El aislamiento del gigante lampbrush cromosomas de estar ovocitos de ranas y salamandras

El objetivo general de este procedimiento es aislar el núcleo gigante, o vesícula germinal, de un ovocito anfibio, y esparcir los cromosomas de pincel de lámpara y otros orgánulos nucleares en un portaobjetos de microscopio para inmunotinción, hibridación in citu y otras técnicas moleculares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la estructura básica de los cromosomas, nucleolos y otros orgánulos nucleares, así como detalles moleculares de la transcripción, el empalme y la exportación de ARN. La principal ventaja de esta técnica es la facilidad con la que la estructura y la transcripción de los cromosomas pueden ser examinadas por una microscopía óptica convencional, utilizando inmunofluorescencia, hibridación in citu y otras técnicas moleculares.

La Dra. Zehra Nizami, una investigadora postdoctoral de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de preparar todas las soluciones requeridas, ensamble portaobjetos de pozo, compuestos por portaobjetos de vidrio subtitulados, a los que se han unido pozos de plástico con parafina, como se discutió en el protocolo de texto. A continuación, recoja el tejido ovárico previamente recogido de una rana adulta, hembra o una salamandra, y llene una pequeña placa de Petri con medio de cultivo de ovocitos.

Proceda a colocar una porción del tejido aislado, que contiene aproximadamente de 10 a 20 ovocitos, en esta placa. A continuación, identifique un solo ovocito y use dos pares de pinzas de joyero para cortar el tallo que lo conecta a la pared del ovario. Una vez liberado, transfiera el ovocito a una nueva placa de Petri que contenga un medio de aislamiento de vesícula germinal, o GV.

Con un aumento bajo, localice el polo animal del ovocito, que se puede identificar por su coloración oscura. A continuación, utilice unas pinzas para hacer un agujero grande cerca del poste del animal y proceda a exprimir suavemente el núcleo transparente del ovocito, también conocido como GV. A continuación, enrolle la GV lejos de cualquier yema que también se haya extruido. Para eliminar la yema que permanece firmemente adherida, introduzca y extraiga el núcleo de una pipeta con una punta que tenga un diámetro ligeramente mayor que el de la GV. Después de la recolección de una rana GV, transfiérala inmediatamente a un medio de dispersión para evitar el endurecimiento nuclear que interferiría con los pasos posteriores.

A continuación, con dos pares de pinzas, agarre la envoltura nuclear cerca de la parte superior del GV, teniendo cuidado de no presionar hacia abajo. Mientras aún agarra el sobre, proceda a separar las dos pinzas y espere que el contenido del núcleo salga. Para recoger este contenido, primero prepare una pipeta ajustable de 20 microlitros con una punta cortada como se describe en el protocolo de texto.

Luego, desde la placa, se procede a extraer cinco microlitros de líquido de dispersión seguidos de cinco microlitros de la solución con el contenido de GV. Una vez que se haya recogido este contenido, transfiéralo a un portaobjetos lleno de solución de dispersión. Asegúrese de que el líquido en el portaobjetos tenga una superficie convexa para evitar el atrapamiento de burbujas en los pasos posteriores.

A continuación, coloque un cubreobjetos de 18 milímetros sobre el pocillo y coloque el portaobjetos ensamblado en una cámara húmeda durante 10 a 60 minutos. Durante este tiempo, espere que el gel nuclear se disperse lentamente, de modo que los cromosomas y los orgánulos nucleares lleguen a quedar en la superficie del vidrio. Después de extraer un núcleo de un ovocito de salamandra, déjelo en el medio de aislamiento.

Tenga en cuenta que los GV de la salamandra, a diferencia de los de las especies de ranas utilizadas aquí, no se endurecerán indebidamente en esta solución. Retire la envoltura nuclear de la salamandra GV utilizando la misma técnica basada en fórceps que se describe para las ranas. A continuación, recoja el contenido nuclear ligeramente gelificado con una pipeta con una punta cortada y transfiera el gel a una placa de Petri que contenga una solución de dispersión.

Enjuague rápidamente la pipeta en la solución de dispersión y utilícela para recoger el gel nuclear. A continuación, introduzca el gel en un portaobjetos, añada un cubreobjetos y deje que el gel se disperse como se ha descrito anteriormente. A continuación, utilice el contraste de fase para ver el contenido nuclear e identifique los cromosomas del cepillo de lámpara, abreviados como LBC, por su gran tamaño y sus bucles laterales emparejados.

Después de confirmar que los LBC están intactos, prepare el portaobjetos para la centrifugación colocando un trozo de papel de filtro en el cubreobjetos. A continuación, presione hacia abajo para eliminar el exceso de líquido de la cámara. A continuación, agregue vaselina a cada borde del cubreobjetos.

Caliente una varilla de metal a aproximadamente 70 a 80 grados centígrados y úsela para derretir la gelatina y sellar la cubierta en el plástico subyacente. Repita este procedimiento para otros portaobjetos con LBC de buena calidad. Una vez que se hayan colocado todos los cubreobjetos, coloque los portaobjetos en los soportes para la centrifugación y asegúrese de que los soportes opuestos estén equilibrados.

Usando la función de inicio lento, centrifugue los portaobjetos como se describe en el texto usando soportes hechos a medida. Alternativamente, se puede usar una centrífuga de mesa estándar donde los portaobjetos se pegan con cinta adhesiva a una placa y se giran. Para preparar el contenido nuclear para la inmunotinción o la hibridación in citu, primero limpie el sello temporal de vaselina con una cuchilla de afeitar y luego coloque el portaobjetos en la rejilla de un plato de tinción con portaobjetos estándar.

A continuación, agregue suficiente paraformaldehído para cubrir los portaobjetos. Después de la inmersión, use pinzas romas para quitar y desechar cada cubreobjetos. Deje los portaobjetos en fijador durante 15 a 30 minutos.

Después de la fijación, coloque un portaobjetos en un plato de tinción que contenga PBS helado. A continuación, inserta una cuchilla de afeitar afilada en el borde del cuadrado de plástico y haz palanca para que este plástico quede bien suelto. Una vez que se haya repetido este proceso para todas las diapositivas, proceda con la tinción como se discutió en el protocolo de texto.

En esta imagen de iluminación de campo oscuro se muestra el contenido nuclear de un solo ajolote GV en profase de la primera división meiótica, recolectado y preparado utilizando el protocolo descrito. Se observan 14 LBC grandes y emparejados, así como nucleolos amplificados. La tinción adicional de esta preparación, con un anticuerpo contra la ARN polimerasa II fosforilado, que se muestra aquí en verde, revela las ubicaciones de los cuerpos del locus de histonas y también proporciona información sobre la robusta actividad transcripcional de estos cromosomas de ovocitos.

El aumento más alto de un solo ajolote LBC, en este caso uno que ha sido teñido de verde para la ARN polimerasa y azul para el ADN, demuestra la característica morfológica más singular de estos cromosomas. Cientos de bucles laterales emparejados, cada uno de los cuales representa al menos una unidad de transcripción que sintetiza activamente el ARN. La comparación con una rana LBC teñida de manera similar, fotografiada con el mismo aumento, enfatiza la enorme diferencia de tamaño entre los cromosomas de la rana y la salamandra, una diferencia que se correlaciona con el contenido total de ADN de los genomas de las especies utilizadas.

Sin embargo, incluso en el cromosoma de la rana, las unidades de transcripción individuales se pueden ver como bucles de cromatina que se proyectan lateralmente desde el eje cromosómico, como se muestra en esta imagen de mayor aumento. Los ovocitos de peces, aves, reptiles y algunos invertebrados también contienen cromosomas de cepillo de lámpara gigante. Sorprendentemente, los cromosomas del cepillo de lámpara se generan cuando las cabezas de esperma de otros organismos, incluidos los humanos, se inyectan en la vesícula germinal del anfibio.

Una vez que se domina la técnica, se puede preparar un lote de untadores AGV en una hora, y luego centrifugar y fijar dentro de otra una o dos horas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar un GV y esparcir los cromosomas del cepillo de lámpara para un estudio más detallado utilizando sondas moleculares.