ADN-ARN simultánea extracción de los sedimentos costeros y cuantificación de 16S rRNA genes y las transcripciones de PCR en tiempo real

El objetivo general de este procedimiento es extraer ADN y ARN de alto rendimiento y calidad de los sedimentos marinos costeros y, posteriormente, cuantificar los genes y transcripciones del ARN ribosómico 16S. Este método, que describe la extracción de ADN y ARN de sedimentos marinos seguida de PCR cuantitativa, es un paso clave en el análisis molecular de la abundancia y diversidad microbiana en el medio ambiente. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para coextraer ADN y ARN de la misma muestra, que luego se pueden utilizar para análisis posteriores, como la PCR cuantitativa.

El Dr. Enrico Tatti, de la Universidad Nacional de Nueva York, Galway, y Duncan Sweeney, estudiante de doctorado de la Universidad de Essex, harán una demostración del procedimiento. Para coextraer ADN y ARN de los sedimentos costeros después de preparar materiales libres de ARN y recolectar muestras de sedimentos costeros de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera 0,5 gramos de sedimento a un tubo de lisado de perlas de dos mililitros. Añadir 500 microlitros de tampón de fosfato CTAB y 500 microlitros de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico al tubo e invertir de cinco a 10 veces para homogeneizar la muestra.

Vórtice a toda velocidad durante 2,5 minutos antes de girar a 16.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, en una campana extractiva, extraiga la capa acuosa superior y transfiérala a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. A continuación, coloque las muestras en hielo y agregue 500 microlitros de cloroformo: alcohol isoamílico helado.

A continuación, invierta el tubo varias veces hasta que se vea una emulsión y centrifugar como antes. En una campana extractiva, extraiga la capa acuosa superior y colóquela en un nuevo tubo estéril de 1,5 mililitros. Luego, para precipitar los ácidos nucleicos, agregue dos volúmenes de solución de cloruro de sodio al 30% PEG y mezcle bien.

Incubar en hielo durante dos horas, o dejar las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, centrifugar las muestras a 16.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Con una micropipeta, retire suavemente el sobrenadante, asegurándose de no tocar el pellet.

Deje aproximadamente 10 microlitros de solución de PEG en el tubo y agregue un mililitro de etanol al 70% helado. Después de girar la muestra, use una micropipeta para eliminar lentamente el etanol, teniendo cuidado de no tocar el pellet. A continuación, centrifugar durante cinco segundos y eliminar el etanol residual.

Deje que el pellet se seque al aire durante cinco minutos antes de usar 50 microlitros de agua tratada con DEPC para volver a suspenderlo. Alícuota una muestra de 15 microlitros para ADN y 30 microlitros para ARN. El paso más crítico es asegurarse de que la pelletza de ADN/ARN no se desprenda mientras se elimina el sobrenadante y que no quede etanol residual antes de volver a suspender la pellet en agua, ya que inhibe la reacción molecular posterior.

Para digerir el ADN en la muestra de ARN, agregue tres microlitros de tampón de DNasa I y 1,5 microlitros de DNasa I a la alícuota de ácido nucleico de 30 microlitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Mezcle el reactivo de inactivación de DNasa mediante vórtice durante 30 segundos.

A continuación, añada 4,8 microlitros de la solución a la muestra e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos, golpeando ocasionalmente el fondo de los tubos para mezclar la solución. Después de girar la muestra, transfiera el sobrenadante que contiene ARN a un nuevo tubo, teniendo cuidado de no transferir el precipitante. Para comprobar la calidad del ARN, diluya dos microlitros de ARN, uno de cada 10, añadiendo 18 microlitros de agua desionizada estéril sin ARNasa.

En reacciones de PCR separadas, agregue un microlitro de dilución pura o una dilución de 10 en 10 de ARN a un tubo de PCR estéril de 0,5 mililitros. Siguiendo la tabla del protocolo de texto, agregue los componentes de la reacción de PCR para amplificar el gen de ARN ribosómico 16S. Incluye un control positivo, un control de inhibidor de PCR y un control negativo.

A continuación, ejecute las reacciones de PCR utilizando los siguientes parámetros de amplificación. Para generar ADNc de primera cadena a partir de ARN, agregue los reactivos de reacción a un tubo de PCR de 0,2 mililitros de acuerdo con el protocolo de texto. Incubar las muestras a 65 grados centígrados durante cinco minutos.

A continuación, coloque las muestras en hielo durante al menos un minuto antes de incubarlas a 25 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, agregue los reactivos en la tabla que se muestra aquí del protocolo de texto e incube a 55 grados centígrados durante 50 minutos. A continuación, inactive la reacción a 72 grados centígrados durante 10 minutos.

Después de generar estándares de ADN y ARN para qPCR de acuerdo con el protocolo de texto, descongele las muestras ambientales de ADN y ADNc, los estándares y los reactivos de qPCR en hielo. Diluya los patrones de ácido nucleico y prepare una de cada 10 diluciones del ADN ambiental y el ADNc desde puro hasta 10 hasta menos tres. Haga una mezcla maestra para el número total de reacciones más el 10% y mezcle bien.

Agregue 19 microlitros de mezcla maestra y un microlitro de plantilla por triplicado a cada pocillo en una placa qPCR óptica de 96 pocillos. Utilice una cubierta óptica qPCR para cubrir la placa. A continuación, centrifugar brevemente la placa y cargarla en el bloque calefactor de la máquina qPCR.

A continuación, abra el software de administración de qPCR, luego haga clic en la pestaña Protocolo, haga clic en Crear nuevo y agregue las siguientes condiciones de amplificación. Establezca el volumen de la muestra en 20 microlitros, haga clic en Aceptar y guarde el protocolo. Ahora elija la pestaña Placa.

A continuación, en Editar seleccionados, haga clic en Seleccionar fluoróforo. Agregue el tinte reportero para la sonda adecuada y haga clic en Aceptar. Resalte los pocillos que contengan los estándares y, a continuación, en el menú Tipo de muestra, seleccione Estándar. Elija Replicar serie para cambiar el Tamaño de replicación a tres y haga clic en Aplicar.

Elija Serie de dilución para agregar la concentración inicial calculada para la estándar. Indique el factor de dilución de 10, seleccione Disminuyendo o Aumentando según el orden en que se agregó la curva estándar a la placa y haga clic en Aplicar. Resalte las posiciones de los pocillos que contienen las muestras desconocidas y seleccione Desconocido en el menú desplegable Tipo de muestra.

Elija Replicar serie, cambie "Tamaño de réplica" a tres y, a continuación, haga clic en Aplicar. En Nombre de muestra, edite los nombres de muestra y repita el procedimiento para los pozos de control sin plantilla. A continuación, en el cuadro del editor de placas, haga clic en Aceptar y guarde el archivo.

A continuación, haga clic en Iniciar ejecución. Una vez finalizada la ejecución, elija la pestaña Cuantificación para mostrar la curva estándar, los descriptores de curva estándar y las gráficas de amplificación. Por último, elija la pestaña Datos de cuantificación para los valores de Cp y la cantidad inicial correspondiente para los genes de muestras desconocidas.

Determine el número de copias de genes por gramo de sedimento de peso húmedo de acuerdo con el protocolo de texto. Como se muestra en esta imagen de gel, una extracción exitosa de ácido nucleico produce bandas claras de ADN y ARN donde las bandas agudas de ARN ribosómico 23S y 16S son visibles, además de la presencia de una banda de ADN genómico de alto peso molecular. Esta figura demuestra que cuando se prepara y amplifica correctamente un rango de dilución de diez veces para generar una curva estándar que se utilizará para la reacción de qPCR, se observa una diferencia de ciclo de 3,3 entre cada dilución estándar.

Es importante notificar el punto de cruce, o los valores de Cp, desde el control sin plantilla, o NTC, si está presente. Si esto ocurre, se impone un punto de corte de Cp para muestras estándar y desconocidas de 3,3 ciclos o un pliegue logarítmico superior al valor de Cp del NTC como se ha descrito anteriormente. Aquí, se llevó a cabo la amplificación de la muestra ambiental de diluciones puras, 10 a menos uno, 10 a menos dos y 10 a menos tres.

La muestra limpia no se amplificó y los valores de Cp de 10 a menos uno a 10 a menos tres diluciones fueron de 24,12, 26,02 y 28,40 respectivamente. Como se ve en este gráfico, se desean descriptores de curva estándar, incluidos los valores de R cuadrado de 0,99 y eficiencias de PCR dentro del rango de 90 a 110%. En este experimento, el Cp NTC fue de 30,5 y se impuso un punto de corte Cp negativo de 27,2.

La conversión de las abundancias de genes a por gramo de sedimento de peso húmedo dio como resultado 2,5 veces 10 para la séptima y 7,1 veces 10 para la séptima para las diluciones de 10 a menos uno y 10 a menos dos, respectivamente. El Cp de dilución de 10 a menos tres fue mayor que el punto de corte NTC. En este caso, se seleccionó el 10 elevado a menos dos como la dilución óptima de la plantilla.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el ARN puede degradarse rápidamente, por lo tanto, es importante mantener la muestra en hielo y usar guantes para evitar la contaminación con ARNasa todo el tiempo. No olvide que estamos trabajando con fenol:cloroformo y alcohol isamílico, y eso puede ser extremadamente peligroso. Y siempre se deben tomar precauciones como usar bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras y trabajar bajo una capucha química mientras se realiza este procedimiento.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer ADN y ARN y cuantificar la abundancia de genes y transcripciones en los sedimentos costeros marinos. Recuerde que este procedimiento se puede utilizar fácilmente para extraer ADN y ARN y para cuantificar una serie de objetivos genéticos de la mayoría de las muestras ambientales, incluido el suelo.