El rápido escaneo de electrones resonancia paramagnética abre nuevas vías para Imaging fisiológicamente parámetros importantes En Vivo

El objetivo general de las imágenes paramagnéticas de electrones de barrido rápido, o RSEPRI, es proporcionar información cuantitativa sobre la concentración de oxígeno, el pH, el estado redox y la concentración de moléculas de señalización que sean útiles para la investigación biomédica. EPRI es una herramienta que se puede utilizar para responder preguntas clave en la investigación del cáncer con respecto al entorno tumoral. La principal ventaja de las imágenes EPR de escaneo rápido es que puede adquirir más información en un tiempo mucho más rápido, con una variedad más amplia de moléculas de sonda en comparación con las imágenes EPR de onda continua o CW.

Las moléculas que son sensibles al estado redox o al pH son un buen ejemplo de dónde brilla realmente el EPRI de escaneo rápido. Comience este procedimiento con el cálculo de las condiciones experimentales de escaneo rápido según lo determinado en el protocolo de texto. Una pieza importante del escaneo rápido es comprender la dependencia de la señal del ancho de banda del resonador y las condiciones experimentales, como el ancho de barrido de frecuencia de escaneo.

Para optimizar realmente el experimento, es necesario entender los tres. El controlador de bobina de escaneo rápido tiene dos amplificadores. Al seleccionar un condensador, la caja del condensador debe estar equilibrada con una capacitancia igual a cada lado de la caja.

Los dos lados están en serie. Desenrosque la cubierta superior de la caja de condensadores e inserte condensadores en ambos lados que sean iguales al valor determinado. Vuelva a colocar la parte superior de la caja de condensadores y atorníllela para asegurarse de que permanezca encendida.

Usando el panel frontal del controlador de bobina resonada, ajuste la frecuencia de salida hasta que la forma de onda sinusoidal tenga la amplitud máxima. Para preparar los radicales, retire el N-15 PDT del congelador y deje que el recipiente alcance la temperatura ambiente. Pesa 1,4 miligramos de N-15 PDT utilizando una balanza analítica.

Agregue 1.4 miligramos de N-15 PDT a 15 mililitros de agua desionizada para una concentración final de 0.5 milimolar. A continuación, combine 50 miligramos de BMPO con cinco mililitros de agua en un tubo de irradiación de cuarzo de 16 milímetros. Agrega 100 microlitros de peróxido de hidrógeno de 300 milimolares.

Irradie la mezcla en el tubo de irradiación de cuarzo de 16 milímetros con una lámpara ultravioleta de presión media de 450 vatios durante cinco minutos. Con una pipeta de transferencia de vidrio, transfiera dos coma cinco mililitros de la solución de BMPO-OH irradiada fuera del tubo de irradiación de cuarzo y dentro de un lado de un tubo de muestra de cuarzo de 16 milímetros con un divisor de tres milímetros. Transfiera los dos coma cinco mililitros restantes de BMPO-OH irradiado al otro lado del tubo de muestra de cuarzo con el divisor.

Un segundo paso crítico es comprender la curva de saturación de potencia. A medida que aumenta la velocidad de escaneo, se accede a potencias más altas y amplitudes de señal más grandes antes de que la señal se sature. Las amplitudes de señal más grandes son otra forma de disminuir el tiempo de adquisición.

En primer lugar, ajuste el resonador con una muestra acuosa del radical nitrógeno insertando la muestra de 15 mililitros de 0,5 milimolares N-15 PDT en agua en un tubo de resonancia paramagnética de electrones de cuarzo de 16 milímetros. Inserte el tubo de cuarzo en el lado de detección de la resonancia paramagnética de electrones de escaneo rápido de bucle cruzado o del resonador RSEPR. Cambie la frecuencia de la fuente del instrumento hasta que coincida con la frecuencia del lado de detección que contiene la muestra.

Ahora, cambie la frecuencia del lado de excitación para que coincida con las frecuencias de la fuente del experimento y el lado de detección del resonador. Cambie la frecuencia del lado de excitación girando un condensador variable dentro de la cavidad del resonador. Para configurar la consola de instrumentos y el imán principal, encienda el espectrómetro y elija un experimento que registre datos transitorios con tiempo en la abscisa.

Realice una curva de saturación de potencia en una muestra de radical de nitrógeno estándar en las mismas condiciones experimentales que se utilizarán para observar radicales sensibles al pH o al estado redox. Una vez que se configura el sistema, los gradientes se aplican manualmente o a través de un programa informático para el experimento de imágenes. La intensidad de la señal EPR es directamente proporcional al campo de microondas en el resonador que hace que el espín pase de un nivel de energía al siguiente.

Este campo de microondas se denomina B1. B1 es proporcional a la raíz cuadrada de la potencia de microondas. A medida que la potencia de microondas se cuadruplica, B1 se duplica. En esta cifra, la potencia se cuadruplica de ocho a 32 milivatios, y B1 se duplica de 18 a 36 miliGauss.

Se puede construir una curva de saturación de potencia trazando la amplitud relativa en función de la raíz cuadrada de la potencia de microondas, o si se conoce la eficiencia del resonador, B1. La región de esta curva que es lineal muestra la región de potencia en la que la señal EPR no está saturada ni distorsionada. Una de las ventajas de un experimento de barrido rápido es que el rango de potencia lineal se amplía, representado por los puntos de colores, en comparación con el experimento de CW normal representado por los puntos negros. Aquí se muestra una imagen espacial espectral bidimensional de maniquíes que consiste en un aducto BMPO-OH separado por tres milímetros a una concentración de cinco micromolares.

Un corte a través de la imagen muestra la forma espectral a 250 megahercios. Esta imagen muestra el radical nitranilo N-14 que se puede utilizar para atrapar óxido nítrico in vivo en un maniquí, donde una pared de un punto cinco milímetros de espesor separa dos cámaras de muestra. Aquí se muestra la forma espectral a 250 megahercios.

La imagen bidimensional de los radicales triarilmetilo sensibles al pH refleja la diferencia en las características espectrales cuando el pH del tampón de fosfato es igual a siete punto cero, o el pH es igual a siete punto cuatro. Esta imagen muestra dinitroóxido de N-15 en un maniquí de dos compartimentos con un espaciador de 10 milímetros. Inicialmente, ambos compartimentos contienen una sonda de 0,5 milimolares.

La adición de glutatión al dinitroóxido rompe la región enlazadora reducida y produce dos mononitroóxidos, un cambio que se refleja en la imagen bidimensional. El desarrollo de la EPR de barrido rápido es un cambio total de paradigma en nuestra capacidad para estudiar moléculas con electrones desapareados. Hoy se ha visto su aplicación a la RAP in vivo, pero también tiene maravillosas posibilidades para estudios a baja temperatura de compuestos con metales en ellos, y muchos otros tipos de sistemas.

Para todas las muestras que hemos estudiado hasta ahora, hemos obtenido mejoras en la relación señal-ruido de al menos un orden de magnitud y, a veces, incluso más.