Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas

El objetivo general del ensayo de franjas es evaluar la capacidad de proteínas específicas, como las moléculas de orientación, para atraer o repeler neuronas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la guía axonal, tales como, cómo las neuronas pueden migrar o extender sus axones en respuesta al entorno celular externo. La principal ventaja de esta técnica es que se puede visualizar un gran número de neuronas en un solo experimento y se pueden analizar muchos conos de crecimiento simultáneamente.

Como preparación, hierva cuatro a ocho matrices de silicona en agua durante cinco minutos. Deje que sequen completamente al aire bajo una campana de flujo laminar con sus lados rayados hacia arriba. Esto tarda aproximadamente una hora.

Continúe trabajando bajo la campana. Utilice aire comprimido o cinta adhesiva para eliminar cualquier polvo en el lado rayado de las matrices. Luego, coloque cuidadosamente cada matriz en un plato de plástico separado de seis centímetros, con el lado rayado hacia abajo.

Con un dedo, presione firmemente cada matriz. Evite atrapar burbujas de aire entre la matriz y la placa. Si la matriz no se adhiere, repita el proceso.

Una vez fijas, marque la ubicación de las franjas en la cara inferior de la placa de cultivo. Prepare las proteínas recombinantes marcadas con fluorescencia en PBS. Prepare 25 microlitros para cada placa con franjas.

Deje que la mezcla incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, para cada placa, cargue una jeringa de calibre 22 con 25 microlitros de proteína diluida e inyéctela a través del pequeño orificio en el lateral de la matriz. Evite la inyección de burbujas de aire en las matrices, ya que interferirán con la unión de sus proteínas a las placas.

Ahora, incubar los cultivos durante 30 minutos a 37 grados Celsius en una incubadora de cultivo celular. Después de la incubación, depositar 300 microlitros de PBS en la ranura superior de cada matriz. Luego, aspirar el PBS desde un pequeño orificio ubicado en el lateral de cada matriz para eliminar todas las proteínas recombinantes no unidas.

No aspire completamente el PBS porque las proteínas se secarán. Realice este enjuague con PBS un total de tres veces. A continuación, retire cuidadosamente la matriz de cada placa.

Luego, agregue inmediatamente aproximadamente 100 microlitros de proteína controlada sobre toda el área rayada, creando un recubrimiento alternativo en cada placa. A continuación, incube las placas durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Mientras tanto, sobre hielo, descongele laminina y PBS a 20 microgramos por mililitro.

Después de 30 minutos, lave los pocillos tres veces con PBS. A continuación, recubra cada pocillo con aproximadamente 100 microlitros de laminina fría y devuélvalos al incubador durante otra hora. Una hora después, use PBS para lavar los pocillos tres veces más.

Después del tercer lavado, agregue aproximadamente 150 microlitros de medio de cultivo a cada placa. Luego incube las placas en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius hasta que sean necesarias nuevamente. Después de sacrificar un ratón donante E15.5, corte la piel y el cráneo sagitalmente en la línea media de la cabeza con tijeras quirúrgicas y extraiga el cerebro utilizando una espátula microscópica.

Transfiera cuidadosamente el cerebro a una placa de Petri de 60 mililitros que contenga tres mililitros de HBSS. En la placa, use un escalpelo para extraer los hemisferios incluyendo la corteza, el hipocampo y el estriado. Luego, diseccione las regiones hipocampales removiendo cuidadosamente las meninges.

Transfiera los tejidos de hipocampo diseccionados a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga dos mililitros de solución HBSS sobre hielo. Seis hipocampos de tres embriones son suficientes para cultivar neuronas en ocho placas. Una vez recolectados todos los tejidos de hipocampo, aspire la HBSS y réemplacela con dos mililitros de tripsina-EDTA.

A continuación, incubar el tubo durante 15 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius. Luego, neutralizar la actividad de la tripsina añadiendo 500 microlitros de suero bovino fetal. A continuación, centrifugar la mezcla a 100 Gs durante cinco minutos.

Elimine el sobrenadante y lave el sedimento con dos mililitros de medio de cultivo. Luego, centrifugue la mezcla nuevamente y reemplace el medio por más medio. Ahora, disocie el tejido mediante trituración suave usando una pipeta de un mililitro con la punta cortada.

Desplace los tejidos hacia arriba y hacia abajo a través de la punta del pipeteo aproximadamente 10 veces. Luego, utilice una punta de un mililitro sin cortar y repita la trituración para obtener una suspensión de células individuales. Ahora, aísle las células individuales presionando la suspensión a través de un filtro celular de malla de 80 a 100 micrones.

Luego, centrifugue la suspensión filtrada a 150 G durante cinco minutos, aspire el sobrenadante y re-suspenda el sedimento en dos mililitros de medio de cultivo. Cuente las células utilizando un hemocitómetro y siembre 10.000 neuronas en 150 microlitros de medio de cultivo sobre cada placa con rayas preparada. Deposite cuidadosamente la suspensión para cubrir completamente toda la región rayada.

Se sembraron neuronas hipocampales disociadas de ratones E15.5 y se cultivaron durante 24 horas sobre franjas de la proteína de control marcada con fluorescencia FC, o bien se sembraron sobre franjas alternadas de FLRT2 FC y FC de control sin marcar. En ambos casos, las neuronas se agregaron y extendieron sus axones en haces. Sobre el control FC, las neuronas se distribuyeron uniformemente y extendieron sus axones en direcciones aleatorias. En contraste, cuando se cultivaron con franjas de FLRT2 FC, los axones evitaron crecer sobre las regiones de FLRT2 FC.

Por lo tanto, los axones en crecimiento se extendieron principalmente sobre las franjas de FC. Una mayor magnificación muestra que los axones crecieron a lo largo del borde con las franjas de FC de FLRT2, pero no se extendieron hacia el territorio de FLRT2. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear una alfombra rayada de las proteínas recomendadas y evaluar la actividad atractiva o repulsiva utilizando neuronas del hipocampo disociadas.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco horas si se lleva a cabo correctamente.