Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso

El objetivo general de esta nueva estrategia de aislamiento es ampliar el número de nuevos aislamientos virales con el fin de estudiar el pan-genoma de esta nueva familia viral y comprender mejor sus ecosistemas y su posible patogenicidad para los seres humanos. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la virología, ayudando a los virólogos de todo el mundo interesados en la prospección de virus gigantes, y en particular de los Faustovirus. La principal ventaja de esta técnica es que presenta nuevas mejoras en muchas etapas, como la mezcla de antibióticos y antifúngicos, el nuevo medio de ayuno adaptado para la ameba y el uso de citometría de flujo para una detección más rápida y sensible de la lisis. Después de recolectar muestras de agua contaminada según el protocolo descrito, prepare la célula huésped, V. vermiformis, añadiendo las amebas a un matraz de cultivo celular de 75 centímetros cuadrados con 30 mililitros de medio de proteasa peptona extracto de levadura glucosa, o medio PYG, e incube a 28 grados Celsius durante 48 horas. Utilice láminas de conteo para contar las amebas y, cuando alcancen una concentración de cinco por 10 a la 5ª hasta 10 a la 6ª células por mililitro, recolecte las células mediante centrifugación a 720 veces g durante 10 minutos.

Aspire el sobrenadante y use 30 mililitros de solución salina amebiana estéril de Page o PAS para resuspender el sedimento de amebas. Después de lavar el sedimento una segunda vez, use 30 mililitros de medio de inanición, que contenga un antibiótico y un agente antifúngico, para resuspender las células hasta aproximadamente 10 a la 6ª ameba por mililitro. El medio de inanición permite que las amebas permanezcan vivas sin sufrir enciste o multiplicación.

A continuación, siembre 200 microlitros de amebas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo plano e incube a 30 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, después de agitar las muestras de agua mediante vortex durante un minuto a temperatura ambiente, inocule 25 microlitros de cada muestra sobre las células de amebas, dejando dos pocillos sin muestra como controles negativos. Para evitar la evaporación, coloque la placa que contiene la primo-cultura en una bolsa con una compresa húmeda, y coloque la cámara humedecida con la placa en un incubador a 30 grados Celsius.

Tres días después de la primera inoculación, subcultive la placa de primocultivo en una nueva placa de 96 pocillos con amebas tal como se acaba de demostrar, sin realizar ninguna observación microscópica. Incube a 30 grados Celsius durante tres días. Luego, utilizando la subcultura, inocule una tercera placa como se acaba de describir e incube durante dos días.

Para detectar la lisis en la placa final de co-cultivo, encienda el citómetro y realice una limpieza y enjuague según el protocolo del fabricante para reducir el ruido de fondo. Para realizar una adquisición completamente automatizada de 40 minutos, inicie el muestreador de alto rendimiento o HTS para cargar automáticamente las muestras de la placa de 96 pocillos según el protocolo del fabricante. Configure los parámetros del HTS como se indica aquí: un volumen de muestra de 150 µL, un volumen de mezclado de 50 µL, una velocidad de mezclado de 180, un número de mezclas de 5, un volumen de lavado entre muestras de 400 µL, una velocidad de flujo de 2,5 µL por segundo y un número de eventos registrados de 10 000. Haga clic en inicio para permitir que el HTS detecte o ubique la placa. Luego, evalúe primero los pocillos del control negativo que contienen las células amebas huésped, con el fin de delimitar la población amebiana y determinar el porcentaje celular según sus características físicas. Asegúrese de tener una población amebiana homogénea y una segunda población de eventos más bajos correspondientes a restos celulares y ruido. A continuación, comience el análisis mediante el botón de adquisición de muestra.

Luego, utilizando la flecha, que define las compuertas, localice la población de amebas de interés. Después de seleccionar al menos 10.000 eventos, haga clic en ejecutar para permitir que el HTS ejecute automáticamente toda la placa. Realice la adquisición y el análisis de datos según el parámetro de tamaño dispersión hacia adelante y el parámetro estructural dispersión lateral. Consulte el texto para obtener detalles adicionales.

Tras la detección de la lisis mediante citometría de flujo, pipetee las co-cultivos lisados para suspender las amebas restantes. Después de pipetear 50 microlitros de cada muestra sobre portaobjetos, cito-centrifugue directamente la suspensión a 800 × g durante 10 minutos.

A continuación, utilice metanol puro para fijar los portaobjetos y luego deje que sequen a temperatura ambiente. Después de la fijación, sumerja los portaobjetos en la solución ESN tres veces durante cuatro segundos cada vez, antes de colocarlos en azul de azur durante seis segundos. Finalmente, sumerja los portaobjetos en PBS durante 45 segundos.

Deje que las laminillas sequen a temperatura ambiente antes de proceder a la observación. Para teñir laminillas fijadas nuevas con DAPI, pipetee 15 microlitros de DAPI sobre las laminillas secas. Observe las laminillas bajo un microscopio óptico a un aumento de 1000x para verificar la presencia de fábricas virales.

Para realizar microscopía electrónica, deposite cinco microlitros de la muestra positiva sobre una rejilla sometida a descarga eléctrica, e incube a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Seque cuidadosamente la rejilla, luego agregue una pequeña cantidad de molibdato de amonio al 1 % e incube durante 10 segundos. Después de eliminar cuidadosamente la gota, deje secar la rejilla durante cinco minutos. A continuación, configure el microscopio electrónico a 200 kiloelectrón voltios. Luego, coloque la rejilla en el portaobjetos e introduzca el portaobjetos en el microscopio. Haga clic en el icono de vista general del vacío y verifique el vacío. A continuación, cierre las válvulas, establezca un tamaño de punto de cinco y un aumento de 25.000 antes de comenzar la observación. Tras localizar un virus gigante en la pantalla de adquisición, utilice la herramienta de medición para medir el virus.

Realice la biología molecular y la secuenciación del genoma viral según el protocolo descrito en el texto.

Esta figura muestra los resultados de la detección de dos Faustovirus en comparación con los controles negativos confiables. El control negativo para la lisis contenía una población de amebas del 86%. En contraste, más del 60% de las amebas fueron lisadas, con el mayor porcentaje de detritos en las muestras positivas.

Como se observa aquí, la ESN y la tinción azur azul tiñen los núcleos de las células de amebas no infectadas e infectadas, así como la presencia de fábricas virales dentro de las células infectadas. La tinción con DAPI también confirma la presencia de fábricas virales dentro de las amebas. En estas imágenes, la microscopía electrónica revela la presencia de Faustovirus con la apariencia típica de un mega-virus compuesto por una cápside icosaédrica que carece de fibrillas y tiene un tamaño de 200 nanómetros.

Una vez dominada y tras el cultivo conjunto, esta técnica de detección de lisis y caracterización del virus puede realizarse en una hora, si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar controlar la viabilidad de las amebas y verificar cualquier contaminación probable. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como biología molecular dirigida a virus gigantes, con el fin de responder preguntas adicionales, como la familia viral y/o el genotipo.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la virología exploraran esta familia viral, su huésped específico y su potencial patogenicidad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar fácilmente virus gigantes ampliando el número y los tipos de muestras y seleccionando la mejor célula huésped y las condiciones de cultivo óptimas. No olvide que trabajar con virus potencialmente patógenos para los seres humanos puede ser extremadamente peligroso, especialmente con muestras de aguas residuales.

Por lo tanto, siempre se deben tomar precauciones como trabajar en laboratorios SB2 con condiciones seguras al realizar este procedimiento.