Name: La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprende la secuenciación de ARN dirigida para evaluar la expresión génica y mutaciones mediante hibridización con sondas personalizadas. Este método permite identificar fusiones génicas y variaciones de nucleótido único de forma rentable.

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Damos las gracias especialmente a Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto y Eric Samorodnitsky por su apoyo técnico. También nos gustaría agradecer a Jenny Badillo por su apoyo administrativo a nuestro equipo. Agradecemos al Centro de Supercomputación de Ohio (OSC) por proporcionar espacio en disco, capacidad de procesamiento y soporte para ejecutar nuestros análisis. Agradecemos al Centro Oncológico Integral (CCC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico Wexner de la Universidad Estatal de Ohio por su apoyo administrativo a este trabajo. S.R. y su equipo cuentan con el apoyo de la Sociedad Americana del Cáncer (MRSG-12-194-01-TBG), un Premio al Investigador Joven de la Fundación del Cáncer de Próstata, NHGRI (UM1HG006508-01A1), la Fundación para la Investigación del Cáncer Fore, la Asociación Americana del Pulmón y Pelotonia.

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S.R. recibe financiación de Novartis y Ariad Pharmaceuticals para la realización de ensayos clínicos. Los miembros de la familia inmediata de S.R. poseen acciones en Johnson and Johnson.

Captura RNAseq es una estrategia intermedia entre RNAseq y microarrays enfoques para la evaluación de una parte seleccionada del transcriptoma. Las ventajas de captura incluyen el costo, el tiempo de respuesta rápido redujeron en un secuenciador de escritorio, de alto rendimiento, y la detección de alteraciones genómicas. El método puede ser adaptado para caracterizar los ARN no codificantes 23, detectar solo nucleótido variantes 4-6, examinar empalme de ARN, y para identificar las fusiones de gene...

El transcriptoma completo o secuenciación de ARN (RNAseq) es un método de secuenciación no sesgado para evaluar todos los productos de ARN. El objetivo de la secuenciación de ARNseq dirigida (captura) es una evaluación centrada de las transcripciones seleccionadas con una mayor sensibilidad, rango dinámico, reducción de coste o escala y mayor rendimiento en comparación con la RNAseq estándar. Al igual que el RNAseq estándar, los enfoques de enriquecimiento dirigido se pueden utilizar para evaluar la expresión génica, múltiples especies de ARN como ARNm, microARN (miARN), lncRNA1, otros ARN no codificantes2, fusiones de genes3 y mutaciones4-6.
La captura implica la hibridación de oligonucleótidos complementarios para enriquecer las bibliotecas de ADNc para la secuenciación. La justificación de la captura de ARNseq es similar a los enfoques de microarrays, en los que los oligonucleótidos complementarios o las sondas se hibridan con las muestras y luego se miden para determinar la abundancia relativa. Para las tecnologías de microarrays, la expresión se basa en la señal relativa medida para las transcripciones que se unen a estas sondas. Por lo tanto, los microarrays están limitados por el alcance, el ruido de fondo potencial de la unión no específica y la hibridación cruzada de sondas. Además, las matrices tienen un rango dinámico limitado para transcripciones de baja y alta expresión en comparación con RNAseq1. Los microarrays son ampliamente utilizados debido a su costo reducido y alta capacidad de rendimiento en comparación con RNAseq. 
Aquí, demostramos un método para la captura de RNAseq que ofrece un término medio entre los enfoques de RNAseq y microarray para evaluar el transcriptoma. RNAseq Capture tiene un rendimiento intermedio, un mayor rango dinámico y sensibilidad, y está escalado para una respuesta rápida en secuenciadores de escritorio. La captura de RNAseq también requiere recursos computacionales reducidos en términos de espacio de almacenamiento y procesamiento de datos.

<table><tbody><tr><td>Termomezclador R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de Grado de Biología Molecular</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock 24 x 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reactivo Kit v2 (300- ciclos)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Secuenciador de Escritorio</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Kit de ARN Total Trenzado con RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Oligo de bloqueo universal - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Oligo de bloqueo universal - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Oligo de bloqueo universal - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; XP - Perlas de purificación PCR&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg; M-270 Streptavidin</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT ADN humano, grado fluorométrico, 1 mg</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; Tubos de ensayo&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; Hibridación EZ y kits de lavado&nbsp; (24 o 96 reacciones)</td><td>Roche NimbleGen&nbsp;</td><td>05634261001 o 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; 2.0 Fluorómetro&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x Solución TE)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade; Termociclador con 96&ndash; Módulo de rección rápida de pozos</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Kits de hibridación y lavado Roche</td><td>Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Transcripción inversa 200 U/&#956; l</td><td>Tecnologías de la vida</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de cinta de ARN</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de muestra RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Estreptavidina T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 LADO CADA UNO Life</td><td>Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini baño seco</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reactivos</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

la secuenciación de arn dirigidos ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

la secuenciación de ARN (RNAseq) es un método versátil que puede ser utilizado para detectar y caracterizar la expresión génica, las mutaciones, las fusiones de genes, y noncoding RNAs. Estándar RNAseq requiere 30 - 100 millones de secuenciación lee y puede incluir varios productos de ARN como ARNm y ARN no codificantes. Demostramos cómo orientar las RNAseq (captura) permite un estudio centrado en productos de ARN seleccionados utilizando un secuenciador de escritorio. captura RNAseq puede caracterizar transcripciones anotadas, bajas, o expresado de forma transitoria que de otra manera no pueden ser detectados usando métodos tradicionales RNAseq. Aquí se describe la extracción de ARN a partir de líneas celulares, el agotamiento de ARN ribosomal, síntesis de ADNc, la preparación de bibliotecas de código de barras, la hibridación y la captura de las transcripciones específicas y la secuencia multiplex en un secuenciador de escritorio. También describimos la tubería análisis computacional, lo que incluye la evaluación del control de calidad, la alineación, la detección de la fusión, la cuantificación de la expresión génica y la identificación de un solo nucleotide variantes. Este ensayo permite la secuenciación de transcripción específico para caracterizar la expresión génica, fusiones de genes, y las mutaciones.

A destacando esquemática pasos clave en Capture RNAseq se muestra en la Figura 1. Cuatro líneas celulares de cáncer con mutaciones conocidas se utilizaron para demostrar la eficacia de la técnica de RNAseq Capture (K562 con la fusión ABL1, LC2 con la fusión RET, EOL1 con la fusión PDGFRalpha y RT- 4 con la fusión FGFR3). Las cuatro muestras se agruparon y se secuenciaron con 2x 100 pb lee en un secuenciador de escritorio, que genera ar...

Describimos un método basado en la secuenciación de ARN dirigido que incluye la preparación de bibliotecas de ADNc indexadas, hibridación y captura con sondas personalizadas y análisis de datos para interrogar transcripciones seleccionadas para la expresión génica, mutaciones y fusiones de genes. Targeted RNAseq permite una evaluación rápida y rentable de transcripciones seleccionadas en un secuenciador de escritorio.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

El objetivo general de este ensayo es enriquecer los transcritos diana para la secuenciación de próxima generación. Este ensayo de secuenciación dirigida de ARN es un procedimiento de múltiples pasos que comienza con el agotamiento de ARN ribosómico del ARN total, seguido por la fragmentación química y la síntesis de ADN complementario, la preparación de bibliotecas con códigos de barras, la hibridación y captura de los transcritos diana, la secuenciación multiplexada y finaliza con el análisis de datos. Este video demostrará los procedimientos de hibridación, captura del blanco y amplificación por PCR posterior a la captura para cuatro muestras.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología molecular, como la identificación de fusiones génicas, variaciones de nucleótido único, expresión génica relativa y empalme alternativo que involucran transcritos diana. La principal ventaja de esta técnica es que puede personalizarse para cualquier gen de interés. Para comenzar el procedimiento de hibridación, retire del congelador a 20 grados Celsius y descongele sobre hielo lo siguiente: sondas hidratadas personalizadas, ADN Cot-1, oligonucleótidos bloqueadores universales y oligonucleótidos bloqueadores específicos de adaptador.En un tubo de baja unión de 1,5 mililitros, combine 500 nanogramos de muestras de ADN, 5 microlitros de ADN Cot-1, un microlitro de oligonucleótidos bloqueadores universales, 0,5 microlitros de oligonucleótidos bloqueadores específicos del adaptador de seis nucleótidos y 0,5 microlitros de oligonucleótidos bloqueadores específicos del adaptador de ocho nucleótidos. Coloque el tubo de muestra en un concentrador al vacío con la tapa abierta y orientada en dirección opuesta a la rotación. Seque el contenido a 45 grados Celsius durante 20 minutos, o hasta la evaporación completa del líquido.A continuación, resuspenda el contenido seco con 8,5 µL de tampón de hibridación 2x, 3,4 µL del componente de hibridación A y 1,1 µL de agua libre de nucleasas. Deje reposar durante 10 minutos para la resuspensión, agitando en vórtex cada 2,5 minutos. Transfiera el material resuspendido a un tubo PCR de 0,2 mL e incube en un termociclador a 95 grados Celsius durante 10 minutos.Retire el tubo de muestra de hibridación del ciclador térmico y agregue dos microlitros de sondas personalizadas resuspendidas a una concentración de 1,5 picomoles por microlitro. Incube la reacción de hibridación durante toda la noche a 65 grados Celsius. El siguiente paso después de la hibridación multiplexada es la captura del ARN diana utilizando perlas paramagnéticas acopladas a estreptavidina.Retire un frasco de perlas de cuatro grados Celsius y equilibre a temperatura ambiente durante 30 minutos. Prepare soluciones de trabajo 1x de todos los tampones necesarios. Aliquote 140 microlitros de tampón de lavado 1x en un tubo fresco de 1,5 mililitros.Caliente este tampón alícuota y la cantidad total de tampón 1x estricto a 65 grados Celsius en un bloque térmico durante al menos dos horas. Aliquote la cantidad adecuada de perlas en un tubo de 1,5 mililitros. Coloque en el soporte de separación magnética y deseche el sobrenadante.Añada tampón de lavado de perlas y vortexee durante 10 segundos. Coloque el tubo en el soporte de separación magnética durante dos a cinco minutos o hasta que el sobrenadante esté claro. Deseche el sobrenadante.Repita un total de dos lavados. Después de eliminar el tampón de lavado de las perlas, agregue un volumen igual de tampón de lavado de perlas al volumen inicial de partida. Resuspenda y transfiera a un tubo PCR de 0,2 mililitros.Coloque el tubo en el soporte magnético durante dos a cinco minutos o hasta que el sobrenadante esté claro. Deseche el sobrenadante. Coloque el tubo con las perlas en un bloque térmico mini a 65 grados Celsius.Transfiera la muestra de hibridación al tubo con perlas, aspire y expulse con la pipeta 10 veces para mezclar e incube a 65 grados Celsius durante 45 minutos. Cada 15 minutos, agite la muestra en vórtex y centrifugue durante cuatro segundos utilizando una mini centrifugadora de banco con velocidad fija. Cuando finalice la incubación de 45 minutos, retire el tubo de captura del bloque térmico.Añada 100 microlitros de tampón de lavado 1x precalentado al tubo, luego vortexee durante 10 segundos para mezclar. Transfiera la mezcla a un tubo nuevo de baja unión de 1,5 mililitros. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere de dos a cinco minutos para la separación, o hasta que el sobrenadante esté claro.Deseche el sobrenadante. Añada 200 microlitros de tampón de lavado estricto 1x precalentado y aspire y expulse 10 veces para mezclar. Incube a 65 grados Celsius durante cinco minutos.Coloque el tubo en el soporte magnético y espere de dos a tres minutos para que se produzca la separación. Deseche el sobrenadante. Repita el lavado estricto una vez, para un total de dos lavados.Añada 200 microlitros de tampón de lavado 1x a temperatura ambiente y vortexee durante dos minutos para mezclar. Coloque el tubo en el soporte magnético, espere de dos a cinco minutos para la separación y deseche el sobrenadante. Añada 200 microlitros de tampón de lavado 1x a temperatura ambiente y vortexee durante un minuto para mezclar.Coloque el tubo en la gradilla de separación magnética durante dos a cinco minutos y luego deseche el sobrenadante. Añada 200 microlitros de tampón de lavado 1x a temperatura ambiente y mezcle mediante vortex durante 30 segundos. Coloque el tubo en la gradilla de separación magnética durante dos a cinco minutos y luego deseche el sobrenadante.Por último, retire el tubo del soporte de separación magnética y agregue 20 microlitros de agua libre de nucleasas para resuspender los gránulos. Mezcle bien pipeteando arriba y abajo 10 veces. Antes de preparar la amplificación por PCR posterior a la captura, retire los gránulos paramagnéticos de cuatro grados Celsius y equilibre a temperatura ambiente durante 30 minutos.Saque la mezcla preparada para PCR con inicio en frío 2x y la mezcla de cebadores para PCR del congelador a 20 grados Celsius, déjelos descongelar a temperatura ambiente y luego colóquelos sobre hielo. Prepare una mezcla maestra de amplificación de biblioteca combinando 27,5 microlitros de mezcla preparada para PCR con inicio en frío 2x, 2,75 microlitros del cebador uno para PCR y 2,75 microlitros del cebador dos para PCR. Monte la reacción en un tubo de PCR añadiendo 20 microlitros de perlas más ADN capturado con 30 microlitros de la mezcla maestra de amplificación de biblioteca.Cierre adecuadamente el tubo y mezcle mediante vortex. Centrifugue el tubo durante cuatro segundos utilizando una centrifugadora miniatura de velocidad fija a seis veces la gravedad. Coloque el tubo en el termociclador e inicie la amplificación por PCR utilizando el siguiente programa de PCR: una desnaturalización inicial a 98 grados Celsius durante 45 segundos, 10 a 12 ciclos de desnaturalización a 98 grados Celsius durante 15 segundos, hibridación a 65 grados Celsius durante 30 segundos y extensión a 72 grados Celsius durante 60 segundos.Un ciclo final de extensión a 75 grados Celsius durante 60 segundos y mantener a cuatro grados Celsius. Cuando la PCR haya finalizado, retire la muestra del ciclador térmico. Añada 75 microlitros de perlas paramagnéticas, mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.Coloque el tubo en el soporte magnético a temperatura ambiente durante dos o tres minutos y luego retire el sobrenadante. Lave las perlas en el imán añadiendo 200 microlitros de etanol al 80 por ciento, incube durante 30 segundos y luego retire el sobrenadante. Repita para un total de dos lavados.Después de eliminar el sobrenadante del segundo lavado con etanol, incubar a temperatura ambiente durante cinco a diez minutos para permitir que las perlas se sequen, pero no secarlas en exceso hasta que se agrieten. Suspender nuevamente las perlas en 22 microlitros de Tris-EDTA pH 8.0 y dejar durante tres minutos para la elución. Colocar la muestra sobre el imán durante tres a cinco minutos.Por último, transfiera 20 microlitros del producto eluido a un tubo nuevo de baja unión de 1,5 mililitros, asegurándose de que no se arrastren perlas. Una comparación de la expresión génica entre el método de captura y la secuenciación de ARN no dirigida en cuatro líneas celulares cancerosas reveló que el método de captura enriqueció los genes diana, mostrados en azul, entre 10 y 1000 veces más que los genes no dirigidos, mostrados en gris. Además, el porcentaje de lecturas que se alinearon a las regiones diana aumentó en las bibliotecas de secuenciación de ARN con captura en comparación con las bibliotecas no dirigidas.Una evaluación de las medidas de control de calidad mostró que la captura y la secuenciación de ARN no dirigida tienen un desempeño similar en cuanto a la alineación con el transcriptoma y el tamaño principal del inserto. Mediante el método de captura, se secuenció un porcentaje mayor de regiones exónicas y un porcentaje menor de regiones intrónicas. Como era de esperar, la secuenciación de ARN no dirigida generó más de 50 veces más lecturas totales de secuenciación por muestra que la captura.Mediante el método de captura, el porcentaje de secuencias de ARN ribosómico presentes en cada muestra fue menor. Finalmente, las comparaciones de variantes de un solo nucleótido identificadas en regiones solapadas de la secuenciación por captura y de ARN, para cada una de las cuatro líneas celulares, demuestran una alta concordancia de la varianza entre la secuenciación por captura y la de ARN dentro de la región diana. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro días si se lleva a cabo adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar rápidamente durante la captura de los objetivos hibridados y asegurarse de que la reacción se mantenga a 65 grados centígrados. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología molecular estudiaran transcripciones de interés de manera de alto rendimiento y rentable.

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Biología

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