Verificación rápida de Terminators Uso de la PGR-Blue plásmido y montaje de puerta de oro

El objetivo general del protocolo de biología sintética es determinar rápidamente la funcionalidad del terminador y cuantificar la fuerza del terminador en un sistema in vitro que utiliza el ensamblaje Golden Gate. Este protocolo se utiliza para probar terminadores que encontramos in silico utilizando bioinformática y probarlos en un entorno biológico. Esto permite una confirmación rápida y sencilla de los terminadores identificados bioinformáticamente en una mesa de laboratorio.

La principal ventaja de este protocolo es su velocidad. Podemos pasar de la identificación bioinformática a la confirmación biológica en menos de una semana. Y al hacerlo, también podemos verificar que un terminador es de hecho un terminador y podemos cuantificar su fuerza de terminación.

Por lo general, las personas inicialmente tendrán dificultades con esta técnica, porque suena contradictorio agregar la enzima de restricción con una ligasa en el mismo tubo. Sin embargo, utilizamos endonucleasas de restricción de tipo 2S y el sitio de reconocimiento de la enzima está separado del sitio de corte real. Una vez que el terminador se liga en el plásmido azul pGR, se trata de una ligadura permanente.

Sin embargo, al tener la enzima de restricción y la ligasa en el mismo tubo, pasando por múltiples ciclos, podemos lograr una alta eficiencia de enclore. Comience este procedimiento volviendo a suspender los oligonucleótidos individuales en agua libre de nucleasas a una concentración de 100 micromolares, luego prepare un tampón de recocido 10x. A continuación, etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada terminador que se vaya a probar.

A cada tubo, agregue 16 microlitros de agua ultrapura, 2 microlitros de tampón de recocido 10x y 1 microlitro de cada uno de los oligonuclotidos de la hebra superior e inferior de los terminadores deseados. Es muy importante asegurarse de que los oligonuclotidos que ordenó tengan los extremos pegajosos correctos. Porque una vez que se recocen juntos, es importante asegurarse de que el terminador esté en la orientación correcta.

Si el terminador está en la orientación incorrecta, pGR blue no podrá verificar si es un terminador en funcionamiento. A continuación, coloque los tubos de microcentrífuga en un flotador y hiérvalos durante cuatro minutos en un baño de agua. Después de cuatro minutos, apague la placa de calor pero deje el tubo en el agua durante la noche para que se enfríe lentamente.

Guarde los terminadores recocidos a 20 grados centígrados. Para hacer una dilución de 40 nanomolares de los terminadores recocidos, primero descongélelos en hielo, luego en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, agregue 124 microlitros de agua libre de nucleasas, a 1 microlitro de los terminadores recocidos. Centrifugar las muestras durante 30 segundos a 10.000x g.

Después del centrifugado, guarde las muestras en hielo. En un nuevo tubo apropiado para termociclador, agregue 6 microlitros de agua libre de nucleasas. A continuación, añada un microlitro de tampón de ADN ligasa comercial.

Realice todos los pasos posteriores en hielo. A continuación, agregue 1 microlitro que contenga de 35 a 50 nanogramos por microlitro del plásmido de destino azul pGR, 1 microlitro de los 40 terminadores recocidos nanomolares, 0,5 microlitros de endonucleasa de restricción BSA1 comercial de alta fidelidad y 0,5 microlitros de ADN ligasa comercial. Centrifugar la mezcla de reacción a 10.000x g durante 120 segundos.

A continuación, coloque el tubo directamente en el termociclador y ejecute el siguiente programa: 20 ciclos de 1 minuto a 37 grados centígrados, seguidos de 1 minuto a 16 grados centígrados y luego un ciclo de 15 minutos a 37 grados centígrados. Después de la ejecución, congele y almacene las muestras a 20 grados centígrados, o proceda inmediatamente a la transformación.

Transformar las reacciones de ligadura en células de E. coli químicamente competentes utilizando cualquier protocolo de transformación apropiado. Aquí, las celdas JM109 se transforman mediante la transformación rápida.

Usando un palo de hockey de vidrio en forma de L, esparce 25 microlitros de las células transformadas en placas de agar LB precalentadas que contienen 1 milimolar de ampicilina y 10 milimolares de arabinosa. Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados. No los incube durante más de 24 horas.

La ampicilina se degrada rápidamente. Al día siguiente, inspecciona el color de las colonias. Una ligadura exitosa debe ser blanca o amarilla con luz visible, y emitirá fluorescencia verde bajo luz azul o ultravioleta.

Una ligadura fallida producirá una colonia de color azul bajo la luz visible. Para cada uno de los terminadores y controles, prepare un tubo de ensayo que contenga 5 mililitros de caldo LB estéril con 1 milimolar de ampicilina y 10 milimolares de arabinosa. Al realizar este protocolo, con pGR es muy importante asegurarse de que se implementen los controles adecuados.

El primer control debe ser simplemente caldo LB. El siguiente control deben ser las células que tienen resistencia a la ampicilina, pero que no emiten fluorescencia bajo la luz azul. Estos servirán como un espacio en blanco.

El siguiente control es un plásmido pGR que no está cortado, por lo que no tiene un terminador en su lugar y esto servirá como línea de base para la fuerza del terminador y el último de sus tubos será para su muestra. Bajo luz visible, use un asa estéril para recoger de 2 a 3 colonias blancas o amarillas y transfiérelas al caldo LB. Deje que las muestras se incuben en un agitador a 37 grados centígrados a 160 rpm durante 16 a 18 horas.

Al día siguiente, use un espectrofotómetro para determinar la densidad óptica de celdas de cada muestra a 600 nanómetros. Generalmente, después de esta cantidad de tiempo, se espera un OD 600 de 0.8 a 1.0. Coloque una placa estéril de 96 pocillos en la campana.

Para cada muestra o control, prepare 3 pocillos con 199 microlitros de caldo LB estéril con ampicilina y arabinosa. A continuación, pipetee 1 microlitro de la solución celular de los caldos durante la noche en pocillos individuales de la placa de 96 pocillos. Llene las placas con una funda transpirable y luego agítelas durante 18 a 20 horas a 37 grados centígrados y 160 rpm.

Al día siguiente, use un lector de placas para determinar el diámetro exterior de 600, que debe ser aproximadamente 0.5. Además, mida la fluorescencia G de P a una longitud de onda de excitación de 395 nanómetros y a una emisión de 509 nanómetros. Mida la fluorescencia RFP a una longitud de onda de excitación de 575 nanómetros y una emisión de 605 nanómetros.

Usando Excel, normalice la variación en el crecimiento dividiendo la florescencia por el OD 600. Después de la normalización, determine la fuerza relativa del terminador tomando la fluorescencia del terminador GFP sobre la fluorescencia de control GFP y dividiéndola por la fluorescencia del terminador RFP sobre la fluorescencia del control RFP. Se analizaron los terminadores putativos T1 a 6 identificados bioinformáticamente en el fago de microbacterias bernal 13 como se describe en este video.

Estos resultados muestran fluorescencia relativa. Todos los resultados se normalizaron utilizando celdas que contenían PGR sin cortar y sin modificar como control. Se descubrió que T3 era un terminador fuerte.

Todos los resultados representan colonias individuales cultivadas por triplicado y promediadas para la representación visual. Las barras de error representan desviaciones entre los puntos de datos promediados. Para determinar el mejor control de referencia para cuantificar la fuerza del terminador, se compararon los datos brutos utilizando el plásmido pGR original que no contenía ningún terminador y el azul pGR clonado con una secuencia que se sabía que no era un terminador.

Como se puede ver aquí, ambos controles mostraron niveles similares de expresión de GFP y RFP y, lo que es más importante, produjeron proporciones similares de GFP a RFP. Todos estos resultados representan colonias individuales que se cultivaron por triplicado y se promediaron para la representación visual. Una vez dominada, esta técnica puede tardar tan solo 72 horas, incluido el tiempo de envío y pedido.

Es importante tener en cuenta que el azul pGR solo funciona en e.coli. Además, dado que solo estamos viendo una pequeña parte del terminador, realmente no tenemos idea de otros elementos reguladores que puedan controlar la transcripción. Para verificar los resultados que se obtienen con este protocolo utilizando pGR blue, se pueden utilizar métodos adicionales como la PCR cuantitativa.

Además, el inserto de pGR se puede cortar y ligar en un plásmido de su elección.