Name: Verificación rápida de Terminators Uso de la PGR-Blue plásmido y montaje de puerta de oro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a verificar terminadores mediante ensamblaje Golden Gate y plásmido pGR-Blue. Este protocolo permite cuantificar su fuerza en menos de una semana, acelerando la validación experimental en biología sintética.

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Los autores desean reconocer Malcolm Campbell y Todd Eckdahl con el Consorcio del Genoma de la enseñanza activa (GCAT) y la Alianza de Educación HHMI-Ciencia - Programa de cazadores de fagos que subieron Genómica Evolutiva y Ciencia (SEA-FAGOS). Este proyecto fue apoyado por becas de la National Center for Research Resources (P20RR016460) y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (P20GM103429) de los Institutos Nacionales de Salud. Esta investigación fue financiada en parte por la National Science Foundation bajo la subvención # IIA-1457888. (Ouachita Baptist University) los fondos institucionales, además, se proporcionan a través de la JD Patterson verano beca de investigación.

1. Diseñar y oligonucleótidos pedidos con las apropiadas pegajosas Final <ol><li> Identificar posibles terminadores rho-independientes a través del análisis genómico utilizando programas que están disponibles gratuitamente en línea. 7 </li><li> Cuando se trabaja con ADN de doble cadena, determinar la orientación del terminador a ensayar. 7 El plásmido PGR-azul sólo verifica terminadores ligados en el 5 &#39;a 3&#39; en la parte superior (capítulo adelante). <ol><li> Convertir una cadena de terminador inferior (hacia atrás) con su complemento invertido para reorientar la secuencia para realizar pruebas en PGR-Azul uso de software libre en línea, por ejemplo, mono. </li></ol></li><li> Después de la orientación se determina que es correcta, añadir el extremo cohesivo &quot;5&#39;-CGAC-3 &#39;&quot; al extremo 5&#39; de la cadena superior. Añadir el extremo pegajoso &quot;5&#39;-CCGC-3 &#39;&quot; al extremo 5&#39; de la cadena inferior. 8 Esto asegurará que inserto se ligó se insertará en la apropiadaorientación usando GGA. </li><li> Una vez que se determinan las secuencias, la orden como oligonucleótidos de cadena simple vista comercial. </li></ol> 2. El recocido oligonucleótidos (sólo se aplica a liofilizada ADN) <ol><li> Vuelva a suspender los oligonucleótidos individuales en agua libre de nucleasa a una concentración de 100 mM. </li><li> Hacer 10x tampón de hibridación: 1 M NaCl y Tris-HCl pH 7,4 100. tampón de reasociación se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas. Una vez que se hace tampón de reasociación y los oligonucleótidos se resuspendió, comenzar el recocido 8. </li><li> Para cada terminador a ensayar, añadir 16 l de agua ultra pura a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir 2 l de 10x tampón de reasociación a cada tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 1 l de oligonucleótido cadena superior (100 m) desde el terminador deseada. </li><li> Añadir 1 l de oligonucleótido cadena inferior (100 mM) de el terminador deseado. </li><li> Crear un punto de ebullición de agua baTH utilizando un vaso de precipitados de 1000 ml que contenía aproximadamente 400 ml de agua del grifo y colocar en un plato caliente. </li><li> Coloque los tubos de microcentrífuga de la etapa 2.6 en un flotador y hervir durante 4 minutos. Después de 4 minutos, apagar la placa de calor, pero dejar el tubo y flotar en el baño de agua fría para O / N (18 h) 8 lentamente. Almacenar los terminadores recocidas a -20 ° C. </li></ol> 3. Montaje de Golden Gate (Standard Mix - Costo Eficiente) <ol><li> Hacer una dilución 40 nM de los terminadores recocidos. Añadir 124 l de agua libre de nucleasa a 1 l de recocido mezcla terminadores (100 M). <ol><li> Centrifugar las muestras durante 30 segundos a 10.000 xg y almacenar en hielo. </li></ol></li><li> Siendo utilizado en un nuevo tubo apropiado para el termociclador, añadir 6 l de agua libre de nucleasa. </li><li> Añadir 1 l de ADN comercial Ligase Buffer [300 mM Tris-HCl (pH 7.7 hasta 7.8), 100 mM MgCl 2 mM, DTT 100 mM, y 10 ATP]. Realizar todos los pasos subsiguientes en el hielo. </li><li> Añadir1 l de PGR-azul (35-50 ng / l) plásmido destino al tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 1 l de los 40 nm terminadores recocidos al tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 0,5 l de endonucleasa de restricción comercial de alta fidelidad BsaI al tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 0,5 l de ADN ligasa comercial al tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar la mezcla de reacción a 10 000 xg durante 120 seg. A continuación, coloque el tubo directamente en el termociclador. </li><li> Ejecutar el programa del termociclador: 20 ciclos de 1 min a 37 ° C, seguido de 1 min a 16 ° C, seguido de 1 ciclo de 15 minutos a 37 ° C. Use muestras inmediatamente o congelación y la conservación a -20 ° C. 8 </li></ol> 4. Asamblea Golden Gate (Master Mix Comercial - Tiempo Eficiente) <ol><li> Añadir 124 l de agua libre de nucleasa a 1 l de los 100 M terminadores creado en el paso 2. Esto diluye la concentración de ADN terminador de 40 nM recocidos.Realice este paso en una nueva, marcada 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> En un nuevo tubo apropiado para el termociclador, añadir 14 l de agua libre de nucleasa. Asegúrese de que el nuevo tubo está etiquetado en consecuencia. </li><li> Añadir 2 l de Tampón Comercial Master Mix al tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 1 l de PGR-azul plásmido (35-50 ng / l) al tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 2 l de los 40 nm terminadores recocidos al tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 1 l de Master Mix Comercial al tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar el tubo de 40 nM a 10.000 xg durante 120 seg. A continuación, coloque el tubo directamente en el termociclador. </li><li> Ejecutar el programa del termociclador: 1 ciclo de 60 minutos a 37 ° C seguido de 1 ciclo de 15 min a 55 ° C. Use muestras inmediatamente o congelación y la conservación a -20 ° C. </li></ol> 5. Transformación y selección de colonias <ol><li> Preparar la base de Luria (LB) placas de Petri que contenían agar concentrat 1 mMion de ampicilina (Amp) y una concentración 10 mM de arabinosa (ARB). Preparar al menos 10 ml de 1 M L solución de reserva -arabinose porque esta solución madre se usará en pasos posteriores. </li><li> Utilizar cualquier de alta eficiencia (10 8 - 10 9 transformantes / mg) E. químicamente competentes coli (JM109) las células para la transformación. 9 Para obtener los mejores resultados, agregue 3-5 l de la reacción de ligación a 50 l de células competentes. Al utilizar células competentes químicos, siga el protocolo de transformación específica a las células que se utilizan. </li><li> Extienda la mitad (25 l) de las células transformadas en LB precalentado (Amp / ARB) placas de agar utilizando un &quot;palo de hockey&quot; en forma de L estéril y se incuba O / N a 37 ° C. Debido a la rápida velocidad de descomposición de la ampicilina, no se incuba a 37 ° C durante 24 hr. </li><li> Realizar selección de colonias basada en el color mediante inspección visual. Una ligadura exitosa debe ser de color blanco / amarillo a la luz visible y fluorescencia verde under azul (450 nm) o la luz UV. Una ligadura sin éxito producirá una colonia que es de color azul bajo luz visible después de 18 - 20 h. </li></ol> 6. Verificación y cuantificación de Terminator <ol><li> Preparar tubos de 5 ml de caldo de LB-ampicilina estériles con 1 mM y 10 mM arabinosa. El número de tubos necesarios depende de la cantidad de terminadores que se están probando más controles (células con resistencia a la ampicilina que no emiten fluorescencia y las células que contienen el plásmido PGR-azul sin cortar). </li><li> Bajo la luz visible recoger 2-3 colonias de color blanco / amarillo (paso 5.4) utilizando un asa estéril. Permitir que las muestras de incubar en caldos en un agitador a 37 ° C y 160 rpm durante 16 a 18 hr. No incubar las muestras durante más de 24 horas. <ol><li> Opcionalmente, utilizar un espectrofotómetro para determinar la densidad celular óptica a 600 nm (OD 600) para asegurar el crecimiento celular adecuado. En general, una DO 600 de ~ 0,8-1,0 se observa después de 16-18 h de crecimiento. </li></ol></li><li> Utilizaruna placa de 96 pocillos estéril para los pasos restantes. Llevar a cabo estos pasos en un ambiente aséptico y por triplicado. Añadir 199 l de caldo estéril LB + Amp / arabinosa (ampicilina 1 mM / arabinosa 10 mM) a cada pocillo. Incluir piezas en la placa por tres controles separados. <ol><li> Utilice los tres controles siguientes: solamente un pozo (1) que contiene el caldo / arabinosa LB + Amp y un pozo (2) para células competentes transformadas (en blanco) para servir como un espacio en blanco. Para la cuantificación (3) de la resistencia de terminación, las células que contienen pGR original, sin cortar o contiene PGR-azul se ligó con una secuencia no de terminación deben ser incluidos (control de referencia para cuantificación). Véase la Figura 1 para el diseño lector de placas. </li></ol></li><li> Pipetear 1 l de la solución de células de la O / N caldos en pocillos individuales de la placa de 96 pocillos. </li><li> placas de sellado con una cubierta transpirable y agitar durante 18-20 horas a 37 ° C y 160 rpm. </li><li> El uso de un lector de placas, determinar OD 600 mediante la lecturala absorbancia a 600 nm. Medir la fluorescencia de GFP de la siguiente manera: 395 de excitación y emisión de fluorescencia de RFP 509. Medida de la siguiente manera: 575 de excitación y emisión 605. Después de 18-20 horas, el OD 600 debe ser de aproximadamente 0,5. </li><li> Para normalizar la variación en el crecimiento, utilizar la ecuación: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq1.jpg" /> tanto para GFP y RFP. </li><li> Después de la normalización, determinar la resistencia de terminación relativa usando la ecuación <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq2.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Li, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+promoter+sequence+and+its+strength+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+biology+undergraduate+education%2C+a+call+for+action--initial+responses%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses.</a> CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).</li>
<li>Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+the+biology+community%3A+snapshots+of+change%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in the biology community: snapshots of change.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).</li>
<li>Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARNold%3A+a+web+tool+for+the+prediction+of+Rho-independent+transcription+terminators%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators.</a> RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).</li>
<li>Campbell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pClone%3A+Synthetic+Biology+Tool+Makes+Promoter+Research+Accessible+to+Beginning+Biology+Students%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).</li>
<li>Rhee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+medium+composition+and+plasmid+combination+on+the+growth+of+recombinant+Escherichia+coli+JM109+and+on+the+production+of+the+fusion+protein+EcoRI%3A%3ASPA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA.</a> J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).</li>
<li>Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+mutations+in+the+Escherichia+coli+AraC+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein.</a> J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).</li>
<li>Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+L-arabinose+operon+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli.</a> Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composability+of+regulatory+sequences+controlling+transcription+and+translation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).</li>
<li>Sharon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+gene+regulatory+logic+from+high-throughput+measurements+of+thousands+of+systematically+designed+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters.</a> Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El paso más importante en este protocolo es adecuado diseño de oligonucleótidos antes de ordenar. Los oligonucleótidos deben tener los extremos cohesivos apropiados añadidos a los extremos 5 &#39;de la parte superior e hilos de fondo para asegurar que GGA incorporación es posible. Además, es importante para cambiar la orientación de los interruptores de frente a la izquierda (Terminator que impiden la transcripción de la cadena inferior) a la de la derecha frente (termina la transcripción en la cadena superior) terminad...

Los grandes proyectos de biología sintética necesitan el uso de terminadores de transcripción altamente efectivos para ayudar a regular la expresión génica. La identificación de nuevos terminadores requiere el análisis bioinformático de nuevos genomas. Sin embargo, a medida que se desarrollan cantidades cada vez mayores de software bioinformático, cada uno con un algoritmo único utilizado para la predicción, se producen más discrepancias entre los resultados putativos. Debido a que este proceso es algo subjetivo y se realiza in silico, estas predicciones necesitan confirmación biológica. 1 Además, el volumen de terminadores putativos identificados a través del análisis in silico requiere el uso de estrategias de clonación que pueden completarse en un período de tiempo relativamente corto. 
El plásmido PGR-Blue es una modificación del plásmido PGR que ha sido rediseñado para utilizar el Ensamblaje Golden Gate (GGA) para simplificar el procedimiento de clonación al permitir que todos los pasos de reacción se realicen simultáneamente en un tubo de microcentrífuga. 2,3 La selección de color se incorporó en el plásmido para aumentar la facilidad de identificación de colonias positivas. Una ligadura exitosa debe ser de color blanco/amarillo con luz visible y verde fluorescente bajo luz azul (450 nm) o ultravioleta (UV) cuando se cultiva en placas que contienen arabinosa. Debido a que el pGR-azul sin cortar contiene una proteína cromosómica azul (amilCP), las colonias que contienen un plásmido no modificado son azules bajo la luz visible. Esta simplificación, junto con el protocolo simplificado, permite a los investigadores pasar de la identificación bioinformática a la confirmación biológica en tres o cuatro días. La naturaleza del diseño de este sistema puede ser beneficiosa tanto en el laboratorio de investigación como en entornos educativos.
El plásmido pGR-Blue permite cuantificar la fuerza del terminador. 4 Se utiliza un único promotor inducible de arabinosa para producir proteína verde fluorescente (GFP) y proteína roja fluorescente (RFP). El terminador se clona en el plásmido después de la secuencia GFP pero antes de la secuencia RFP, deteniendo así la transcripción de la proteína RFP. La resistencia del terminador está determinada por la relación entre GFP producido y RFP producido. 
El informe Visión y Cambio5 sugirió que la educación en Ciencia, Tecnología, Ingeniería y Matemáticas (STEM, por sus siglas en inglés) incorpore experiencias basadas en la investigación en el aula. 6 Sin embargo, esto requiere el desarrollo de protocolos que puedan ser realizados por estudiantes con habilidades limitadas en un período de tiempo definido. Si bien el protocolo se puede lograr en tan solo tres días, también se diseñó para que cada paso principal se pudiera realizar en un período de laboratorio semanal (2-3 horas) separado para crear una Experiencia de Investigación del Curso (CRE). Cuando se utiliza de esta manera, el procedimiento durará entre tres y seis semanas y es apropiado tanto para cursos introductorios como avanzados en Genética, Biología Celular o Bioinformática.

<table><tbody><tr><td>pGR-Plásmido azul</td><td>Addgene</td><td>68374</td><td></td></tr><tr><td>pGR-Plásmido</td><td>Addgene</td><td>46002</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal-(Hojas estériles)</td><td>Excel Scientific</td><td>BS-25</td><td>Hojas estériles solo</td></tr><tr><td>10x Tampón de ADN ligasa T4</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>La enzima no HF funcionará pero es menos estable al calor.</td></tr><tr><td>NEB Golden Gate Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E1600S</td><td>Commerial Master Mix al que se hace referencia en el protocolo.</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga redonda Bastidor flotante</td><td>Nova Tech International</td><td>F18875-6401</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sal sódica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-3256</td><td>D-Arabinose no inducirá el promotor pBAD</td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Caldo, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1900</td><td></td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Agar, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2025</td><td></td></tr><tr><td>Tecan-Infinite M200 Lector de Placas</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix & Ir a las células competentes - Cepa JM109</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td>Utilice el protocolo de transformación recomendado por la empresa</td></tr><tr><td>ApE: Un software editor de plásmidos http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tris-HCl, Grado Molecular</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (cristalino/biológico, certificado)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671</td><td></td></tr><tr><td>Síntesis de oligonucleótidos</td> Tecnologías integradas de <td>ADN (IDT)</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site</td></tr><tr><td>Microtest Placas de cultivo de tejidos - 96 pocillos (estériles)</td><td>Falcon</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>micobacteriófago "Bernal13"</td><td>Banco de germoplasma</td><td>KJ510413</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasa Libre</td><td>de agua Tecnologías de ADN integradas (IDT)</td><td>IDT004</td><td></td></tr><tr><td>Estéril, en forma de L Espectrómetro UV-Vis Hockey-Stick Cell</td> Life <td>Science Products</td><td>6444-S1</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop 2000c UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>ARNold: una herramienta web para la predicción de terminadores de transcripción independientes de Rho.</td><td></td><td></td><td></td>http://rna.igmors.u-psud.fr/</tr></tbody></table>

verificación rápida de terminators uso de la pgr-blue plásmido y montaje de puerta de oro

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

El objetivo de este protocolo es permitir la verificación rápida de terminadores identificados bioinformáticamente. Además, el plásmido (pGR-Blue) está diseñado específicamente para este protocolo y permite cuantificar la eficiencia del terminador. Como prueba de concepto, se identificaron bioinformáticamente seis terminadores en el micobacteriófago Bernal13. Una vez identificados, los terminadores se convirtieron en oligonucleótidos con los extremos pegajosos apropiados y se recocieron juntos. Usando Golden Gate Assembly (GGA), los terminadores se clonaron en pGR-Blue. Bajo luz visible, las colonias de falsos positivos aparecen de color azul y las colonias transformadas positivamente son de color blanco/amarillo. Después de la inducción de un promotor inducible de arabinosa (pBad) con arabinosa, la fuerza de la colonia se puede determinar midiendo la proporción de proteína verde fluorescente (GFP) producida y proteína fluorescente roja (RFP) producida. Con pGR-Blue, el protocolo se puede completar en tan solo tres días y es ideal en un entorno educativo. Además, los resultados muestran que este protocolo es útil como medio para comprender in silico las predicciones de la eficiencia del terminador relacionadas con la regulación de la transcripción.

Este protocolo va a producir células que contienen PGR-azul con un terminador ligaron entre GFP y RFP usando oro conjunto de corredera (Figura 2). Las colonias positivas que contienen inserto se ligó se pueden seleccionar sobre la base de color. En luz visible colonias positivas serán de color blanco / amarillo y falsos positivos producirán colonias azules después de 18-20 horas de incubación a 37 ° C (Figura 3). <p class="jove_content" fo:keep-toget...

Este protocolo utiliza Golden Gate Assembly y el plásmido pGR-blue para cuantificar rápidamente la fuerza de los terminadores encontrados in silico.

Verificación rápida de Terminators Uso de la PGR-Blue plásmido y montaje de puerta de oro

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

El objetivo general del protocolo de biología sintética es determinar rápidamente la funcionalidad del terminador y cuantificar la fuerza del terminador en un sistema in vitro que utiliza la ensambladura tipo Golden Gate. Este protocolo se emplea para probar los terminadores que identificamos in silico mediante bioinformática y evaluarlos en un entorno biológico. Esto permite una confirmación rápida y sencilla de los terminadores identificados bioinformáticamente en un entorno de laboratorio.La principal ventaja de este protocolo es su rapidez. Podemos pasar de la identificación bioinformática a la confirmación biológica en menos de una semana. Y al hacerlo, también podemos verificar que un terminador es efectivamente un terminador y podemos cuantificar su fuerza de terminación.Por lo general, las personas tendrán dificultades iniciales con esta técnica, ya que parece contraintuitivo añadir la enzima de restricción junto con la ligasa en el mismo tubo. Sin embargo, utilizamos endonucleasas de restricción tipo 2S, y el sitio de reconocimiento para la enzima está separado del sitio de corte real. Una vez que el terminador se liga al plásmido pGR blue, esta ligación es permanente.Sin embargo, al tener la enzima de restricción y la ligasa en el mismo tubo y someterlas a múltiples ciclos, podemos lograr una alta eficiencia de clonación. Comience este procedimiento rehidratando los oligonucleótidos individuales en agua libre de nucleasas a una concentración de 100 micromolar y luego prepare el tampón de hibridación 10x. A continuación, etiquete un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros para cada terminador que se vaya a probar.A cada tubo, añada 16 microlitros de agua ultrapura, 2 microlitros de tampón de hibridación 10x y 1 microlitro de cada uno de los oligonucleótidos de cadena superior e inferior de los terminadores deseados. Es muy importante asegurarse de que los oligonucleótidos encargados tengan los extremos pegajosos correctos. Porque una vez que se hibriden, es fundamental garantizar que el terminal esté en la orientación correcta.Si el terminador está en la orientación incorrecta, pGR blue no podrá verificar si se trata de un terminador funcional. A continuación, coloque los tubos de microcentrífuga en un flotador y hiérvalos durante cuatro minutos en un baño de agua. Después de cuatro minutos, apague la placa calefactora pero deje el tubo en el agua durante la noche para que se enfríe lentamente.Almacene los terminadores recocidos a 20 grados Celsius. Para preparar una dilución de 40 nanomoles por litro de los terminadores recocidos, primero descongele estos sobre hielo y luego, en un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, añada 124 microlitros de agua libre de nucleasas a 1 microlitro de los terminadores recocidos. Centrifugue las muestras durante 30 segundos a 10.000 × g.Después de la centrifugación, almacene las muestras en hielo. En un tubo nuevo adecuado para termociclador, agregue 6 microlitros de agua libre de nucleasas. Luego agregue un microlitro de tampón comercial para ADN ligasa.Realice todos los pasos siguientes sobre hielo. A continuación, agregue 1 microlitro que contenga de 35 a 50 nanogramos por microlitro del plásmido de destino pGR blue, 1 microlitro de los terminadores emparejados de 40 nanomolares, 0,5 microlitros de enzima de restricción BSA1 de alta fidelidad comercial y 0,5 microlitros de ligasa de ADN comercial. Centrifugue la mezcla de reacción a 10,000x g durante 120 segundos.Luego, coloque el tubo directamente en el termociclador y ejecute el siguiente programa: 20 ciclos de 1 minuto a 37 grados Celsius, seguidos de 1 minuto a 16 grados Celsius y luego un ciclo de 15 minutos a 37 grados Celsius. Después de la corrida, congele y almacene las muestras a 20 grados Celsius o proceda inmediatamente a la transformación.Transforme las reacciones de ligación en células de E. coli competentes químicamente utilizando cualquier protocolo de transformación adecuado. Aquí, las células JM109 se transforman utilizando la transformación zippy.Utilizando una varilla de vidrio en forma de L, distribuya 25 microlitros de las células transformadas sobre placas de agar LB precalentadas que contengan 1 milimolar de ampicilina y 10 milimolares de arabinosa. Incube las placas durante la noche a 37 grados Celsius. No las incube por más de 24 horas.La ampicilina se degrada rápidamente. Al día siguiente, inspeccione el color de las colonias. Una ligación exitosa debe ser blanca o amarilla a la luz visible y fluorescerá en verde bajo luz azul o UV.Una ligación fallida producirá una colonia de color azul a la luz visible. Para cada uno de los terminadores y controles, prepare un tubo de ensayo que contenga 5 mililitros de caldo LB estéril con 1 milimolar de ampicilina y 10 milimolar de arabinosa. Al realizar este protocolo, con pGR es muy importante asegurarse de que los controles adecuados estén en su lugar.El primer control debe ser solo caldo LB. El siguiente control debe ser células que tengan resistencia a la ampicilina, pero que no fluoreszcan bajo luz azul. Estas servirán como blanco.El siguiente control es un plásmido pGR que no ha sido cortado, por lo que no tiene un terminador insertado, y servirá como línea base para la intensidad del terminador. El último de sus tubos será para su muestra. Bajo luz visible, utilice un asa estéril para seleccionar 2 a 3 colonias blancas o amarillas y transfiéralas al caldo LB. Incube las muestras en agitación a 37 grados Celsius y 160 rpm durante 16 a 18 horas.Al día siguiente, utilice un espectrofotómetro para determinar la densidad óptica celular de cada muestra a 600 nanómetros. Por lo general, después de este período de tiempo, se espera una DO600 de 0,8 a 1,0. Coloque una placa estéril de 96 pocillos en la cabina de flujo laminar.Para cada muestra o control, prepare 3 pocillos con 199 microlitros de caldo LB estéril con ampicilina y arabinosa. A continuación, pipetee 1 microlitro de la solución celular de los caldos nocturnos en pocillos individuales de la placa de 96 pocillos. Cubra las placas con una tapa permeable al aire y agítelas durante 18 a 20 horas a 37 grados Celsius y 160 rpm.Al día siguiente, utilice un lector de placas para determinar la DO 600, que debería ser aproximadamente 0,5. Asimismo, mida la fluorescencia de GFP a una longitud de onda de excitación de 395 nanómetros y una emisión de 509 nanómetros. Mida la fluorescencia de RFP a una longitud de onda de excitación de 575 nanómetros y una emisión de 605 nanómetros.Utilizando Excel, normalice la variación en el crecimiento dividiendo la fluorescencia por la DO a 600. Después de la normalización, determine la intensidad relativa del terminador tomando la fluorescencia del terminador GFP dividida por la fluorescencia de control GFP y dividiéndola por la fluorescencia del terminador RFP dividida por la fluorescencia de control RFP. Se analizaron los terminadores putativos T1 a T6 identificados bioinformáticamente en el fago de microbacterias bernal 13, tal como se describe en este video.Estos resultados muestran la fluorescencia relativa. Todos los resultados se normalizaron utilizando células que contenían PGR sin cortar y sin modificar como control. Se encontró que T3 es un terminador fuerte.Todos los resultados representan colonias individuales cultivadas por triplicado y promediadas para su representación visual. Las barras de error representan las desviaciones entre los puntos de datos promediados. Para determinar el mejor control de referencia para cuantificar la fuerza del terminador, se compararon los datos brutos utilizando el plásmido pGR original que no contiene terminador, y el pGR azul clonado con una secuencia conocida por no ser un terminador.Como se puede observar aquí, ambos controles mostraron niveles similares de expresión de GFP y RFP y, más importante aún, produjeron relaciones similares de GFP a RFP. Todos estos resultados representan colonias individuales que se cultivaron por triplicado y se promediaron para la representación visual. Una vez dominada, esta técnica puede llevar tan solo 72 horas, incluyendo el tiempo de envío y pedido.Es importante tener en cuenta que pGR azul solo funciona en e.coli. Además, dado que solo estamos analizando un fragmento pequeño del terminador, en realidad no tenemos idea de otros elementos reguladores que podrían controlar la transcripción. Para verificar los resultados obtenidos con este protocolo utilizando pGR azul, se pueden emplear métodos adicionales como la PCR cuantitativa.Además, el inserto pGR puede ser cortado y ligado en un plásmido de su elección.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Nucleasas de diseñadores como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se pueden utilizar para modificar el genoma de preimplantación de embriones de ratones mediante la activación de ambos al final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) itinerarios. Estos avances permiten la rápida generación de ratones con modificaciones genéticas precisas.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

La síntesis de plásmidos personalizados requiere trabajo y tiempo. Este protocolo describe el uso de la clonación de ensamblaje de Gibson para reducir el trabajo y la duración del procedimiento de clonación de ADN personalizado. El protocolo descrito también produce construcciones de proteínas marcadas confiables para la expresión en mamíferos a un costo similar al de la clonación tradicional de ADN de cortar y pegar.

Generación de plásmidos vectores que expresan proteínas de la bandera de etiquetado bajo la regulación del promotor factor de elongación humano-1α Usando Asamblea Gibson

Este protocolo describe un método para derivar puertas de desplazamiento de cadenas de ADN a partir de plásmidos y probarlas utilizando mediciones de cinética de fluorescencia. Las puertas se pueden componer modularmente en sistemas de múltiples componentes para aproximar el comportamiento de las redes formales de reacción química (CRN), lo que demuestra un nuevo uso para las CRN como lenguaje de programación molecular.

Plásmido derivado de ADN Strand Displacement Puertas de Redes de reacción de Ejecución Química

Se presenta un protocolo para la evaluación funcional de amplias bibliotecas de saturación de un solo sitio de mutagénesis de proteínas utilizando secuenciación de alto rendimiento. Es importante destacar que este enfoque utiliza pares de cebadores para multiplexar ortogonales construcción de la biblioteca y secuenciación. Se proporcionan resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamasa seleccionado en una dosis clínicamente relevante de ampicilina.

Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento

Aquí, presentamos un protocolo para eliminar un gen de interés involucrado en la conjugación de plásmidos y posteriormente analizamos el impacto de su ausencia utilizando ensayos de apareamiento. La función del gen se explora más a fondo en una región específica de su secuencia mediante deleción o mutaciones puntuales.

Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana

Métodos para la generación de bibliotecas de gRNA a gran escala deben ser simple, eficiente y rentable. Se describe un protocolo para la producción de bibliotecas de gRNA basado en la digestión enzimática del ADN diana. Este método, CORALINA (gRNA integral generación de biblioteca a través de la actividad de nucleasa controlados) presenta una alternativa a la síntesis de oligonucleótidos de encargo costosos.

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Aquí, presentamos un protocolo que describe cómo i) ensamblar un vector autorreplicante usando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate, ii) introducir el vector en un host cianobacteriano por conjugación, y iii) caracterizar las cepas de cianobacterias transgénicas usando un lector de placas o citometría de flujo.

Modificación genética de las cianobacterias por conjugación utilizando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada paso a paso para el montaje de construcciones multigénicos utilizando el sistema de clonación modular basado en la clonación Golden Gate. También ofrece recomendaciones sobre pasos críticos para garantizar un montaje óptimo basado en nuestras experiencias.

Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate

Los sistemas CRISPR-Cas y las proteínas anti-CRISPR se integraron en el esquema de puertas booleanas en Saccharomyces cerevisiae. Los nuevos circuitos lógicos pequeños mostraron un buen rendimiento y profundizaron la comprensión de los factores de transcripción basados en dCas9 / dCas12a y las propiedades de las proteínas anti-CRISPR.

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Aprende a verificar terminadores mediante ensamblaje Golden Gate y plásmido pGR-Blue. Este protocolo permite cuantificar su fuerza en menos de una semana, acelerando la validación experimental en biología sintética.

Verificación rápida de Terminators Uso de la PGR-Blue plásmido y montaje de puerta de oro

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