imágenes basado en teléfonos inteligentes, lo que permite la evaluación reproducible de compuestos sin necesidad de equipos de laboratorio de alta precisión.
- Valor operativo: Establece protocolos de criopreservación con soluciones de trehalosa-sacarosa, extendiendo la viabilidad del ensayo más allá de un mes bajo almacenamiento congelado.
- Valor de escalabilidad: Utiliza formatos estandarizados de placas de 96 pocillos y titulación con cloruro de sodio para definir puntos de equivalencia, facilitando la estandarización del ensayo entre diferentes equipos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor traslacional: Conecta datos de interacción con el blanco en fase de descubrimiento con la continuidad preclínica mediante reactivos estables y almacenados a largo plazo, adecuados para pruebas iterativas.
- Reducción de riesgos: Minimiza las tasas de falsos positivos en lecturas colorimétricas, reduce el ruido en estudios de alineación de biomarcadores y mejora la confianza en la toma de decisiones.
- Valor de reproducibilidad: Demuestra un rendimiento consistente entre muestras recién preparadas y muestras congeladas durante cuatro semanas, lo que favorece el intercambio confiable de datos entre diferentes funciones.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos prometedores, donde salidas cuantitativas e interpretadas visualmente respaldan decisiones de continuar o descartar basadas en la intensidad y selectividad del acoplamiento al blanco.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de cambios dependientes del analito en la agregación de nanopartículas de oro a través de relaciones espectrofotométricas.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante puntos de equivalencia definidos de cloruro de sodio y métricas de respuesta normalizadas que posibilitan la selección fiable de compuestos.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (relaciones A650/A530) que permiten a los equipos comparar concentraciones de analitos y normalizar respecto a señales en blanco.
- Investigación Traducional: Garantiza la continuidad preclínica mediante reactivos criostables que mantienen su funcionalidad durante períodos prolongados de almacenamiento.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma modular basada en reactivos, adaptable a diversos objetivos de moléculas pequeñas mediante la sustitución de aptámeros.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista y la mejora de las relaciones señal-ruido.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante criopreservación y análisis de color habilitado por teléfono inteligente.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción al minimizar los avances falsos debidos a interacciones no específicas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante ensayos con estabilidad y especificidad demostradas a lo largo del tiempo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de oligonucleótidos, la síntesis de nanopartículas y la optimización de tampones.
- Depende del acceso a bloques térmicos, centrífugas, espectrofotómetros o dispositivos de imagen colorimétrica, y unidades de almacenamiento en frío.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de titulación de cloruro de sodio y las formulaciones de crioprotectores.
- Implica consideraciones de adaptación al transferir ensayos entre diferentes dianas de aptámeros o matrices de muestra.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de optimización empírica de las concentraciones de sal y de las relaciones aptámero:nanopartícula para cada nueva diana.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Synthesis via Citrate Reduction of Gold Nanoparticles (AuNP) and Characterization
2:35
DNA-aptamer, Buffer, Solution, and Assay Preparation
3:35
Salt Titration and Assay Setup
5:21
Freezing Aptamer–AuNP Assay for Long-term Storage
6:38
Results: Assay Response with Changing DNA Coverage Density and Performance of the Assay for Long-term Storage
7:37
Conclusion
