Generación de células madre pluripotentes inducidas por el Uso de sinoviocitos similares a fibroblastos aislados de las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide
16 de octubre de 2016
Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes humanas inducida de sinoviocitos similares a fibroblastos derivados del paciente, utilizando un sistema lentiviral sin células alimentadoras.
El objetivo general de este experimento es generar células madre pluripotentes inducidas, o IPC, a partir de sinoviocitos similares a fibroblastos aislados del tejido sinovial de una articulación inflamada por artritis reumatoide. Actualmente, las iPSC se pueden generar a partir de varias células primarias humanas. Generamos con éxito iPSC a partir de sinoviocitos humanos similares a fibroblastos, que son las células patológicas clave de las articulaciones reumatoides.
Esto puede ayudar a investigar la patología de la artritis reumatoide. Esta publicación periódica puede ayudar a responder preguntas clave sobre la degeneración de los IPSC, utilizando RA-FLS. Comience colocando el tejido sinovial en un plato de 100 milímetros y lavando el tejido con 5 mililitros de PBS suplementado con antibióticos.
Retire el tejido graso amarillento y los residuos óseos. A continuación, transfiera el tejido recortado a un pocillo de una placa de seis pocillos que contenga 5 mililitros de DMEM suplementado con FBS y utilice unas tijeras para picar el tejido hasta que los trozos sean lo suficientemente pequeños como para penetrar en una punta de pipeta desechable. Transfiera el medio a un tubo cónico de 50 mililitros, luego agregue 5 mililitros de DMEM fresco más FBS al pocillo para recolectar cualquier tejido restante y transferir todo el contenido del pocillo al tubo.
A continuación, agregue colagenasa descongelada con hielo hasta una concentración final de 0.01% en el tubo y selle el tubo con parafilm para la incubación en un baño de agua a 37 grados Celsius con agitación. Después de cuatro horas, llene el tubo con DMEM fresco más FBS hasta un volumen final de 50 mililitros y recoja los fragmentos de tejido por centrifugación. Retire el sobrenadante sin alterar el pellet y luego vuelva a suspender las células en 40 mililitros de medio fresco para otra centrifugación.
Vuelva a suspender el segundo pellet en 25 minutos de DMEM fresco más FBS y deje que se asienten los grandes grumos de tejido. A continuación, transfiera el sobrenadante a una nueva placa de 100 milímetros e incube los sinoviocitos a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante 14 días. Para expandir el cultivo de sinoviocitos, desechar el medio usado y lavar las células con 5 mililitros de PBS.
Retire el PBS y disocie las células con 1 mililitro de EDTA en la incubadora de cultivos celulares durante 2 minutos. Al final de la incubación, golpee suavemente la placa para separar las células adherentes restantes y transfiera la suspensión celular resultante a un tubo cónico de 15 mililitros para la centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 30 mililitros de DMEM y FBS y divida las celdas en 3 nuevas placas de 100 milímetros.
Alimente los sinoviocitos con medio fresco cada 3 días, dividiendo las células en 3 nuevos cultivos al 80% de confluencia como se acaba de demostrar. En el día cero de la transducción, vea 3 x 10 a 4 FLS por pocillo en una placa de 6 pocillos en medio de crecimiento fresco para una incubación nocturna a 37 grados Celsius en 5% de CO2. Al día siguiente, descongele 1 vial de Lenti-virus que contenga 4 factores Yamanaka a 4 grados centígrados y reemplace el medio de cultivo FLS con medio de crecimiento FLS suplementado con bromuro de hexadimetrina y ácido ascórbico.
Cuando el contenido del vial se haya descongelado, agregue 30 microlitros de lenti-virus a las células y mezcle suavemente para distribuir homogéneamente el virus. Para mejorar la infección, centrifugar la placa y devolver las células a la incubadora, reemplazando el medio todos los días con medio de crecimiento FLS fresco que contenga butirato de sodio y ácido ascórbico durante 3 días. Al 4º día, sustituya el medio por una mezcla de FLS growth y medio iPSC que contenga butirato de sodio y ácido ascórbico.
El día 5, agregue 60 microlitros de vitronectina a 6 mililitros de PBS sin calcio y magnesio y cubra 3 pocillos de una placa de 6 pocillos con 2 mililitros de la solución cada uno durante al menos una hora a temperatura ambiente. Mientras la vitronectina está fraguada, lave las células transducidas con PBS y sepárelas con EDTA como se ha demostrado. Después de recolectar las células disociadas por centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 900 microlitros de medio fresco.
Retire el exceso de vitronectina de los pocillos y agregue 300, 150 y 100 microlitros de células en pocillos individuales. Luego regrese las celdas a la incubadora, reemplazando el medio diariamente con medio iPSC fresco hasta que aparezcan las colonias. Para recoger las colonias, primero agregue 500 microlitros de medio iPCS, suplementado con inhibidor de ROCK a cada pocillo de una placa de 48 pocillos recubierta de vitronectina.
A continuación, coloque los cultivos de FLS bajo un microscopio de disección en un banco limpio y utilice una punta de pipeta de 10 microlitros para cortar alrededor de una colonia de interés. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, transfiera la colonia seleccionada a 1 pocillo de la placa de 48 pocillos. Cuando se hayan recogido todas las colonias, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares hasta que las colonias sean lo suficientemente grandes para la transferencia.
División de las células cuando las colonias están fuera del campo visible del microscopio, visto con un aumento de 100X. En esta imagen se puede observar la morfología del FLS aislado después de un cultivo inicial de 14 días. Las células exhiben las características de los fibroblastos en general, con una expresión similar de los marcadores fibróticos vimentina y fibronectina, así como una baja expresión del marcador de sinoviocitos similar a los macrófagos CD-68.8 a 11 días después de la transducción lentiviral del factor de Yamanaka, comienzan a aparecer pequeñas colonias que pueden seleccionarse y amplificarse durante 5 a 10 pasajes.
Estas iPSC de artritis reumatoide expresan fosfatasa alcalina, lo que indica que permanecen indiferenciadas. Las células también expresan marcadores pluripotentes, como se confirma mediante RT-PCR y análisis de inmunofluorescencia. Artritis reumatoide Los iPCS exhiben un patrón cromosómico normal de 44 + XY según lo determinado por el cariotipo.
Además, 12 semanas después de su inyección en ratones SCID, la artritis reumatoide iPSC formó teratoma, que muestra diversos fenotipos de tejidos. Con su diferenciación de la capa germinal confirmada por tinción inmunofluorescente. Una vez dominado, se pueden generar iPSC a partir de FLS con synovium.
Después de ver el video, debería tener una mejor comprensión de cómo aislarse del tejido sinovial y cómo inducir la reprogramación usándolos. Estas iPSC derivadas de RAF-FLS pueden ser útiles para estudiar la regeneración o el cribado de fármacos en reumatología. Una vez que se establecen estas iPSC, se pueden generar varios tipos de células u órganos objetivo.
Lo que puede ser útil para estudiar la enfermedad u otras aplicaciones futuras, como la edición de genes, etc.
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Descripción general
Este artículo describe un protocolo para generar células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) a partir de sinoviocitos de tipo fibroblástico derivados de pacientes con artritis reumatoide. El método utiliza un sistema lentiviral sin células alimentadoras, facilitando el estudio de la patología de la artritis reumatoide.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de Células Madre
- Reumatología
- Reprogramación Celular
Antecedentes
- Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) pueden obtenerse de diversas células primarias humanas.
- Los sinoviocitos con morfología de fibroblastos son células patológicas clave en la artritis reumatoide.
- Comprender la generación de iPSCs a partir de estas células puede ayudar a estudiar los mecanismos de la enfermedad.
- Esta investigación podría proporcionar información sobre la degeneración de las iPSCs utilizando sinoviocitos con morfología de fibroblastos de artritis reumatoide (RA-FLSs).
Objetivo del estudio
- Generar iPSC a partir de sinoviocitos fibroblasto-likes derivados de pacientes.
- Investigar la patología de la artritis reumatoide.
- Desarrollar un protocolo que no requiera células alimentadoras.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide.
- Lavado del tejido con PBS suplementado con antibióticos.
- Uso de un sistema lentiviral para la reprogramación de células.
- Cultivo de iPSC derivadas para análisis posteriores.
Resultados principales
- Generación exitosa de iPSCs a partir de sinoviocitos de tipo fibroblástico.
- Demuestra la factibilidad del protocolo sin el uso de células alimentadoras.
- Potencial para investigaciones futuras sobre la patología de la artritis reumatoide.
- Contribución al entendimiento de la degeneración de iPSCs utilizando FLS procedentes de artritis reumatoide.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para generar iPSC a partir de pacientes con artritis reumatoide.
- Este enfoque podría mejorar el estudio de los mecanismos de la enfermedad y de terapias potenciales.
- La investigación futura puede basarse en estos hallazgos para explorar aplicaciones de las iPSC en medicina regenerativa.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La generación de iPSC específicas del paciente a partir de sinoviocitos de tipo fibroblasto permite reducir mecanismamente los riesgos en la validación de dianas en la artritis reumatoide al proporcionar un sistema relevante para la enfermedad que sirve para la selección fenotípica. Este enfoque facilita la identificación de compuestos prometedores mediante modelos escalables y reproducibles que reflejan la fisiopatología del paciente, mejorando la confianza predictiva en la toma de decisiones preclínicas. El método mejora la continuidad traslacional desde la fase de descubrimiento hasta las etapas preclínicas al proporcionar sistemas celulares validados para la investigación de dianas y la alineación de biomarcadores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el uso de células derivadas de pacientes que conservan los contextos genéticos y epigenéticos específicos de la enfermedad.
- Valor operativo: Proporciona una fuente renovable de células humanas para la validación funcional de dianas sin depender de modelos animales ni de líneas inmortalizadas.
- Valor científico: Facilita la reducción del riesgo biológico al permitir la evaluación de la modulación de dianas en un contexto celular relevante para la enfermedad antes de la optimización del compuesto líder.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera sistemas biológicos validados adecuados para la estandarización de ensayos y lecturas cuantitativas en estudios de interacción con dianas.
- Valor operativo: Proporciona plataformas celulares reproducibles y escalables que reducen la variabilidad en el cribado de compuestos y permiten la consistencia entre laboratorios.
- Valor científico: Facilita la preparación de células relevantes para enfermedades, destinadas a campañas de cribado fenotípico y descubrimiento de fármacos promisorios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia de la enfermedad mediante iPSC específicas del paciente que pueden diferenciarse en linajes sinoviales o cartilaginosos para estudios mecanicistas.
- Valor operativo: Asegura la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica utilizando modelos celulares isogénicos y emparejados con el paciente.
- Valor científico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir la evaluación de los efectos del blanco en células que reflejan el entorno articular inflamatorio.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento al proporcionar sistemas celulares relevantes para la validación de dianas, el desarrollo de ensayos y la modelización preclínica, cuyos resultados informan las decisiones de identificación de compuestos líderes y de selección de carteras.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el uso de células derivadas de pacientes que modelan la hiperplasia sinovial y la invasividad en la artritis reumatoide.
- Tamizaje: Permite la preparación de ensayos mediante cultivos estandarizados y ampliables derivados de iPSC que facilitan la medición cuantitativa de fenotipos celulares.
- Análisis: Proporciona indicadores de pluripotencia y diferenciación (por ejemplo, fosfatasa alcalina, RT-PCR, inmunofluorescencia) que ayudan a comparar la eficiencia de reprogramación y la identidad celular entre distintas condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la generación de iPSC capaces de formar teratomas y diferenciarse en múltiples líneas celulares, validando así su utilidad para la modelización de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para generar iPSC específicas del paciente a partir de tejido sinovial, aplicable a múltiples muestras de pacientes con AR y proyectos de validación de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante modelos celulares relevantes para la enfermedad que reducen la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos terapéuticos.
- Valor operativo: Normalización y escalabilidad mediante la reprogrmación con lentivirus sin células alimentadoras, lo que simplifica los procedimientos de cultivo.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción de proyectos al permitir la evaluación temprana de los efectos del objetivo terapéutico en células derivadas de pacientes, reduciendo el riesgo biológico en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante el uso de modelos isogénicos y específicos del paciente que reflejan la fisiopatología real de la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de células primarias, transducción viral y cultivo de células madre pluripotentes.
- Depende de la producción de vectores lentivirales, infraestructura de bioseguridad y clasificación de células activada por fluorescencia o microscopía para la selección de colonias.
- Necesita estandarización entre equipos para el procesamiento de tejidos, monitoreo de la eficiencia de reprogramación y control de calidad de las líneas de iPSC.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el protocolo a diferentes muestras de tejido sinovial o estados patológicos más allá de la artritis reumatoide.
- Limitado por la disponibilidad de tejido sinovial de pacientes y el tiempo requerido para la caracterización y expansión de iPSC antes de su uso posterior.
