Ingeniería de tejidos por intrínseca Vascularización en una En Vivo Cámara Ingeniería de Tejidos

El objetivo general de este procedimiento es crear un espacio donde el tejido pueda crecer y expandirse concomitantemente con el desarrollo de un suministro de sangre robusto, lo que en última instancia conduce a la generación de un bloque de tejido vascularizado, grande y tridimensional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la ingeniería de tejido vascularizado con fines reconstructivos, así como para el reemplazo y reparación de órganos. La principal ventaja de esta técnica es que el tejido recién generado es intrínsecamente abastecido por su propia red vascular sin tener que depender de la difusión desde el medio ambiente para sobrevivir.

Las que demuestren el procedimiento serán Sue McKay y Liliana Pepe. Anestesiar a una rata que pesa al menos 250 gramos y evaluar la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie. Si la rata no responde, mantenga su sedación con isoflurano al 2% durante todo el procedimiento.

A continuación, aplique una pomada epsómica en los ojos. Luego, con la rata en decúbito supino, use maquinillas de afeitar eléctricas para afeitar la ingle y eliminar el vello con una gasa humedecida. Luego, limpie los sitios quirúrgicos con una solución de clorhexidina que contenga 70% de etanol.

Finalmente, cubra al animal con toallas estériles y proceda con la cirugía. Con una cuchilla número 15, haga una incisión cutánea de cuatro centímetros de largo en la ingle izquierda paralela al ligamento inguinal. A continuación, corte la almohadilla de grasa inguinal expuesta circunferencialmente con unas tijeras, dejándola unida a su pedículo vascular, en función de los vasos epigástricos.

Ahora, con microtijeras, libere las adherencias del tejido conectivo entre la pared abdominal y los vasos femorales subyacentes. A continuación, se coloca un retractor en la pared abdominal y se tira de él medialmente para exponer el ligamento inguinal y toda la longitud de los vasos femorales. A continuación, con micropinzas y tijeras curvas, disecciona la vena epigástrica y aísla de la grasa circundante.

Esta vena funcionará como una correa. Proceda abriendo la vaina perivascular que contiene los vasos femorales y el nervio. Ábrelo desde el ligamento inguinal hasta su bifurcación distal a la rama epigástrica.

En este punto, y a lo largo de todo el procedimiento, es fundamental un manejo suave de los vasos femorales. Su daño puede provocar trombosis y el fracaso de todo el experimento. Luego, con micropinzas, recoja la vena femoral por su adventicia y sepárela suavemente de los tejidos circundantes y de la arteria que la acompaña.

Durante este paso, no agarre todo el grosor de la pared de la vena, lo que podría causar un traumatismo en la íntima, lo que hace que la vena sea propensa a la trombosis. También durante este paso, ligar las ramas laterales con una sutura de nailon 10-0 o coagularlas con un coagulador bipolar. Con la vena femoral completamente libre, ligarla proximal y distalmente con suturas de seda 4-0 para obtener un injerto venoso de al menos 10 milímetros de largo, que incluye aproximadamente medio centímetro de longitud de la rama epigástrica.

La rama funciona como una correa de cuerda para mantener el lazo abierto en la cámara. A continuación, recorte la adventicia de los extremos del injerto. Si es necesario, este paso puede posponerse antes de las anastomosis microquirúrgicas.

Termine de preparar el injerto venoso enjuagándolo con solución salina heparinizada y dejándolo reposar cargado con solución salina heparinizada. A continuación, cierre la herida con una sutura de seda 4-0 de funcionamiento continuo y dos o tres puntos simples interrumpidos adicionales. Para empezar, exponer el ligamento inguinal y toda la longitud del vaso femoral de la extremidad contralateral como se ha demostrado anteriormente.

Luego, usando micropinzas, diseccione y aísle tanto la arteria epigástrica como la vena de la almohadilla de grasa circundante. Sea cuidadoso al separar el tejido de los vasos. Continúe recogiendo la arteria femoral por su adventicia y liberándola de los tejidos circundantes.

En este proceso, ligar o coagular las ramas laterales de la arteria. A continuación, coloque una pinza proximalmente tanto en la arteria como en la vena femoral. Ahora, utilizando sutura de seda 4-0, ligar la arteria femoral y la vena distal a la emergencia de los vasos epigástricos.

Ahora coloque un fondo de contraste de plástico estéril debajo de los recipientes y use una microtijera afilada y recta para cortar cada recipiente transversalmente. Una vez cortados, enjuague los vasos vigorosamente con cantidades generosas de solución salina heparinizada hasta que se haya eliminado toda la sangre del lumen. Ahora lleve el injerto de vena al campo operatorio.

Coloque el injerto de vena de modo que el extremo proximal del injerto de vena esté listo para ser anastomosado a la vena femoral receptora y el extremo distal a la arteria femoral receptora. Esto permitirá que la sangre fluya desde el lado arterial al venoso sin resistencia de las válvulas dentro del injerto venoso. Asegúrese de que los vasos femorales y el injerto de vena descansen en su posición natural sin torceduras.

Con sutura de nylon 10-0, realice una anastomosis quirúrgica en ambos lados. Una buena anastomosis microquirúrgica y atraumática es clave. El daño al vaso íntimo, la desecación de los vasos o los puntos de sutura colocados incorrectamente hacen que el sitio anastomótico sea propenso a la formación de trombos.

Luego, verifique si hay fugas en ambos sitios anastomóticos. Resuelva las pequeñas fugas, que parecen sangre no pulsátil que sale del sitio anastomótico, colocando un pequeño trozo de grasa o una esponja encima y comprimiendo suavemente durante cinco a 10 minutos. Las fugas pulsantes más grandes que inundan rápidamente todo el campo necesitarán puntos de sutura adicionales.

A continuación, compruebe la permeabilidad del asa arteriovenosa. La oclusión suave de la arteria femoral debería hacer que se encoja. Por el contrario, la oclusión de la vena femoral debería engrosar el asa.

Ahora coloque la base de la cámara de ingeniería de tejidos debajo del asa arteriovenosa. Asegúrese de que el lazo descanse en su posición natural sin torceduras ni torceduras. Luego, con suturas de nailon 6-0, asegure la base de la cámara al ligamento inguinal y la fascia muscular subyacente.

A continuación, coloque la tapa sobre la base de la cámara. Pellizque las ramas epigástricas debajo del párpado para mantener el asa en su posición. A continuación, cierre la herida con una sutura de seda 4-0 de funcionamiento continuo, más dos o tres puntos simples interrumpidos adicionales.

Por último, permita que el animal se recupere de la anestesia en una jaula individual y administre una dosis única de carprofeno por vía subcutánea como analgésico. Prepare al animal para la cirugía como antes. Se pueden implantar dos cámaras en una sola rata, una en cada ingle.

A continuación, aísle el vaso femoral como se ha descrito anteriormente. Con la arteria y la vena completamente liberadas de los tejidos circundantes y sus ramas ligadas, lleve la cámara al campo operatorio. Luego, coloque cada uno de los vasos femorales intactos en las ranuras correspondientes de la base de la cámara.

Asegúrate de que ninguno de los dos esté retorcido o retorcido. A continuación, cierre la cámara colocando la tapa en la base. A continuación, cierre la herida y deje que el animal se recupere como se ha descrito anteriormente.

La creación microquirúrgica de cámaras de ingeniería tisular se realizó como se describe. Se diseñaron con éxito varios tipos de tejidos utilizando la cámara vascularizada in vivo, que incluyen tejido cardíaco con cardiomiocitos de rata neonatal, tejido muscular con mioblastos esqueléticos de rata y tejido adiposo con hidrogel derivado de la matriz extracelular de tejido adiposo. El sistema de estereología permite una cuantificación no sesgada del volumen específico del tejido.

Por ejemplo, se utilizaron células endoteliales teñidas con lectina en secciones transversales para estimar los volúmenes vasculares. Tras la implantación in vivo de células marcadas con tintes fluorescentes, se puede rastrear su destino. Por ejemplo, se detectaron cardiomiocitos de rata neonata marcados con colorante i en las construcciones de tejido tres días después de la implantación.

Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos específicos de la especie para identificar células implantadas en estudios de xenotransplanación. Por ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas por humanos implantadas en ratas inmunodeprimidas podrían identificarse en el tejido extraído de la cámara. Una vez dominados, la cámara de flujo y el asa arteriovenosa se pueden implantar en aproximadamente 20 y 90 minutos, respectivamente.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener la esterilidad en todo momento y tomar las medidas necesarias en caso de contaminación. No hay que olvidar que la manipulación suave de los vasos sanguíneos y la anastomosis microquirúrgica atraumática son claves para garantizar el éxito. En este sentido, sí recomendamos un entrenamiento microquirúrgico básico antes de intentar este procedimiento, especialmente para la construcción del asa arteriovenosa.