Name: Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a visualizar el cebado de neutrófilos en ratones vivos mediante reporteros fluorescentes e imagen intravital. Este método combina técnicas avanzadas para estudiar respuestas inmunitarias en modelos de enfermedades raras.

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Los autores no tienen agradecimientos.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Toledo. 1. Fenotipificación de pIL1-DsRed ratones NOTA: Offspring son generadas por la cría de los ratones heterocigotos pIL1-DsRed con los ratones de tipo salvaje (WT) C57BL6. Tres a cuatro semanas de edad cachorros se consideran listo para el fenotipado. Sangrado submandibular de ratones sigue un protocolo establecido, con modificaciones menores 23. <ol><li> El aislamiento de los glóbulos blancos de la sangre entera de los perritos mouse <ol><li> Añadir 20 l de heparina a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adquirir un cachorro de la jaula. Grabe la etiqueta de identificación del cachorro. No es necesario para anestesiar a las crías antes de la recogida de sangre de la vena submandibular. </li><li> Mantenga las crías por pescuezo cuello y perforar la vena submandibular en THbolsa de la mejilla de correo utilizando una lanceta de 5 mm. Aplicar una fuerza adecuada para crear una pequeña punción, de modo que exudan gotas de sangre desde el punto de penetración. Use una aguja nueva para cada cachorro. </li><li> Recoge 3 - 5 gotas de sangre por cada cachorro en un tubo de microcentrífuga que contiene heparina. Limpiar el sitio de la punción y aplicar presión para facilitar la hemostasia. </li><li> Ponga las crías en una nueva jaula y observar durante 30 minutos antes de volver a la jaula para la instalación de animales. </li><li> Recoger la sangre de ratones adultos de un fenotipo conocido como controles positivos y negativos. </li><li> Añadir 500 l de tampón de lisis de glóbulos rojos a cada tubo, los tubos de vórtice, y se incuba durante 5 a 10 min en hielo. </li><li> Añadir lentamente 400 - 500 l de suero fetal bovino (FBS) por debajo de las suspensiones de células en cada tubo. Una interfaz clara puede ser observado entre la suspensión de células de la capa superior y la capa inferior de FBS. </li><li> tubos de cabeza y las muestras de centrifugación a 1500 × g durante 5 min. </li><li> Repita los pasos 1.1.7 - 1.1.9 a la pielTher eliminar las células rojas de la sangre. No repetir si lisis es suficiente la primera vez. El sedimento debe ser difícil de discernir después de la centrifugación. </li></ol></li><li> El lipopolisacárido (LPS) Estimulación y Cultura <ol><li> Resuspender las células en 200 l de completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640. </li><li> Transferir la suspensión celular a un tubo de citometría de flujo. </li><li> Hacer LPS solución de trabajo mediante la mezcla de 10 l de LPS solución madre (1 mg / ml) con 990 l de medio completo RPMI 1640. </li><li> Añadir 20 l de LPS 10 g / ml de solución de trabajo de 200 l de suspensión celular. </li><li> Tubos con tapa sin apretar y se incuban las muestras durante 4 horas a 37 ° C con 5% de CO2. </li></ol></li><li> Análisis de citometría de flujo <ol><li> Abra el programa de adquisición de datos de citometría de flujo. Configurar plantilla de adquisición antes de la adquisición de muestras. </li><li> Haga clic en la herramienta de punto de parcelas en la paleta de herramientas. Dibuje una forward de dispersión (FSC) frente a la dispersión lateral de parcela (SSC). Establecer los parámetros de tensión FSC y SSC a escala lineal. </li><li> Seleccionar los umbrales más bajos de FSC y SSC permitidos por el citómetro. Aplicar umbrales 200 y 50 para el FSC y SSC, respectivamente. </li><li> Dentro del FSC frente a SSC parcela, dibujar una puerta G1 que incluye monocitos, granulocitos y células dendríticas, y excluye los desechos, las células rojas de la sangre y los linfocitos. </li><li> Haga clic en la herramienta de histograma en la paleta de herramientas. Dibujar un histograma FL2 (canal de fluorescencia roja). Use una muestra de control negativo para establecer la línea de base de las señales de FL2 y una muestra de control positivo para dibujar una puerta para incluir todos los eventos de DsRed positivos. </li><li> En el panel de control de fluidos del citómetro, establecer el modo fluido a &quot;RUN&quot; y el caudal de &quot;HI&quot; (aproximadamente 60 l / min). Adquirir 10.000 eventos en cada muestra. </li><li> Determinar fenotipo pup midiendo el porcentaje de células positivas DsRed de la puerta G1. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. La inducción de la inflamación de la piel en ratones pIL1-DsRed <ol><li> Anestesie ratón por inyección intraperitoneal (ip) de un cóctel anestésico que contiene 100 mg / kg de ketamina, 10 mg / kg de xilazina, y 1 mg / kg de acepromazina. los ratones anestesiados adecuadamente no muestran retirada de la pata trasera que va pizca dedo del pie. </li><li> Aplicar la crema de depilación a la superficie dorsal de las dos orejas del ratón. Espere 30 segundos a 1 minuto. Limpiar la superficie del oído con un algodón humedecido con agua y deje que se seque al aire. </li><li> Mida el grosor de la oreja usando micrómetro y vuelva a colocar el ratón en una jaula separada. Observe hasta que la recuperación de la anestesia (~ 15 - 30 min). Para resolver la inflamación de la piel inducido por el producto de depilación, permiten ratón para descansar durante 3 días antes de la experimentación adicional se lleva a cabo. </li><li> Preparar 1,25% (w / v) OX disolviendo 16,7 mg de OX en 1 ml de acetona y la mezcla de 750 l de solución / acetona OX con 250 l de aceite de oliva. Preparar la solución de vehículo por mezcla de 750 l de acetona con 250 y# 181; l de aceite de oliva. </li><li> Vuelva a anestesiar ratón mediante inyección ip de cóctel anestésico (2.1). Mida el grosor de la oreja como antes. </li><li> Aplicar 12,5 l de 1,25% OX en cada lado de la oreja derecha. Aplicar 12,5 l de solución de vehículo de acetona / aceite de oliva en cada lado de la oreja izquierda. </li><li> Mantener separado de ratón compañeros de jaula hasta que esté totalmente recuperado para evitar el insulto a sus oídos por otros ratones, vuelva a colocar el ratón en su jaula original y volver a la instalación de alojamiento de los animales. NOTA: La eliminación del vello puede resultar en inflamación de la piel de menor importancia tras el cambio del grosor de la oreja. Esta inflamación menor será resuelta 3 días más tarde confirmado por grosor de la oreja normal. Después de la aplicación tópica durante 24 horas, oídos OX-tratada muestran significativa (p &lt;0,01) en comparación con la hinchazón de solución vehículo orejas tratadas solos. </li></ol> 3. El etiquetado de los neutrófilos en ratones pIL1-DsRed NOTA: En vivo etiquetado de los neutrófilos por dosis bajas de fluorescence-anticuerpo monoclonal conjugado-neutrófilos específica sigue un protocolo desarrollado recientemente 19. Inyecciones retro-orbitales se realizaron de acuerdo a un protocolo establecido con algunas modificaciones 24. <ol><li> Preparar la solución de trabajo anti-Ly6G mAb mediante la dilución de 10 l de 0,5 mg / ml Alexa Fluor 647 conjugado con anti-Ly6G mAb (clon 1A8) en 90 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Transferir 100 l de solución de trabajo anti-Ly6G mAb (50 mg / ml) en una jeringa de insulina U-100 con la aguja 28 de calibre. </li><li> Anestesiar a un adulto pIL1-DsRed ratón mediante inyección ip del cóctel anestésico previamente descrito (2.1). Coloque el abdomen del ratón anestesiado sobre una placa de trabajo limpio. </li><li> Aplique presión hacia abajo suave a la piel dorsal y ventral de un ojo ratón para sobresalir parcialmente el globo ocular de la toma. </li><li> Coloque con cuidado la aguja, el bisel hacia abajo, en un ángulo de aproximadamente 30 ° en el canto medial en el retro-orbitalseno. NOTA: El operador puede sentir presión, penetración y resistencia aliviado una vez que las inserciones de aguja en el seno. </li><li> Lenta y suavemente inyectar 100 l de mAb contra Ly6G-solución (5 mg de mAb / ratón / inyección) en el ratón de trabajo. Retire la aguja rápidamente. Una pequeña cantidad de sangrado sugiere una inyección exitosa. </li><li> Inmediatamente aplique 1,25% OX y la solución de vehículo sobre el derecho y el oído izquierdo del ratón. </li><li> Después de 8 horas, administrar 100 l de anti Ly6G solución recién preparada mAb de trabajo (5 mg de mAb / ratón / inyección) a través de la inyección de retro-orbital en el mismo ratón. </li><li> Para visualizar los vasos sanguíneos, inmediatamente antes de la imagen, administrar 100 l de 30 mg / ml de isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con dextrano (150 kDa) a través de la inyección de retro-orbital. </li></ol> 4. intravital de imágenes de neutrófilos cebado en pil-1-DsRed ratones <ol><li> Anestesiar al ratón con la inyección ip de cóctel anestésico (2.1).0; Aplicar ungüento veterinario a los ojos del ratón para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia para la formación de imágenes. <ol><li> Preparar 1 ml de dosis media cóctel anestésico mediante la dilución de 500 l de cóctel anestésico original con un volumen igual de PBS. </li><li> Transferir la mitad de la dosis de cóctel anestésico para jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 27 mariposa. </li><li> Inserte la aguja de mariposa en el abdomen del ratón por vía intraperitoneal y fijar el ala de la mariposa en el abdomen con cinta adhesiva. </li></ol></li><li> Colocar un cubreobjetos de vidrio en el centro de la etapa de formación de imágenes. Cinta de los bordes del cubreobjetos para mantenerlo en su lugar. </li><li> Colocar una gota de PBS en la superficie ventral de la oreja de ratón, así como en el cubreobjetos. </li><li> Posición del ratón anestesiado con su oído sobre el cubreobjetos. Montar el lóbulo de la oreja, cara dorsal hacia abajo, intercalando la oreja entre el cubreobjetos y un portaobjetos de vidrio, también se mantiene en su lugar por medio de la cinta. </li><li> Encienda un multi-láser confocal de fluorescencia y microscopio de todo lo relacionado correoquipment. Apagar las luces de las habitaciones para minimizar la exposición de luz ambiental. </li><li> Abra el software de adquisición de imágenes. Seleccionar los canales de láser para la detección de colorantes fluorescentes en el menú Lista de tinte. </li><li> Ajuste el enfoque en la piel de la oreja inflamada por la observación de las señales verdes de los vasos sanguíneos y las señales rojas de las células DsRed + a través del ocular. </li><li> Realizar un análisis rápido con una velocidad de barrido de 2 microsiemens / pixel y resolución de 512 × 512 píxeles. Seleccionar un pseudocolor para cada canal en el menú Ver en vivo. Ajuste la perilla de enfoque para ajustar el inicio y final de localización de la exploración. </li><li> Realizar escaneos lentos con velocidad de escaneo de 4 - 8 microsegundos / pixel y resolución de 800 × 800 o 1024 × 1024 píxeles. Ajuste la alta tensión, la ganancia y el offset en cada canal individual para maximizar la intensidad de las señales y evitar la saturación (píxeles rojos). No debe haber sólo unos pocos píxeles de color rojo en cada canal. </li><li> Crear conjuntos de imágenes tridimensionales mediante el escaneo de THpiel de oreja e comenzando superficialmente en el estrato córneo y progresando hacia abajo con x, y, volúmenes z de 317 micras x 317 micras × 30 micras (objetivo 40X), 635 m x 635 m × 30 m (objetivo 20X), o 1.270 micras × 1.270 micras x 50 micras (objetivo 10X) a las 2 micras z pasos. NOTA: La capa córnea es la capa más externa de la epidermis y puede ser fácilmente localizada basa en su fuerte señal de autofluorescencia. </li><li> En los experimentos de imagen de lapso de tiempo, grabar imágenes tridimensionales cada 2 ó 4 min para un máximo de 8 horas. </li><li> De forma intermitente, como el ratón comienza a recuperarse de la anestesia, señaló basada en la observación de los bigotes temblorosos, administrar 5 - 10 l de media dosis cóctel de anestesia a través de la aguja de mariposa. NOTA: Tenga cuidado con la dosis de anestesia - sobredosis puede causar la muerte del ratón. Alternativamente, la anestesia de inhalación en un frasco podría aplicarse a la del ratón para la anestesia y un corto plazocono de nariz se podría utilizar para obtener imágenes a largo plazo. </li><li> Retire el ratón anestesiado de la etapa en la que la imagen se ha completado. Separar la cinta y retire la aguja de la mariposa del abdomen del ratón. Devolver el ratón a una jaula separada en las instalaciones de alojamiento de los animales. NOTA: Para imágenes de corta duración (&lt;1 hora), los ratones se recuperan completamente de la anestesia rápidamente in 1 - 3 horas. Para imágenes a largo plazo (~ 8 horas), los ratones se recuperan lentamente, con un período de recuperación típico de 12 - 16 h. Así, la administración oral de agua se recomienda al menos varias veces durante el período de recuperación para prevenir la deshidratación severa. </li><li> Proceso de conjuntos de datos de imágenes, realizar un seguimiento de las células individuales, generan rutas migratorias, y calcular la dirección y con la velocidad de la migración celular utilizando el software de análisis de imagen 25. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.

El objetivo de este estudio es desarrollar una tecnología para el seguimiento del proceso de cebado de neutrófilos en los animales vivos, que aún no ha sido cumplido por las técnicas disponibles en la actualidad. Para lograr este objetivo, se realizan tres metodologías establecidas: 1) la inducción de la inflamación de la piel en ratones reportero DsRed promotor impulsado por IL-1 como una medida de cebado, 2) etiquetado in vivo de los neutrófilos con dosis bajas de fluorescencia de conjugado anti-Ly6G mAb, y 3...

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes y de corta duración en la circulación. Ellos son reclutados rápidamente a los sitios de infección o lesión, donde sirven como fagocitos profesionales a través de la liberación de oxígeno y nitrógeno intermedios reactivos, junto con gránulos que contienen péptidos antimicrobianos y proteasas 1. Durante su reclutamiento, los neutrófilos están &quot;preparados&quot; por varios agentes, incluidos los productos microbianos, factores quimiotácticos y citoquinas inflamatorias, lo que resulta en la funcionalidad de los fagocitos marcadamente mejorada al llegar a un sitio de la inflamación 2. Los mecanismos de cebado de neutrófilos han sido ampliamente estudiados in vitro 3,4; Sin embargo, el seguimiento dinámico del proceso in vivo no ha sido posible hasta la fecha. Recientemente, intravital de imágenes se ha convertido en una técnica importante para la visualización y la cuantificación de la dinámica celular de los procesos biológicos en los organismos vivos. Intravide formación de imágenes tal se puede realizar a través de microscopía de excitación de un solo fotón convencionales (por ejemplo, confocal) o microscopía multifotónica se aproxima a 5. Con el tiempo, las mejoras sustanciales se han logrado en esta técnica que permite aumentar la resolución de la imagen, la mejora de la profundidad de formación de imágenes, disminución de fotodaño del tejido, y el aumento de 6,7 estabilización de imagen. Dada su capacidad única para permitir la visualización dinámica de la migración celular y la interacción con el tiempo, la microscopía intravital se ha aplicado ampliamente a diversos campos de estudio de la inmunología 8. intravital de imágenes permite a los inmunólogos para comprender mejor y contextualizar la respuesta inmune, tanto a nivel celular y molecular en modelos animales que viven. Los recientes avances en transgénicos, así como en ratones knock-informadores han proporcionado herramientas útiles para el seguimiento de los comportamientos dinámicos de neutrófilos en los animales vivos. La lisozima M promotor impulsado por una mayor proteína verde fluorescente knock-inlos ratones se han utilizado ampliamente para caracterizar la motilidad de los neutrófilos, monocitos y macrófagos durante diversos procesos inflamatorios, incluyendo la extravasación, infección bacteriana, y la inflamación estéril 9-15. Además, los ratones transgénicos que expresan un biosensor de resonancia de fluorescencia la transferencia de energía citoplásmica se han empleado en el estudio de las actividades de los neutrófilos mitógeno quinasa extracelular regulada y la proteína quinasa A dentro de intestino inflamado 16. Un modelo murino con una alta especificidad para la expresión de la fluorescencia de los neutrófilos es el ratón knock-in Catchup, que produce la recombinasa Cre, así como la tdTomato proteína fluorescente, que a su vez está acoplado a la expresión de antígeno de linfocitos 6G (Ly6G) 17. La visualización de los neutrófilos Ly6G deficientes a través de este modelo ha demostrado que estas células ejercen funcionalidad normal en una variedad de contextos inflamatorios in vivo estériles o infecciosas en. Los ratones transgénicos que expresan la DsRed fluorescente protein gen bajo el control del ratón interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) han sido utilizados para visualizar los comportamientos móviles de células productoras de IL-1ß - cree incluyen neutrófilos, monocitos inflamatorios, y macrófagos activados - emergente en la piel inflamada 18. In vivo etiquetado puede servir como un enfoque alternativo para el seguimiento de los comportamientos celulares y moleculares de los neutrófilos en los tejidos inflamados. Después de la inyección intravenosa de bajas dosis de etiqueta fluorescente-1 anti-Gr anticuerpo monoclonal (mAb), la cascada de reclutamiento de Gr-1 + neutrófilos ha sido visualizado en las lesiones de piel de ratón infectadas con Staphylococcus aureus 19. La administración in vivo de conjugados que contienen estreptavidina conjugados 705 puntos cuánticos nm y biotina anti-Ly6G mAb etiquetan específicamente neutrófilos circulantes 20. Por otra parte, la endocitosis de tales conjugados en neutrophil vesículas permite el seguimiento de la vesícula de transporte de alta velocidad en los neutrófilos que migran hacia el intersticio. In vivo etiquetado con anticuerpos de fluorescencia conjugada contra P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), L-selectina (CD62L), la integrina αM (CD11b ) y quimiocinas (CXC motivo) del receptor 2 (CXCR2) en un modelo inflamatoria TNF inducida ha dilucidado los mecanismos de regulación en juego durante la inflamación temprana 21. neutrófilos polarizadas sobresalen urópodos PSGL-1-enriquecido para interactuar con CD62L presente en las plaquetas activadas, lo que resulta en la redistribución de CD11b y CXCR2, los receptores que dirigen la migración de neutrófilos e inician la inflamación. IL-1β es uno de los genes de la firma que se encuentra elevado en los neutrófilos imprimados 22. En los ratones reportero pIL1-DsRed, las señales de fluorescencia DsRed (es decir., La activación del promotor de la IL-1β) se correlacionan positivamente con la IL-1β la expresión del ARNm y la producción de la proteína IL-1β. &lt;sup&gt; 18 para supervisar el proceso de cebado de neutrófilos, se ha desarrollado un método de microscopía intravital que implica la inducción de la inflamación de la piel con oxazolona (OX) en el modelo de ratón pIL1-DsRed siguiente etiquetado in vivo de los neutrófilos con anti-Ly6G mAb conjugados con fluoresceína. A través de este modelo, es posible estudiar el comportamiento y la función de los neutrófilos imprimadas en modelos animales de diversas enfermedades y trastornos.

<table><tbody><tr><td>Heparina sódica</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampón de lisado</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de ketamina</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Church & Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anticuerpo anti-ratón Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 jeringa de insulina con aguja de 28 G</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Set de infusión de mariposa (aguja de 27 G)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCitómetro de alibur</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro software</td> BD Microscopio <td></td> confocal Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging intravital de neutrófilos cebado el uso de il-1 promotor impulsado reportero ratones dsred

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la circulación de la sangre humana y son reclutados rápidamente a los sitios inflamatorios. El cebado es un evento crítico que mejora la funcionalidad fagocítica de los neutrófilos. A pesar de extensos estudios han revelado la existencia y la importancia de cebado de neutrófilos durante la infección y las lesiones, los medios de visualización de este proceso in vivo no han estado disponibles. El protocolo proporcionado permite la monitorización del proceso dinámico de neutrófilos cebado en animales vivos mediante la combinación de tres metodologías: 1) la señal del informador DsRed - se utiliza como una medida de cebado 2) etiquetado de neutrófilos in vivo - logrado por la inyección de antígeno anti-linfocitos fluorescencia conjugado 6G (Ly6G) anticuerpo monoclonal (mAb) y 3) la imagen confocal intravital. Varios pasos críticos están involucrados en este protocolo: la inflamación inducida por oxazolona piel de oreja de ratón, la sedación adecuada de los animales, las inyecciones repetidas de anticuerpos anti-Ly6G mAb, y prevención de la deriva de enfoque durante la exploración. Aunque se han observado algunas limitaciones, tales como el límite de tiempo de imagen continua (~ 8 horas) en un ratón y la fuga de isotiocianato-dextrano de los vasos sanguíneos en el estado inflamatorio de fluoresceína, este protocolo ofrece un marco fundamental para intravital de imágenes de comportamiento imprimada de neutrófilos y la función, que puede ser fácilmente ampliado para examen de otras células inmunes en modelos de inflamación de ratón.

Proyección de ratones pIL1-DsRed se realiza basándose en la señal de fluorescencia fenotípica DsRed producido por sus leucocitos de sangre periférica mediante citometría de flujo. La estimulación con LPS se sabe que inducen la producción de IL-1β en las células mieloides, incluyendo neutrófilos, monocitos y células dendríticas 26-28. Por lo tanto, los leucocitos aislados se incubaron con LPS durante 4 horas antes de la citometría de flujo análisis. A continuación, gating se es...

Este protocolo actual emplea reporteros fluorescentes, marcaje in vivo y técnicas de imagen intravital para permitir el monitoreo del proceso dinámico de cebado de neutrófilos en animales vivos.

Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

El objetivo general de este procedimiento es presentar una tecnología para monitorear el proceso de cebado de neutrófilos en animales vivos. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de la inmunología, como la visualización del comportamiento y la función de cebado de los neutrófilos en modelos animales de las enfermedades y trastornos más raros. La principal ventaja de esta técnica es que combina tres metodologías establecidas, incluyendo reporteros fluorescentes en el marcaje viral e imágenes intravitales.Cría ratones pIL1-DsRed heterocigotos con ratones C57Black de tipo salvaje seis. A las tres o cuatro semanas, fenotipa a sus crías. Para cada cachorro, prepare un tubo de 1,5 mililitros con 20 microlitros de heparina.Para recolectar sangre, sostenga a un cachorro por el pescuezo y perfore la vena submandibular en la bolsa de la mejilla con una lanceta de 5 milímetros. Solo se necesita un pequeño pinchazo. Recoja de tres a cinco gotas de sangre por tubo.Después de hacer la recolección, asegúrese de detener el sangrado y observe a los animales durante 30 minutos antes de devolverlos a la instalación de animales. A cada tubo de muestra, agregue 500 micr

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe una manera no invasiva de dos fotones (2P), microscopía de enfoque para el estudio de leucocitos de recalada en la almohadilla plantar del ratón. Se discuten los aspectos técnicos de la preparación de imágenes de tejidos y caminar al lector a través de un experimento típico de la configuración inicial a la colección de ejecución y los datos.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Este video muestra imágenes in vivo para estudiar la dinámica de reclutamiento de neutrófilos en un sitio de infección en un ratón transgénico inmunocomprometido con neutrófilos que expresan GFP. Consiste en inyectar bacterias luminiscentes para causar una infección. Esto conduce al reclutamiento de neutrófilos al sitio de la infección, cuyo seguimiento se realiza mediante imágenes.

Monitorización de la dinámica de reclutamiento de neutrófilos y la carga bacteriana en el lugar de la infección en un modelo murino

Este vídeo muestra una técnica in vivo para evaluar un antígeno de prueba mediante la inducción de inflamación de la piel en un modelo murino. El antígeno de prueba, un hapteno en una solución de aceite y acetona, se aplica tópicamente en la piel de la oreja del ratón y se evalúa la inflamación de la piel después de un período adecuado.

Técnica para evaluar la respuesta inmunitaria frente a un antígeno mediante la inducción de inflamación de la piel

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Los mecanismos que regulan la motilidad intersticial de las células T CD4 efectoras en sitios de inflamación son relativamente desconocidos. Se presenta un enfoque no invasivo para visualizar y manipular en las células T CD4 in vitro -primed en la dermis para los oídos inflamados, lo que permite el estudio del comportamiento dinámico de estas células in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

El método descrito aquí permite la visualización de la activación de la inflamación dependiente del promotor de IL-8 en los pulmones de ratones a través de imágenes de bioluminiscencia no invasivas (BLI). El mismo animal puede ser sometido a BLI múltiples veces durante hasta dos meses a partir del momento de la entrega de la construcción de indicador de luciferasa.

Un modelo de ratón IL-8 transgénicamente transgéni-<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoreo a Largo Plazo de las Respuestas Inflamatorias

Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.

Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital

La migración de neutrófilos se basa en la remodelación rápida y continua de la membrana plasmática en respuesta al quimioatrayente y sus interacciones con el microambiente extracelular. En este trabajo se describe un procedimiento basado en Microscopía Subcelular Intravital para investigar la dinámica de la remodelación de la membrana en neutrófilos inyectados en el oído de ratones anestesiados.

Obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas

Aprende a visualizar el cebado de neutrófilos en ratones vivos mediante reporteros fluorescentes e imagen intravital. Este método combina técnicas avanzadas para estudiar respuestas inmunitarias en modelos de enfermedades raras.

Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed

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