Name: Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprende el ensayo de franjas para evaluar la atracción o repulsión de neuronas del hipocampo disociadas por moléculas guía. Este método permite visualizar múltiples conos de crecimiento simultáneamente.

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Este trabajo fue apoyado por Grants-in-Aid for Scientific Research de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (23700412, 25122707 y 26670090 a S.Y.).

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu. 1. Preparación de Matrices <ol><li> Hervir 4-8 matrices de silicona en el microondas o en una placa caliente durante 5 minutos y dejar que se sequen por completo durante 1 hora bajo flujo laminar (lado rayado). Nota: Los siguientes procedimientos deben realizarse bajo flujo laminar. </li><li> Golpe de aire comprimido o utilizar cinta adhesiva transparente para eliminar el polvo de la parte rayada de las matrices. Mantenga el lado rayado limpia para que pueda adherirse firmemente a la superficie de la placa. </li><li> Con cuidado, coloque las matrices en placas de plástico de 6 cm presionando con un dedo (una matriz por plato, con el lado de la raya hacia abajo). Evite que las burbujas de aire entre la matriz y el plato. Marque la ubicación de las rayas en el lado inferior de la placa de cultivo. </li><li> Si la matriz no se acopla, repita desde el paso 1.2. </li></ol>2. Generación de la raya y laminina Revestimiento de Neurona Cultura <ol><li> Preparar proteína recombinante marcada con fluorescencia (25 l cada uno por inyección [etapa 2.2] o 100 l cada uno para el método de colocación [etapa 2.2.1]) mediante la mezcla de la proteína Fc de etiquetado (10 a 50 mg / ml) y una de tinte fluorescente anticuerpo conjugado anti-Fc humano (1-3 ratio: 30-150 mg / ml) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). A continuación, se incuba la mezcla durante 30 min a TA. </li><li> Usando una jeringa de 22-G, inyectar 25 l de la proteína recombinante preparado en la etapa anterior (2,1) a través del pequeño orificio en el lado de la matriz (las flechas en la Figura 1A, 1C y 1E). <ol><li> Alternativamente, colocar 100 l de la proteína recombinante en la ranura superior de la matriz y el aspirado aproximadamente la mitad de la solución desde el pequeño agujero (flechas en la Figura 1A, 1C y 1E), de modo que la proteína recombinante permanece en las regiones rayadas. </li></ol></li><li> Incubar la placa durante 30 millasn a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular. </li><li> Coloque 300 l de PBS en la ranura superior (Figura 1B) y aspirado desde el pequeño orificio situado en el lado de la matriz (flechas en la Figura 1A, C y E) para eliminar las proteínas no unidas recombinantes. No aspirar el PBS por completo, debido a que las proteínas se secarán. Repita este paso dos veces. (3 veces en total) </li><li> Retire cuidadosamente la matriz e inmediatamente colocar ~ 100 l de proteína de control (10 a 50 g / ml; Fc) para cubrir toda el área de rayas, la creación de un revestimiento alternativo. A continuación, se incuba la placa durante 30 min a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular. </li><li> Después de lavar la superficie del plato tres veces con PBS, capa con ~ 100 l de 20 mg / ml de laminina en PBS. Nota: La laminina se debe descongelar en hielo para evitar la solidificación. </li><li> Incubar la placa durante 1 h a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular. </li><li> Lavar la superficie del plato tres veces con PBS y añadir la cultura medium. Coloque el plato cubierto con medio de cultivo en un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C hasta su uso. </li></ol> 3. El cultivo de las neuronas del hipocampo E15.5 embriones de ratón <ol><li> La eutanasia madre a través de la dislocación cervical y aislar tres embriones E15.5. </li><li> Cortar la piel y el cráneo sagital en la línea media de la cabeza con unas tijeras, y retirar el cerebro usando una cuchara pequeña. Transferir el cerebro cuidadosamente a una placa de Petri de 60 mm que contiene 3 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS). </li><li> El uso de un bisturí, cortar los hemisferios incluyendo la corteza, el hipocampo y el cuerpo estriado (Figura 2A). Entonces, diseccionar la región del hipocampo eliminando cuidadosamente las meninges, y transferir los tejidos de hipocampo disecados a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 2 ml de solución de HBSS, en el hielo (Figura 2B-C). Recoger 6 hipocampos a partir de 3 embriones en el tubo, que son suficientes para el cultivo de las neuronas en 8 platos. </li><li> Reemplazar el Hsolución BSS con solución de tripsina / EDTA (2 ml) y se incuba el tubo a 37 ° C durante 15 min en un baño de agua. Nota: Aspirar HBSS sin centrifugación y no decantar la solución de HBSS por la inclinación del tubo. </li><li> Neutralizar la actividad de la tripsina mediante la adición de 500 l de suero bovino fetal (FBS). </li><li> Centrifugar la mezcla a 100 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento con 2 ml de medio de cultivo. Repita este paso una vez más. </li><li> Pipetear los hipocampos arriba y hacia abajo 10 veces en medio de cultivo utilizando una punta de 1.000 l con un agujero grande (cut-punta) para disociar el tejido. </li><li> Cambiar a una (sin cortar) de la punta de 1.000 l regular y pipetear el tejido disociado arriba y hacia abajo para obtener una suspensión de una sola célula. </li><li> Se separan las células individuales pasándolos a través de un filtro de células de malla de 80 a 100-m. </li><li> Centrifugar la suspensión de células individuales filtrada a 150 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el pellet (neuronas) en 2 ml de medio de cultivo. </li><li> Contar las células usando un hemocitómetro con tinción con azul de tripano para determinar la densidad y viabilidad. A continuación, la placa de 10.000 neuronas en 150 ml de medio de cultivo para cada conjunto de suspensión stripes.The debe ser cuidadosamente colocada para cubrir toda la región de la raya. </li></ol> 4. Visualización de los cuerpos celulares y axones por la tinción de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-TAU1 <ol><li> Después de 24 h de cultivo, aspirar el medio sin perturbar las células adherentes, y fijar las neuronas con pre-calentado paraformaldehído al 4% (PFA) / 4% de sacarosa / PBS a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Lavar la superficie de la placa 3 veces con PBS. Si lo desea, utilice un bolígrafo de repelente al agua para dibujar un círculo alrededor de la región rayada para disminuir la cantidad de anticuerpo necesaria. </li><li> Permeabilizar las neuronas con 0,3% Triton X-100 / PBS durante 5 min. </li><li> Incubar las neuronas con solución de bloqueo que contiene 3% de suero de burro y 0,1% de Triton X-100 para30 min seguido de incubación con un anticuerpo anti-TAU1 (1: 200) en suero de burro 1% / 0,1% de Triton X-100 / PBS O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar la superficie de la placa 3 veces con PBS. Incubar las neuronas con un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con fluoróforo en 1% de albúmina de suero bovino (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS durante 30 min. </li><li> Lavar la superficie de la placa 3 veces con PBS. Cubrir la región rayada con una cubierta de vidrio de 18 mm x 18 mm con 50 l de solución antifade. evitar las burbujas de aire, que interfieren con la formación de imágenes. </li><li> Obtener imágenes fluorescentes con un microscopio de fluorescencia utilizando el sistema apropiado, por ejemplo, la lente objetivo x10, conjuntos de filtros para GFP y RFP, y tiempo de exposición de 1.000 mseg (Figura 3). </li></ol>

<ol><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Bashaw, G. J., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+axon+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling from axon guidance receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).</li>
<li>Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+the+guidance+of+nerve+growth+by+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1.</a> Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).</li>
<li>Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Activity+Modulates+Growth+Cone+Guidance+by+Diffusible+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors.</a> Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).</li>
<li>Dudanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+a+contribution+of+EphA%3AephrinA+reverse+signaling+to+motor+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance.</a> J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).</li>
<li>Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit2+regulates+attractive+eosinophil+and+repulsive+neutrophil+chemotaxis+through+differential+srGAP1+expression+during+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation.</a> J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).</li>
<li>Ly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSCAM+is+a+netrin+receptor+that+collaborates+with+DCC+in+mediating+turning+responses+to+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1.</a> Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).</li>
<li>Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unc5B+associates+with+LARG+to+mediate+the+action+of+repulsive+guidance+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule.</a> J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).</li>
<li>Egea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+EphA+4+kinase+activity+is+required+for+a+subset+of+axon+guidance+decisions+suggesting+a+key+role+for+receptor+clustering+in+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function.</a> Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Bound+Protein+Gradients+for+Cell+Culture+Fabricated+by+Microfluidic+Networks+and+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing.</a> Sci Signal. , (2007).</li>
<li>Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+submicrometer+features+on+curved+substrates+by+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing.</a> Science. 269 (5224), 664-666 (1995).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+position-specific+properties+of+tectai+cell+membranes+by+retinal+axons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro.</a> Development. 101, 685-696 (1987).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stripe+assay%3A+studying+growth+preference+and+axon+guidance+on+binary+choice+substrates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functional+relevance+of+the+Slit2+homodimerization+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain.</a> EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).</li>
<li>Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+of+ephrin%2FEph+forward+and+reverse+signaling+as+the+driving+force+of+adaptive+topographic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping.</a> Development. 139 (2), 335-345 (2012).</li>
<li>Atapattu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+binding+the+ADAM10+substrate+recognition+domain+inhibit+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function.</a> J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).</li>
<li>Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+interactions+modulate+muscle+satellite+cell+motility+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning.</a> Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT+Structure%3A+Balancing+Repulsion+and+Cell+Adhesion+in+Cortical+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development.</a> Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).</li>
<li>Yamagishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT2+and+FLRT3+act+as+repulsive+guidance+cues+for+Unc5-positive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons.</a> EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un ensayo de banda que utiliza la proteína recombinante y neuronas disociadas del hipocampo de ratones E15.5. Este ensayo permite la observación eficiente de respuestas de repulsión, atractivo, o neutrales de las neuronas a una proteína recombinante de interés colocado en un patrón de rayas. Una ventaja principal de este protocolo es el método simple para la generación de las rayas, en la que la proteína se imprime directamente sobre la superficie de un plato de plástico, en comparación con el mé...

Guía de axones es el proceso mediante el cual las neuronas recién formadas envían axones a su objetivo durante el desarrollo del sistema nervioso 1,2. axones en desarrollo tienen una estructura muy móviles en la punta denominado el cono de crecimiento. El cono de crecimiento detecta señales extracelulares para navegar el camino del axón. Moléculas de guía, como hendidura, semaforina, y efrinas, pueden atraer o repeler los axones en función de su interacción con los receptores adecuados y co-receptores en el axón 1,3,4. Los receptores activados transferir señales al cono de crecimiento que afectan a su organización del citoesqueleto de los movimientos de los axones y el crecimiento de cono. Varios métodos han sido desarrollados para evaluar la acción de las moléculas de atrayentes y repelentes. Quimio-atrayentes y repelentes se pueden administrar en el medio de crecimiento / cultivo con una concentración de gradiente (por ejemplo., La cámara de Dunn o Mu diapositivas) 5,6, en un lugar muy concentrada por micro-pipette (por ejemplo., ensayo de torneado) 7 o a una concentración homogénea mediante la aplicación de baño (por ejemplo., el ensayo de colapso del cono de crecimiento) 8,9. Otros métodos incluyen un ensayo de raya o impresión por microcontacto (μCP), en la que se recubre una quimio-atrayente o repelente en la superficie de una placa como sustrato 10-12. Thestripe ensayo fue desarrollado originalmente por Bonhoeffer y sus colegas en 1987 para analizar la cartografía topográfica en el sistema retino-chick tectal 13. El método original requiere un sistema de vacío para proteínas de la cubierta en las membranas de policarbonato Nucleopore utilizando matrices de rayas y malladas. En versiones posteriores, las proteínas recombinantes fueron impresos directamente sobre la superficie de una placa de cultivo en un patrón de rayas utilizando matrices de silicio estrecha rendija 14,15. Recientemente, varios grupos de investigación han aplicado con éxito este ensayo de franja en el análisis de las actividades de moléculas de orientación axón 16-21. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A continuación, presentamos el protocolo detallado para un ensayo que mide la raya de la atracción o repulsión de moléculas de orientación axón de las neuronas del hipocampo disociadas. Cabe destacar que este método se puede aplicar en el laboratorio mínimamente equipadas. Para este ensayo, se alternan franjas de un sustrato marcado con fluorescencia y una proteína de control se generan en un plato de plástico utilizando una matriz de silicio con rendijas 90-M y recubiertas con laminina. En nuestra demostración, disociados de neuronas del hipocampo de ratones E15.5 se cultivaron en rayas de ectodominio recombinante de fibronectina y rica en leucina proteína transmembrana-2 (FLRT2) y controlar proteína Fc 21 alterna. Después de 24 h de cultivo, tanto los axones y cuerpos celulares de las neuronas estaban fuertemente repelidos de las rayas FLRT2. La tinción con un anticuerpo anti-TAU1 reveló que ~ 90% de las neuronas se distribuyeron en las regiones Fc recubierto, en comparación con ~ 10% en el FLRT2-Fc, lo que indica que FLRT2 tiene una fuerte repulsiónfunción de las neuronas del hipocampo 21.

<table><tbody><tr><td>tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>Violamo&nbsp;</td><td>1-3500-01</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehído (PFA)</td><td>Nacalai</td><td>01954-85</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anticuerpo IgG antihumano de cabra</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey anticuerpo IgG anti-ratón</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21203</td><td>Dilución 1/500</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Tau1</td><td>Dilución de MAB3420 Chemicon</td><td></td><td>1/200</td></tr><tr><td>Antidecoloración</td><td>Thermo Scientific</td><td>P7481</td><td>Se pueden utilizar medios de montaje alternativos</td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504-044</td><td>Dilución 1/50</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>01-2030-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células 100 mmm</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de centrifugación</td><td>Kubota</td><td>2410</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio 18mmx18mm</td><td>Matsunami</td><td>18x18 mm Nº 1</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo DAKO</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td>Se puede utilizar un bolígrafo repelente al agua alternativo</td></tr><tr><td>Bisturí desechable</td><td>Feather</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluoreciente</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Nº 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Dilución 1/100</td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>805N</td><td>calibre 22, 50 uL</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>IgG humana, Fc Fragment</td><td>Jackson</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td>Dilución 1/100</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de plástico, 60 mm</td><td></td><td></td> Matrices de silicona Thermo Scientific 150288 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Disponible y adquirible en Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Punta, 1000 uL</td><td>Watson</td><td>125-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva transparente</td><td>Tesa</td><td>57315</td><td>Se puede utilizar cinta adhesiva alternativa</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Azul tripano, 0.4%</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo</td><td></td><td></td><td>Neurobasal suplementado con B27, GlutaMAX y Penicilina-Estreptomicina.</td></tr></tbody></table>

raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Los axones en crecimiento desarrollan una estructura altamente móvil en su punta, denominada cono de crecimiento. El cono de crecimiento entra en contacto con señales ambientales extracelulares para navegar por el crecimiento axonal. La netrina, la hendidura, el semáfora y las efrinas son moléculas guía conocidas que pueden atraer o repeler axones al unirse a receptores y correceptores en el axón. Los receptores activados inician varias moléculas de señalización en el cono de crecimiento que alteran la estructura y el movimiento de la neurona. Aquí, describimos el protocolo detallado para un ensayo de rayas para evaluar la capacidad de una molécula guía para atraer o repeler neuronas. En este método, las neuronas del hipocampo disociadas de ratones E15.5 se cultivan en placas recubiertas de laminina procesadas con franjas alternas de ectodominio de fibronectina y proteína transmembrana 2 rica en leucina (FLRT2) y proteína de la región cristalizable (Fc) del fragmento de inmunoglobulina G (IgG) de control. Tanto los axones como los cuerpos celulares fueron fuertemente repelidos de las regiones de rayas recubiertas de FLRT2 después de 24 h de cultivo. La inmunotinción con tau1 mostró que ~90% de las neuronas se distribuyeron en las franjas recubiertas de Fc en comparación con las franjas recubiertas de FLRT2-Fc (~10%). Este resultado indica que FLRT2 tiene un fuerte efecto repulsivo sobre estas neuronas. Este poderoso método es aplicable no solo para las neuronas primarias cultivadas, sino también para una variedad de otras células, como los neuroblastos.

Las neuronas del hipocampo disociadas de ratones E15.5 se sembraron y cultivaron durante 24 h en rayas de la etiqueta fluorescente de control de Fc (Figura 3A-C) o FLRT2-Fc (Figura 3D-F) alternando con Fc no marcado control. En ambos casos, las neuronas eran agregados y extendieron sus axones como paquetes. En el mando a rayas Fc / Fc, las neuronas se distribuyeron de manera uniforme en las rayas marcados con fluorescencia y no marcados, y se extendieron...

Las moléculas de guía de axones regulan la migración neuronal y la navegación dirigida del cono de crecimiento. Presentamos un potente método, el ensayo de rayas, para evaluar la capacidad de las moléculas guía para atraer o repeler neuronas. En este protocolo, demostramos el ensayo de rayas mostrando la capacidad de FLRT2 para repeler neuronas del hipocampo cultivadas.

Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

El objetivo general del ensayo de franjas es evaluar la capacidad de proteínas específicas, como las moléculas de orientación, para atraer o repeler neuronas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la guía axonal, tales como, cómo las neuronas pueden migrar o extender sus axones en respuesta al entorno celular externo. La principal ventaja de esta técnica es que se puede visualizar un gran número de neuronas en un solo experimento y se pueden analizar muchos conos de crecimiento simultáneamente.Como preparación, hierva cuatro a ocho matrices de silicona en agua durante cinco minutos. Deje que sequen completamente al aire bajo una campana de flujo laminar con sus lados rayados hacia arriba. Esto tarda aproximadamente una hora.Continúe trabajando bajo la campana. Utilice aire comprimido o cinta adhesiva para eliminar cualquier polvo en el lado rayado de las matrices. Luego, coloque cuidadosamente cada matriz en un plato de plástico separado de seis centímetros, con el lado rayado hacia abajo.Con un dedo, presione firmemente cada matriz. Evite atrapar burbujas de aire entre la matriz y la placa. Si la matriz no se adhiere, repita el proceso.Una vez fijas,

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Este video muestra un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos neuronales primarios del hipocampo. Este enfoque permite la observación de poblaciones de receptores tanto en el plasma como en las membranas internas. La discriminación entre estos subconjuntos se logra marcando los receptores antes y después de la permeabilización de la membrana, utilizando el mismo anticuerpo primario pero anticuerpos secundarios conjugados con...

Una técnica in vitro para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en las neuronas del hipocampo

Este video muestra un método para evaluar la actividad de las proteínas utilizando neuronas del hipocampo sobre zonas de proteínas con patrones. Las neuronas exhiben repulsión en las zonas de proteínas de prueba y unión en las zonas de proteínas de control, lo que pone de manifiesto los efectos de la actividad de proteínas atractivas o repulsivas.

Evaluación de la actividad atractiva o repulsiva de las proteínas mediante neuronas del hipocampo

La adición de palmitato reversible a las proteínas es un importante regulador de tráfico intracelular de proteínas. Esto es de particular interés en las neuronas donde muchas proteínas sinápticas se palmitoilada. Nosotros utilizamos un método simple bioquímico para detectar proteínas palmitoiladas en las neuronas cultivadas, que pueden ser adaptados para múltiples tipos de células y tejidos.

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

Se describe un método para etiquetar proteína en la superficie de neuronas vivas usando un anticuerpo policlonal específico para epítopos extracelulares. La proteína unida por el anticuerpo en la superficie celular y, posteriormente, internalizado a través de la endocitosis se puede distinguir de la proteína restante en, o de trata a, la superficie durante la incubación.

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

Proporcionamos un protocolo detallado para la inducción de la potenciación a largo plazo en la región CA1 del hipocampo y el posterior aislamiento de fracciones enriquecidas nucleares de la zona de tetanized de la rodaja. Este enfoque puede ser utilizado para determinar la actividad de importación nuclear dependiente de proteína en modelos celulares de aprendizaje y memoria.

Aislamiento de CA1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente Nuclear importación de proteínas mensajeras Synapto nucleares

Endocitosis de vesículas sinápticas se detectan por microscopia ligera de pHluorin fusionado con la proteína de la vesícula sináptica y por microscopia electrónica de la absorción de la vesícula.

Medición de endocitosis vesícula sináptica en neuronas Hippocampal cultivadas

Puede modular la excitabilidad neuronal a través de un proceso dinámico de endo - y exocitosis de los receptores de glutamato ionotrópicos excitadores. Se describe aquí es un análisis accesible, de alto contenido para la cuantificación del receptor de superficie e interno población piscinas.

Un análisis de contenido de alta para seguimiento AMPA del Receptor de tráfico

En este protocolo, introducimos un método para purificar la fracción dendrítica rica en filopodia a partir de la estructura de protrusión phagocítica similar a la copa en las neuronas del hipocampo cultivadas aprovechando la afinidad específica y fuerte entre un filopodial dendrítico molécula de adhesión, TLCN, y una molécula de matriz extracelular, vitroctina.

Purificación de la fracción defípoda dendrítica

Este artículo presenta un método para estudiar el tráfico de receptores de glutamato (GluR) en cultivos hipocampales primarios disociados. Utilizando un enfoque de alimentación de anticuerpos para etiquetar receptores endógenos o sobreexpresados en combinación con enfoques farmacológicos, este método permite la identificación de mecanismos moleculares que regulan la expresión superficial de GluR modulando procesos de internalización o reciclaje.

Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados

Presentamos un protocolo para etiquetar y analizar las neuronas piramidales, que es fundamental para evaluar posibles alteraciones morfológicas en neuronas y espinas dendríticas que pueden subyacen a anomalías neuroquímicas y conductuales.

Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

Aquí, demostramos cómo combinar la transfección de neuronas primarias de roedores del hipocampo con imágenes confocales de células vivas para analizar los efectos patológicos inducidos por proteínas en el transporte axonal e identificar las vías mecanicistas que median estos efectos.

Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

Aprende el ensayo de franjas para evaluar la atracción o repulsión de neuronas del hipocampo disociadas por moléculas guía. Este método permite visualizar múltiples conos de crecimiento simultáneamente.

Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas (Video) | JoVE Journal

Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas

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