Name: Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso vermiformis Vermamoeba (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprende una estrategia rápida para aislar nuevos Faustovirus de muestras ambientales utilizando Vermamoeba vermiformis como hospedero. Este método mejora la detección de lisis mediante floss-cytometría.

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Los autores no tienen agradecimientos que hacer.

Colección 1. Muestra <ol><li> Recoge 70 muestras de diferentes ambientes y regiones. En este caso, utilice los siguientes: 5 muestras de agua sucia de la localidad de Saint Pierre de Meyzoargues (Francia), 15 muestras del lago en Parc Borély en Marsella (Francia); 15 muestras de agua de mar con los sedimentos de las calas en Samena en Marsella (Francia), 25 muestras de agua del río de los Alpes (Francia), y finalmente, 10 muestras de aguas residuales en La Ciotat (Francia). </li><li> muestras de vórtice para la homogeneización antes de la inoculación, durante un minuto a temperatura ambiente sin ningún tratamiento. </li></ol> Procedimiento 2. Aislamiento <ol><li> Preparación para albergar procedimientos de ciego Cultura y la inoculación de la muestra <ol><li> V. Uso vermiformis (cepa CDC19) como un soporte de células para el co-cultivo. </li><li> Mantener las amebas a 28 ° C, en un 75 cm matraz de cultivo de 2 células con 30 ml de medio de extracto de glucosa-proteasa-peptona-levadura (PYGRAMO). Por favor, compruebe la composición PYG en la Tabla 1. Nota: Después de 48 horas, las amebas se cuantifican mediante un recuento utilizando diapositivas de conteo normales (por ejemplo, Kovaslides). </li><li> Células de la cosecha a una concentración de 5 x 5 10-6 10 células / ml, y pellet amebas por centrifugación a 720 xg durante 10 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el pellet amebas en 30 ml de solución salina estéril amebas de Página (PAS) Tabla 1. Repita este procedimiento de enjuague. </li><li> Vuelva a suspender amebas en 30 ml de medio de inanición con una mezcla de antibióticos y antifúngicos a una concentración de aproximadamente 10 6 amebas / ml. El medio de inanición es un medio de supervivencia para la ameba, lo que le permite mantenerse con vida y sin enquistamiento o multiplicación. Comprobar la composición en la Tabla 1. Nota: La mezcla de agente antimicrobiano contenía 10 mg / ml de vancomicina, 10 mg / ml imipenem, 20 g / ml de ciprofloxacina, 20 μg / ml de doxiciclina, y 20 mg / ml voriconazol. Esta mezcla sirve para reducir la contaminación bacteriana y fúngica que puede disminuir o alterar la multiplicación viral. </li><li> Directamente inocular 25 l de cada muestra en el 200 l monocapa ameba en un fondo plano placa de 96 pocillos que favorece la adherencia ameba y se incuba a 30 ° C en un ambiente húmedo (un ambiente húmedo consiste en colocar una compresa húmeda dentro de la bolsa que contiene el placa con el fin de evitar la evaporación). Este es el primo-cultura. Dejar dos pozos de amebas sin ninguna inoculación de la muestra; esto actúa como el control negativo. Incubar este primo-cultivo durante tres días. </li><li> Tres días después de la primera inoculación, sub-cultivo de la placa primo-cultura en amebas fresco como se describe anteriormente sin ninguna observación microscópica. Incubar la nueva placa durante tres días en las mismas condiciones que el primo-cultura. </li><li> Realizar el cultivo final después de estos tres días de incubación de la misma manera como para THe primo- y sub-cultura. Incubar el cultivo final durante dos días. A continuación, proceder a la detección. </li></ol></li><li> La detección de la lisis por Automated Citometría de Flujo Nota: la cultura Ciegos junto con el flujo de citometría difiere del sistema anterior estándar de aislamiento. Es más sensible, preciso y automatizado. Para propósitos de detección, se aplicó una nueva técnica desarrollada para detectar lisis a la velocidad más alta y sin observación microscópica. Esta técnica es ventajosa para las muestras de cribado y tiene una mejor sensibilidad que las técnicas más antiguas. 7-9 <ol><li> Utilice la placa de 96 pocillos de la final de co-cultivo para detectar la lisis. </li><li> Encienda el citómetro y ejecutar un ciclo de limpieza y aclarado con el fin de obtener menor ruido de fondo de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Poner en marcha el Sampler de alto rendimiento (HTS) combinado con citómetro de flujo para cargar automáticamente las muestras de la placa de 96 pocillos y realizar una adquisición completamente automatizada dentro de 40 min according con el protocolo del fabricante. </li><li> Configurar el sistema de cine de la siguiente manera: 150 l volumen de la muestra, mezclando volumen de 50 l, 180 de velocidad, número de mezclas de mezcla 5, el volumen de lavado entre cada muestra de 400 l, caudal de 2,5 l / seg, el número de eventos registrados 10.000. </li><li> Evaluar los pocillos de control negativo de la co-cultivo de micro-placa final de primera con el fin de puerta de la población ameba y para determinar el porcentaje de estas células huésped de acuerdo a sus características físicas. Asegúrese de tener una población homogénea ameba y una segunda población de unos acontecimientos inferiores correspondientes a los desechos y el ruido. Nota: Este procedimiento compuerta distingue restos subcelular y cúmulos de células individuales por tamaño, estimados por dispersión hacia adelante. Por tanto, es importante determinar con precisión el porcentaje de cada población usando el mejor procedimiento gating posible. Estos porcentajes pueden variar, especialmente si se utilizan muchos tipos de protozoos, así que es importante siempre tener un negativde control electrónico, que puede ser utilizado como la población de referencia para el resto de las muestras. </li><li> Iniciar la compuerta haciendo clic en la muestra de adquisición. </li><li> Registrar el número de eventos no menos de 10.000 eventos. </li><li> Localizar la población ameba de interés utilizando la flecha. Esta es la forma de definir las puertas. </li><li> Después de bloquear, dejar que el punto de HTS o localizar la placa haciendo clic en &quot;Inicio&quot;, a continuación, ejecutar toda la placa automáticamente. Realizar adquisición y análisis de datos de acuerdo con los parámetros de tamaño y estructura (respectivamente, FSC (dispersión hacia adelante) y SSC (dispersión lateral)). Nota: La detección de la pérdida de la población de ameba cerrada señala la presencia de un agente patógeno responsable de la lisis ameba. lisis Protozoa asociado con infección por el virus se detecta con un umbral arbitrariamente diseñada de 50% de lisis de la población ameba cerrada por el analizador y en comparación con la misma población no infectada utilizado como control negativo fiable. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Caracterización de los nuevos aislados después de la detección de lisis <ol><li> La tinción preliminar para revelar la presencia de virus gigantes <ol><li> Después de la detección de lisis por citometría de flujo, pipetear los co-cultivos lisadas a suspender las amebas restantes. Entonces citocentrífuga directamente 50 l de la suspensión a 800 xg durante 10 min. </li><li> Después de la centrifugación, fijar los portaobjetos con una solución de metanol puro. Manchar las diapositivas utilizando una tinción rápida comercial de Eosina / azul Azul y tinción DAPI y observar con un microscopio óptico con un aumento de 1.000X con el fin de comprobar la presencia de fábricas de virus. <ol><li> Para tinción rápida, sumergirse las diapositivas en la primera solución de eosina (4 sec repitió tres veces) y luego pasa directamente a sumergirse diapositivas en la segunda solución de fijación que contiene azul Azul durante 6 s, y finalmente enjuagar las diapositivas de 45 segundos con una solución tampón de fosfato pH 7,2. Deje secar los portas a temperatura ambiente, a continuación, proceder a observatien. </li><li> Para la tinción DAPI, depósito de 15 l de la solución madre comercial DAPI sobre el portaobjetos seco fijo. Proteger de la luz a continuación, proceder a la observación. </li></ol></li></ol></li><li> Microscopio de electrones <ol><li> Después de la primera identificación en las diapositivas, evaluar la presencia del virus gigante través de la observación de microscopía electrónica de las culturas sobrenadante. </li><li> Depósito de 5 l de la muestra positiva sobre la rejilla descargada brillan. Esperar aproximadamente 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Se seca la rejilla con cuidado y depósito en él una pequeña gota de molibdato de amonio al 1% durante 10 seg. Deje la rejilla para secar durante 5 minutos. </li><li> Continúe con Microscopía Electrónica a 200 keV. </li><li> Coloque la rejilla en el soporte; introducir el soporte en el microscopio. Compruebe el resumen de vacío haciendo clic en el icono correspondiente. Cierre las válvulas y comienzan observación en un tamaño de punto 5, y el aumento de x 25.000. </li><li> Medir el virus gigante usando ImageJ o directaLy en el microscopio utilizando la herramienta de medida del microscopio se encuentra en la pantalla de adquisición. Nota: Clasificar la muestra en el grupo Faustovirus con un tamaño de la cápside de aproximadamente 200 nm. </li></ol></li><li> Biología Molecular Nota: Después de esta identificación, pruebas de biología molecular fueron cruciales para la confirmación con el fin de distinguir Faustovirus de Marseillevirus, que tiene el mismo tamaño de la cápside y la apariencia bajo el microscopio electrónico, aunque no tienen la misma especificidad de huésped. El Marseillevirus no puede crecer en Vermamoeba, el Faustovirus es específico para Vermamoeba y todos los intentos de hacer crecer en otras amebas como Acanthamoeba han fracasado hasta la fecha. El diseño y la aplicación de los sistemas de cebadores / sondas específicas enumeradas en las obras de Reteno et al. permitido una clasificación preliminar más precisa de los virus recién aislados a través de la amplificación y secuenciación de los genes virales. <ol><li> ExADN tracto partir de las muestras de cultivo positivo usando un sistema de extracción automatizada de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Realizar PCR en tiempo real utilizando un termociclador como se describe en Reteno et al. 19 </li><li> Secuencia usando los mismos cebadores que se usaron para la amplificación. Usa los cebadores dirigidos dirigida por ADN polimerasa de ARN de la subunidad 1 gen: CAT Fstv_S2F 5&#39;-CCA GGA GAT CAC ATA GGT G-3 &#39;(hacia adelante) y Fstv_S2R 5&#39;-TTG CAC CTC CGC AGT AAT A-3&#39; (inverso) con la sonda Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA. </li></ol></li></ol> 4. Virus de Producción, purificación y secuenciación del genoma <ol><li> Subcultura de la misma cultura ameba virus para el punto final clonación de dilución. </li><li> Para la producción: preparar 20 matraces que contenían 30 ml de PYG, 10 ml de vermiformis Vermamoeba y 5 ml del virus aislado ya transferido de pozos a los pequeños frascos. </li><li> Se incuba a 30 ° C hasta su completala lisis de la ameba. Observar todos los días por microscopía óptica invertida hasta que todas las amebas son lisadas. </li><li> Después de la lisis completa, en común todos los frascos en un solo recipiente. Filtro con un filtro de 0,45 micras para eliminar los desechos. </li><li> Iniciar la purificación mediante ultracentrifugación a 89.800 xg durante 75 min. Asegúrese de calibrar el peso de los tubos antes de iniciar la centrifugación. </li><li> Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante de cada tubo por aspiración y resuspender el sedimento en PAS con el mismo volumen utilizado para la calibración, antes de repetir la centrifugación. </li><li> Como el anterior, eliminar el sobrenadante y volver a suspender todos los gránulos en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Se purifica el virus que se produce, con el 25% de sacarosa (27,5 g de sacarosa en 100 ml de PBS, se filtró sobre un filtro de 0,22 micras). <ol><li> Utilice 8 ml de sacarosa y 2 ml de la suspensión viral. Centrifugar a 89.800 xg durante 1 h 15 min. Volver a suspender el sedimento en 1 ml de PBS. Almacenar a -80 ° C. </li&gt; </ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La posibilidad de que Faustovirus podría ser el primer miembro de una nueva familia Megavirales cerca de VPPA se sugirió por primera vez por Reteno et al., 19 pero algunas diferencias todavía se puede distinguir. Parece claro si Faustovirus debe unirse a la familia Asfarviridae o si debería en cambio formar una nueva familia viral putativa. Este problema será necesario estudiar más detalladamente, en particular, una caracterización más completa de su morfología, la gama de huéspedes, ciclo de replica...

El descubrimiento de virus gigantes, especialmente los que pertenecen a la orden Megavirales, cambió por completo el mundo de los virus en términos de tamaño de partícula y la complejidad del genoma. Los virus se pensaba que ser entidades pequeñas, y el Mimivirus parecieron romper todas las reglas. 1 metagenomic datos sugiere la ubicuidad de los virus gigantes no sólo en el medio ambiente, 2-5, sino también en los seres humanos. 6 Por lo tanto, todavía hay una necesidad para buscar estos virus a gran escala. La diversidad de estos virus gigantes se evaluó mediante el muestreo no sólo una variedad de ambientes acuáticos y sus sedimentos asociados en todo el mundo, 7-11, sino también por la selección de una variedad de muestras humanas 12,13 y muestras ambientales. 7,9 Los mimivirus Polyphaga Acanthamoeba fue aislado por co-cultivo usando protistas fagocíticas, principalmente Acanthamoeba spp. 14-16 Una colección completa de virus gigantes eran entonces tambiénaislado de este alojamiento protista especificado, lo que hizo que la comunidad científica restringir su procedimiento de la investigación y el aislamiento de Acanthamoeba spp. Es evidente que esta dependencia de una sola especie de acogida ha dado lugar a una gran parte de los virus que se pasa por alto. El hecho de que el virus gigante, CroV, se aisló con la gran movilidad roenbergensis protozoos marinos Cafetería, 17,18 demuestra la necesidad de utilizar una gama más amplia de protozoos con el fin de descubrir nuevos linajes o familias de virus gigantes. Reteno et al. Lograron seleccionar otros protozoos como anfitriones celulares que nunca antes se había utilizado, y se aisló el nuevo linaje relacionados con Asfar de virus gigantes (el recién nombrado Faustovirus). 19 En un intento de aislar nuevos genotipos Faustovirus con el fin de ampliar los miembros de este linaje viral, modificamos nuestros procedimientos de aislamiento y los utilizó para examinar muestras ambientales capaces de cosechar nuevos Faustoviruses. Nosotros entoncesse describe el protocolo completo para caracterizar los nuevos aislados. Se evaluó vermiformis Vermamoeba, el protista de vida libre más común encontrado en los ambientes humanos, 20-22 que ya se utiliza en el aislamiento del primer prototipo Faustovirus E12. 19 Este protista actualmente está siendo el anfitrión-específico para Faustovirus. Sabíamos que ninguno de los virus gigantes conocidos era patógena para esta ameba, porque no hay intentos de cultivar otros virus gigantes en nuestro laboratorio mostraron lisis ameba o el crecimiento viral. Por esta razón, nosotros creemos que V. vermiformis es el mejor y más exclusivo apoyo de células conocidas para aislar nuevos Faustoviruses.

<table><tbody><tr><td>Citómetro LSR FORTESSA&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>France&nbsp;</td><td>649225B4</td></tr><tr><td>TECNAI G2 F20</td><td>FEI</td><td>Alemania &nbsp;</td><td>5027/11</td></tr><tr><td>Microscopio óptico invertido</td><td>leica&nbsp;</td><td>Francia</td><td>72643</td></tr><tr><td>Extracción de ADN</td><td>Qiagen EZ1 Advanced XL Robot de extracción</td><td>Francia &nbsp;</td><td>L106A0452</td></tr><tr><td>Ciclador PCR CFX96</td><td>Bio rad</td><td>France</td><td>785BR06298</td></tr><tr><td>Medio PYG, PAS, Medio de inanición</td><td>Producción propia en laboratorio&nbsp;</td><td>Marsella URMITE</td><td>x</td></tr><tr><td>Amoeba cepa CDC-19</td><td>ATCC</td><td>France</td><td>50237</td></tr><tr><td>Placas</td><td>Cellstar</td><td>France</td><td>655180</td></tr><tr><td>PCR materiales, cebadores.&nbsp;</td><td>eurogentec</td><td>France</td><td>Primers citados en el manuscrito</td></tr><tr><td>diapositiva vítrea 10 con rejillas</td><td>Kova&nbsp;</td><td>EE. UU</td><td></td></tr><tr>.<td>H899871441F Eosin/tinción azul Azur-Hemacolor</td><td>Milipore Merck&nbsp;</td><td>Francia</td><td>111955,6,57,109468</td></tr><tr><td>Filtros accionados por vacío</td><td>Thermo scientific</td><td>France BPV4550</td><td>/ 20170115</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Thermo Fisher scientific&nbsp;</td><td>Francia &nbsp;</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>Tinte DAPI</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>Francia &nbsp;</td><td>D1306</td></tr><tr><td>cytospin 4 citocentrífuga</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>France</td><td>10522013JT184-31</td></tr><tr><td>Túnel de citología simple</td><td>Biomedical polymers inc.</td><td>Francia</td><td>BMP-cyto-S50</td></tr><tr><td>Redes de carbono&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>Francia&nbsp;</td><td>FCF400NI</td></tr><tr><td>Molibdato de amonio</td><td>VWR internationanl&nbsp;</td><td>Francia &nbsp;</td><td>21276185</td></tr><tr><td>Frascos&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>Alemania</td><td>833911</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtros&nbsp;</td><td>Milex millipor&nbsp;</td><td>Francia</td><td>SE2M229104</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Sorval WX 80</td><td>Thermo scientific</td><td>France</td><td>9102448</td></tr><tr><td>Filtros de flujo rápido</td><td>Nalgene</td><td>France</td><td>450-0020</td></tr></tbody></table>

una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos faustoviruses de muestras ambientales uso<em&gt; vermiformis vermamoeba</em

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

El aislamiento del virus gigantes es de gran interés en esta nueva era de la virología, sobre todo porque estos virus gigantes están relacionadas con los protistas. virus gigantes pueden ser potencialmente patógenos para muchas especies de protistas. Pertenecen al orden descrito recientemente de Megavirales. El nuevo linaje Faustovirus que se ha aislado de muestras de aguas residuales está lejanamente relacionado con el virus de la peste porcina africana patógeno de mamífero. Este virus también es específico de su huésped amebas, vermiformis Vermamoeba, un protista común en los sistemas de agua para el cuidado de la salud. Es fundamental seguir aislando nuevos genotipos Faustovirus con el fin de ampliar su colección genotipo y estudiar su pan-genoma. Hemos desarrollado nuevas estrategias para el aislamiento de cepas adicionales mediante la mejora de la utilización de combinaciones de antibióticos y antifúngicos con el fin de evitar contaminaciones bacterianas y fúngicas de la ameba co-cultivo y favoreciendo la multiplicación del virus. También hemos implementado un nuevo starvation medio para mantener V. vermiformis en condiciones óptimas para el virus de co-cultivo. Por último, se utilizó citometría de flujo en lugar de la observación microscópica, que consume mucho tiempo, para detectar el efecto citopatogénico. Se obtuvieron dos aislamientos de muestras de aguas residuales, lo que demuestra la eficacia de este método y ampliando así la recogida de Faustoviruses, para entender mejor su medio ambiente, la especificidad del hospedador y contenido genético.

El sistema estudiado en este manuscrito validado su prueba de concepto mediante el aislamiento de dos nuevas Faustoviruses. De las 70 muestras analizadas, se detectaron dos episodios de lisis, a diferencia de nuestros controles negativos fiables. El control negativo para la lisis contenía una población ameba 86%. Por el contrario, las muestras positivas (ST1 de Saint Pierre de Meyzoargues), y (LC9 para la muestra La Ciotat 9) mostraron una disminución dramática en las amebas cerrada; más...

Describimos aquí los últimos avances en aislamiento viral para la caracterización de nuevos genotipos de Faustovirus, un nuevo linaje de virus gigantes relacionado con asfarvirus. Este protocolo se puede aplicar al aislamiento de alto rendimiento de virus, especialmente virus gigantes que infectan amebas.

Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

El objetivo general de esta nueva estrategia de aislamiento es ampliar el número de nuevos aislamientos virales con el fin de estudiar el pan-genoma de esta nueva familia viral y comprender mejor sus ecosistemas y su posible patogenicidad para los seres humanos. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la virología, ayudando a los virólogos de todo el mundo interesados en la prospección de virus gigantes, y en particular de los Faustovirus. La principal ventaja de esta técnica es que presenta nuevas mejoras en muchas etapas, como la mezcla de antibióticos y antifúngicos, el nuevo medio de ayuno adaptado para la ameba y el uso de citometría de flujo para una detección más rápida y sensible de la lisis. Después de recolectar muestras de agua contaminada según el protocolo descrito, prepare la célula huésped, V. vermiformis, añadiendo las amebas a un matraz de cultivo celular de 75 centímetros cuadrados con 30 mililitros de medio de proteasa peptona extracto de levadura glucosa, o medio PYG, e incube a 28 grados Celsius durante 48 horas. Utilice láminas de conteo para contar las amebas y, cuando alcancen una concentración de cinco por 10 a la 5ª hasta 10 a la 6ª células por mililitro, recolecte las células mediante centrifugación a 720 veces g durante 10 minutos.Aspire el sobrenadante y use 30 mililitros de solución salina amebiana estéril de Page o PAS para resuspender el sedimento de amebas. Después de lavar el sedimento una segunda vez, use 30 mililitros de medio de inanición, que contenga un antibiótico y un agente antifúngico, para resuspender las células hasta aproximadamente 10 a la 6ª ameba por mililitro. El medio de inanición permite que las amebas permanezcan vivas sin sufrir enciste o multiplicación.A continuación, siembre 200 microlitros de amebas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo plano e incube a 30 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, después de agitar las muestras de agua mediante vortex durante un minuto a temperatura ambiente, inocule 25 microlitros de cada muestra sobre las células de amebas, dejando dos pocillos sin muestra como controles negativos. Para evitar la evaporación, coloque la placa que contiene la primo-cultura en una bolsa con una compresa húmeda, y coloque la cámara humedecida con la placa en un incubador a 30 grados Celsius.Tres días después de la primera inoculación, subcultive la placa de primocultivo en una nueva placa de 96 pocillos con amebas tal como se acaba de demostrar, sin realizar ninguna observación microscópica. Incube a 30 grados Celsius durante tres días. Luego, utilizando la subcultura, inocule una tercera placa como se acaba de describir e incube durante dos días.Para detectar la lisis en la placa final de co-cultivo, encienda el citómetro y realice una limpieza y enjuague según el protocolo del fabricante para reducir el ruido de fondo. Para realizar una adquisición completamente automatizada de 40 minutos, inicie el muestreador de alto rendimiento o HTS para cargar automáticamente las muestras de la placa de 96 pocillos según el protocolo del fabricante. Configure los parámetros del HTS como se indica aquí: un volumen de muestra de 150 µL, un volumen de mezclado de 50 µL, una velocidad de mezclado de 180, un número de mezclas de 5, un volumen de lavado entre muestras de 400 µL, una velocidad de flujo de 2,5 µL por segundo y un número de eventos registrados de 10 000. Haga clic en inicio para permitir que el HTS detecte o ubique la placa. Luego, evalúe primero los pocillos del control negativo que contienen las células amebas huésped, con el fin de delimitar la población amebiana y determinar el porcentaje celular según sus características físicas. Asegúrese de tener una población amebiana homogénea y una segunda población de eventos más bajos correspondientes a restos celulares y ruido. A continuación, comience el análisis mediante el botón de adquisición de muestra.Luego, utilizando la flecha, que define las compuertas, localice la población de amebas de interés. Después de seleccionar al menos 10.000 eventos, haga clic en ejecutar para permitir que el HTS ejecute automáticamente toda la placa. Realice la adquisición y el análisis de datos según el parámetro de tamaño dispersión hacia adelante y el parámetro estructural dispersión lateral. Consulte el texto para obtener detalles adicionales. Tras la detección de la lisis mediante citometría de flujo, pipetee las co-cultivos lisados para suspender las amebas restantes. Después de pipetear 50 microlitros de cada muestra sobre portaobjetos, cito-centrifugue directamente la suspensión a 800 × g durante 10 minutos.A continuación, utilice metanol puro para fijar los portaobjetos y luego deje que sequen a temperatura ambiente. Después de la fijación, sumerja los portaobjetos en la solución ESN tres veces durante cuatro segundos cada vez, antes de colocarlos en azul de azur durante seis segundos. Finalmente, sumerja los portaobjetos en PBS durante 45 segundos.Deje que las laminillas sequen a temperatura ambiente antes de proceder a la observación. Para teñir laminillas fijadas nuevas con DAPI, pipetee 15 microlitros de DAPI sobre las laminillas secas. Observe las laminillas bajo un microscopio óptico a un aumento de 1000x para verificar la presencia de fábricas virales.Para realizar microscopía electrónica, deposite cinco microlitros de la muestra positiva sobre una rejilla sometida a descarga eléctrica, e incube a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Seque cuidadosamente la rejilla, luego agregue una pequeña cantidad de molibdato de amonio al 1 % e incube durante 10 segundos. Después de eliminar cuidadosamente la gota, deje secar la rejilla durante cinco minutos. A continuación, configure el microscopio electrónico a 200 kiloelectrón voltios. Luego, coloque la rejilla en el portaobjetos e introduzca el portaobjetos en el microscopio. Haga clic en el icono de vista general del vacío y verifique el vacío. A continuación, cierre las válvulas, establezca un tamaño de punto de cinco y un aumento de 25.000 antes de comenzar la observación. Tras localizar un virus gigante en la pantalla de adquisición, utilice la herramienta de medición para medir el virus. Realice la biología molecular y la secuenciación del genoma viral según el protocolo descrito en el texto.Esta figura muestra los resultados de la detección de dos Faustovirus en comparación con los controles negativos confiables. El control negativo para la lisis contenía una población de amebas del 86%. En contraste, más del 60% de las amebas fueron lisadas, con el mayor porcentaje de detritos en las muestras positivas.Como se observa aquí, la ESN y la tinción azur azul tiñen los núcleos de las células de amebas no infectadas e infectadas, así como la presencia de fábricas virales dentro de las células infectadas. La tinción con DAPI también confirma la presencia de fábricas virales dentro de las amebas. En estas imágenes, la microscopía electrónica revela la presencia de Faustovirus con la apariencia típica de un mega-virus compuesto por una cápside icosaédrica que carece de fibrillas y tiene un tamaño de 200 nanómetros.Una vez dominada y tras el cultivo conjunto, esta técnica de detección de lisis y caracterización del virus puede realizarse en una hora, si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar controlar la viabilidad de las amebas y verificar cualquier contaminación probable. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como biología molecular dirigida a virus gigantes, con el fin de responder preguntas adicionales, como la familia viral y/o el genotipo.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la virología exploraran esta familia viral, su huésped específico y su potencial patogenicidad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar fácilmente virus gigantes ampliando el número y los tipos de muestras y seleccionando la mejor célula huésped y las condiciones de cultivo óptimas. No olvide que trabajar con virus potencialmente patógenos para los seres humanos puede ser extremadamente peligroso, especialmente con muestras de aguas residuales.Por lo tanto, siempre se deben tomar precauciones como trabajar en laboratorios SB2 con condiciones seguras al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El estudio describe un método costo-efectivo para la identificación de la fuente de contaminación fecal / orina o la contaminación por nitratos en el agua utilizando qPCR para la cuantificación específica de los virus de ADN humano / porcino / bovino, adenovirus y poliomavirus, propuesto como herramientas de MST.

Método rentable para el Rastreo de uso microbiana específica virus humanos y animales

Cocultivo de amebas es un sistema de cultivo celular usando amebas adherente a crecer selectivamente a los patógenos intracelulares capaces de resistir las células fagocíticas tales como amebas y macrófagos. Por lo tanto, representa una herramienta clave para descubrir nuevos agentes infecciosos. Enriquecimiento amebas permite el descubrimiento de nuevas especies de amebas y de sus bacterias intracelulares específicos.

Descubrimiento de nuevos patógenos intracelulares por amebas Coculture y Enfoques amebas Enriquecimiento

El Método EPA 1615 utiliza un filtro electropositivo para concentrar enterovirus y norovirus en aguas ambientales y potables. Este manuscrito describe el procedimiento para recolectar muestras para los análisis del Método 1615.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. I. Colección de ejemplos de virus

Aquí presentamos un procedimiento para medir el total de virus cultivables utilizando la línea celular de riñón Buffalo Green Monkey. El procedimiento proporciona una herramienta estandarizada para medir la presencia de virus infecciosos en aguas ambientales y potables.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y la aparición norovirus en agua por cultura y RT-qPCR. II. Ensayo Virus Culturable total

Aquí presentamos un procedimiento para cuantificar enterovirus y norovirus en aguas ambientales y potables utilizando PCR cuantitativa con transcripción inversa. La recuperación media del virus de las aguas subterráneas con este procedimiento estandarizado del Método 1615 de la EPA fue del 20% para el poliovirus y del 30% para el norovirus murino.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. Parte III. Detección de virus por RT-qPCR

Aquí presentamos VirWaTest, que es un método simple, asequible y portátil para la concentración y detección de virus de muestras de agua en el punto de uso.

VirWaTest, un método de punto de uso para la detección de virus en muestras de agua

Aquí, describimos un método de microaspiración de una sola célula para la separación de las amebas infectadas. Con el fin de separar subpoblaciones virales en Vermamoeba vermiformis infectados por Faustovirus y virus gigantes desconocidos, desarrollamos el protocolo detallado a continuación y demostramos su capacidad para separar dos nuevos virus gigantes de baja abundancia.

Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes

Este protocolo describe un método para extraer eficientemente nematodos vivos de sustratos naturales en el campo.

Aislamiento rápido de nematodos silvestres por Baermann Funnel

Se han encontrado numerosas secuencias nuevas similares a virus en mosquitos debido al uso extensivo de tecnologías de secuenciación. Proporcionamos un procedimiento eficaz para aislar y amplificar virus utilizando líneas celulares de vertebrados y mosquitos, que podría servir como base para futuros estudios sobre virus asociados a mosquitos, incluidos los virus transmitidos por mosquitos y específicos de mosquitos.

Aislamiento de virus asociados a mosquitos de mosquitos recolectados en el campo

La concentración de virus a partir de muestras ambientales de agua y aguas residuales es una tarea desafiante, llevada a cabo principalmente para la identificación y cuantificación de virus. Si bien se han desarrollado y probado varios métodos de concentración de virus, demostramos aquí la efectividad de la ultrafiltración y la floculación de leche desnatada para virus de ARN con diferentes tipos de muestras.

Concentración de partículas de virus de muestras ambientales de agua y aguas residuales mediante floculación y ultrafiltración de leche desnatada

Aquí, describimos métodos de muestreo de las zonas eufóticas de los ecosistemas marinos y de agua dulce para aislar cianofagos (y sus huéspedes) y procesos posteriores al muestreo que enriquecen genotipos individuales y caracterizan la dinámica de interacción virus-huésped.

Muestreo ambiental de microbios fotosintéticos y sus virus: del campo al laboratorio

Aprende una estrategia rápida para aislar nuevos Faustovirus de muestras ambientales utilizando Vermamoeba vermiformis como hospedero. Este método mejora la detección de lisis mediante floss-cytometría.

Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso

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