Name: La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprende la secuenciación de ARN dirigida para evaluar la expresión génica y mutaciones mediante hibridización con sondas personalizadas. Este método permite identificar fusiones génicas y variaciones de nucleótido único de forma rentable.

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Damos las gracias especialmente a Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto y Eric Samorodnitsky por su apoyo técnico. También nos gustaría agradecer a Jenny Badillo por su apoyo administrativo a nuestro equipo. Agradecemos al Centro de Supercomputación de Ohio (OSC) por proporcionar espacio en disco, capacidad de procesamiento y soporte para ejecutar nuestros análisis. Agradecemos al Centro Oncológico Integral (CCC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico Wexner de la Universidad Estatal de Ohio por su apoyo administrativo a este trabajo. S.R. y su equipo cuentan con el apoyo de la Sociedad Americana del Cáncer (MRSG-12-194-01-TBG), un Premio al Investigador Joven de la Fundación del Cáncer de Próstata, NHGRI (UM1HG006508-01A1), la Fundación para la Investigación del Cáncer Fore, la Asociación Americana del Pulmón y Pelotonia.

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<li>Kim, D., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat-Fusion%3A+an+algorithm+for+discovery+of+novel+fusion+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts.</a> Genome Biol. 12, R72(2011).</li>
<li>Fernandez-Cuesta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+fusion+genes+in+lung+cancer+using+breakpoint+assembly+of+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 7(2015).</li>
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S.R. recibe financiación de Novartis y Ariad Pharmaceuticals para la realización de ensayos clínicos. Los miembros de la familia inmediata de S.R. poseen acciones en Johnson and Johnson.

Captura RNAseq es una estrategia intermedia entre RNAseq y microarrays enfoques para la evaluación de una parte seleccionada del transcriptoma. Las ventajas de captura incluyen el costo, el tiempo de respuesta rápido redujeron en un secuenciador de escritorio, de alto rendimiento, y la detección de alteraciones genómicas. El método puede ser adaptado para caracterizar los ARN no codificantes 23, detectar solo nucleótido variantes 4-6, examinar empalme de ARN, y para identificar las fusiones de gene...

El transcriptoma completo o secuenciación de ARN (RNAseq) es un método de secuenciación no sesgado para evaluar todos los productos de ARN. El objetivo de la secuenciación de ARNseq dirigida (captura) es una evaluación centrada de las transcripciones seleccionadas con una mayor sensibilidad, rango dinámico, reducción de coste o escala y mayor rendimiento en comparación con la RNAseq estándar. Al igual que el RNAseq estándar, los enfoques de enriquecimiento dirigido se pueden utilizar para evaluar la expresión génica, múltiples especies de ARN como ARNm, microARN (miARN), lncRNA1, otros ARN no codificantes2, fusiones de genes3 y mutaciones4-6.
La captura implica la hibridación de oligonucleótidos complementarios para enriquecer las bibliotecas de ADNc para la secuenciación. La justificación de la captura de ARNseq es similar a los enfoques de microarrays, en los que los oligonucleótidos complementarios o las sondas se hibridan con las muestras y luego se miden para determinar la abundancia relativa. Para las tecnologías de microarrays, la expresión se basa en la señal relativa medida para las transcripciones que se unen a estas sondas. Por lo tanto, los microarrays están limitados por el alcance, el ruido de fondo potencial de la unión no específica y la hibridación cruzada de sondas. Además, las matrices tienen un rango dinámico limitado para transcripciones de baja y alta expresión en comparación con RNAseq1. Los microarrays son ampliamente utilizados debido a su costo reducido y alta capacidad de rendimiento en comparación con RNAseq. 
Aquí, demostramos un método para la captura de RNAseq que ofrece un término medio entre los enfoques de RNAseq y microarray para evaluar el transcriptoma. RNAseq Capture tiene un rendimiento intermedio, un mayor rango dinámico y sensibilidad, y está escalado para una respuesta rápida en secuenciadores de escritorio. La captura de RNAseq también requiere recursos computacionales reducidos en términos de espacio de almacenamiento y procesamiento de datos.

<table><tbody><tr><td>Termomezclador R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de Grado de Biología Molecular</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock 24 x 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reactivo Kit v2 (300- ciclos)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Secuenciador de Escritorio</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Kit de ARN Total Trenzado con RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Oligo de bloqueo universal - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Oligo de bloqueo universal - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Oligo de bloqueo universal - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; XP - Perlas de purificación PCR&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg; M-270 Streptavidin</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT ADN humano, grado fluorométrico, 1 mg</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; Tubos de ensayo&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; Hibridación EZ y kits de lavado&nbsp; (24 o 96 reacciones)</td><td>Roche NimbleGen&nbsp;</td><td>05634261001 o 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; 2.0 Fluorómetro&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x Solución TE)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade; Termociclador con 96&ndash; Módulo de rección rápida de pozos</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Kits de hibridación y lavado Roche</td><td>Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Transcripción inversa 200 U/&#956; l</td><td>Tecnologías de la vida</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de cinta de ARN</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de muestra RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Estreptavidina T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 LADO CADA UNO Life</td><td>Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini baño seco</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reactivos</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

la secuenciación de arn dirigidos ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

la secuenciación de ARN (RNAseq) es un método versátil que puede ser utilizado para detectar y caracterizar la expresión génica, las mutaciones, las fusiones de genes, y noncoding RNAs. Estándar RNAseq requiere 30 - 100 millones de secuenciación lee y puede incluir varios productos de ARN como ARNm y ARN no codificantes. Demostramos cómo orientar las RNAseq (captura) permite un estudio centrado en productos de ARN seleccionados utilizando un secuenciador de escritorio. captura RNAseq puede caracterizar transcripciones anotadas, bajas, o expresado de forma transitoria que de otra manera no pueden ser detectados usando métodos tradicionales RNAseq. Aquí se describe la extracción de ARN a partir de líneas celulares, el agotamiento de ARN ribosomal, síntesis de ADNc, la preparación de bibliotecas de código de barras, la hibridación y la captura de las transcripciones específicas y la secuencia multiplex en un secuenciador de escritorio. También describimos la tubería análisis computacional, lo que incluye la evaluación del control de calidad, la alineación, la detección de la fusión, la cuantificación de la expresión génica y la identificación de un solo nucleotide variantes. Este ensayo permite la secuenciación de transcripción específico para caracterizar la expresión génica, fusiones de genes, y las mutaciones.

A destacando esquemática pasos clave en Capture RNAseq se muestra en la Figura 1. Cuatro líneas celulares de cáncer con mutaciones conocidas se utilizaron para demostrar la eficacia de la técnica de RNAseq Capture (K562 con la fusión ABL1, LC2 con la fusión RET, EOL1 con la fusión PDGFRalpha y RT- 4 con la fusión FGFR3). Las cuatro muestras se agruparon y se secuenciaron con 2x 100 pb lee en un secuenciador de escritorio, que genera ar...

Describimos un método basado en la secuenciación de ARN dirigido que incluye la preparación de bibliotecas de ADNc indexadas, hibridación y captura con sondas personalizadas y análisis de datos para interrogar transcripciones seleccionadas para la expresión génica, mutaciones y fusiones de genes. Targeted RNAseq permite una evaluación rápida y rentable de transcripciones seleccionadas en un secuenciador de escritorio.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

El objetivo general de este ensayo es enriquecer los transcritos diana para la secuenciación de próxima generación. Este ensayo de secuenciación dirigida de ARN es un procedimiento de múltiples pasos que comienza con el agotamiento de ARN ribosómico del ARN total, seguido por la fragmentación química y la síntesis de ADN complementario, la preparación de bibliotecas con códigos de barras, la hibridación y captura de los transcritos diana, la secuenciación multiplexada y finaliza con el análisis de datos. Este video demostrará los procedimientos de hibridación, captura del blanco y amplificación por PCR posterior a la captura para cuatro muestras.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología molecular, como la identificación de fusiones génicas, variaciones de nucleótido único, expresión génica relativa y empalme alternativo que involucran transcritos diana. La principal ventaja de esta técnica es que puede personalizarse para cualquier gen de interés. Para comenzar el procedimiento de hibridación, retire del congelador a 20 grados Celsius y descongele sobre hielo lo siguiente: sondas hidratadas personalizadas, ADN Cot-1, oligonucleótidos bloqueadores universales

targeted-rna-sequencing-assay-to-characterize-gene-expression-genomic

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Investigación

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Biología

Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de "próxima generación". Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja...

La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

Se utilizaron análisis de ARN de secuenciación y bioinformática para identificar factores de transcripción expresados ​​diferencialmente significativamente y en subpoblaciones Lin-CD34 + y Lin-CD34 de ratón EMLcells. Estos factores de transcripción que podrían desempeñar un papel importante en la determinación del cambio entre las células Lin-CD34- auto-renovación de Lin-CD34 + y parcialmente diferenciado.

Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

Se describe un sistema integrado para la secuenciación dirigida de próxima generación de muestras oncológicas. Este sistema multiplataforma está optimizado para biopsias tumorales de baja calidad y baja cantidad, se adapta a entradas de ADN bajas, incluye controles multivariantes bien caracterizados y cuenta con un nuevo llamador de variantes que se basa en medidas cuantitativas de control de calidad preanalítico.

Integración de Procesos húmedo y en seco de banco Optimiza Targeted secuenciación de próxima generación de baja calidad y biopsias de tumores de baja cantidad

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Aquí, describimos un análisis en situ el hibridación que permite la detección sensible y específica de secuencias tan cortas como 50 nucleótidos con resolución del solo-nucleótido en el nivel unicelular. El ensayo, que se puede realizar manual o automáticamente, puede habilitar la visualización de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en el contexto del tejido.

Visualización de variantes genéticas, metas cortas y mutaciones puntuales en el contexto morfológico del tejido con un ensayo de ARN In Situ hibridación

miRNA la terapéutica tienen un potencial significativo en la regulación de la progresión del cáncer. Demostrado aquí son enfoques analíticos utilizados para la identificación de la actividad de un miRNA combinatoria tratamiento en detener el ciclo celular y la angiogénesis.

Análisis de miRNA combinatoria tratamientos para regular el ciclo de celular y la angiogénesis

Aquí, los autores muestran la utilidad de MULTI-seq para fenotipar y posteriormente emparejar scRNA-seq y scATAC-seq en la caracterización de los perfiles de accesibilidad transcriptómica y cromatina en la retina.

Análisis multiplexado de la expresión génica de la retina y la accesibilidad a la cromatina utilizando scRNA-Seq y scATAC-Seq

Aquí, presentamos un protocolo para realizar knockouts de genes que son embrionarios letales in vivo en tumores derivados de modelos de ratón genéticamente modificados y luego evaluamos el efecto que el knockout tiene sobre el crecimiento tumoral, la proliferación, la supervivencia, la migración, la invasión y el transcriptoma in vitro e in vivo.

Definición de las funciones genéticas en la tumorigénesis mediante la ablación ex vivo de alelos floxados en células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Este procedimiento se describe cómo establecer cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina y es seguida por la transfección utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXCell.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

Aprende la secuenciación de ARN dirigida para evaluar la expresión génica y mutaciones mediante hibridización con sondas personalizadas. Este método permite identificar fusiones génicas y variaciones de nucleótido único de forma rentable.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

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