Name: Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a diseñar un sistema de liberación de siRNA al cerebro usando liposomas catiónicos y aniónicos con péptidos neurodirigidos. Este método permite el transporte intravenoso a través de la barrera hematoencefálica para tratar enfermedades neurodegenerativas.

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Nos gustaría agradecer las siguientes fuentes de financiación: el Programa de Formación en Investigación Traslacional de Enfermedades Infecciosas de la CSU (ID:TRTP) y el programa de becas de investigación de los NIH (R01 NS075214-01A1). Nos gustaría agradecer al laboratorio Telling por el uso de su anticuerpo monoclonal PRC5. También nos gustaría agradecer al laboratorio Dow por los liposomas DOTAP y por compartir su experiencia en la generación de liposomas.

Todos los animales fueron criados y mantenidos en el laboratorio de Recursos Animales, acreditados por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International, de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Estado de Colorado. 1. Preparación de LSPCs <ol><li> Use un 1: 1 de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano): la proporción de colesterol para LSPCs. Para una preparación de liposomas nmol 4, mezclar 2 nmoles de DOTAP y 2 nmoles de colesterol en 10 ml de una solución 1: metanol en un matraz: cloroformo 1. </li><li> Evaporar 9 ml de cloroformo: solución de metanol usando N 2 gas en una campana de humos. Evaporar los últimos 1 ml de disolvente en una campana de humos durante la noche sin gas. Observar una película delgada de lípidos en el fondo del matraz. </li><li> Heat 10 ml de una solución de sacarosa al 10% a 55 ° C. </li><li> Se vierte la solución de sacarosa al 10% se calienta a la película lipídica delgada lentamente, es decir, 1 ml / min, mientras que gently agitando el matraz. Mantener la sacarosa 10% y el matraz con lípidos a 55 ° C de modo que las moléculas de lípidos permanecen en la fase de gel-líquido. resultados de rehidratación en la formación de vesículas multilamelares (MLV). </li><li> Permitir lípidos para rehidratar a 55 ° C durante al menos una hora antes de dimensionar los liposomas. </li><li> Montar un extrusor según las instrucciones del fabricante con 1,0 micras filtros o usar filtros de jeringa de 1,0 micras para el dimensionamiento. </li><li> Añadir 1 ml de la suspensión de liposomas se calentó a una de las jeringas en la extrusora, y pasar la suspensión entre las dos jeringas 11 veces. Asegúrese de que la suspensión está en la jeringa opuesta a la jeringa comienza después de los 11 pases. </li><li> Tamaño de los liposomas de nuevo a través de 0,45 micras y luego 0,2 micras filtros para generar grandes vesículas unilamelares (LUV). Mantener la suspensión de liposomas se calienta para el dimensionamiento más fácil. </li><li> Incubar 20 l de la suspensión de liposomas 4 nmol (200 M) con 200 l de un 20 micras (4total de nmol) solución madre de siRNA para 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Incubar 80 l de una 500 mM (40 nmol total de) solución RVG-9R de valores con la solución / liposoma siRNA durante 10 min a RT. LSPCs deben utilizarse tan pronto como sea posible, pero se pueden utilizar hasta varias horas después de la preparación. LSPCs se almacena a 4 ° C durante varias horas después de la preparación. </li></ol> 2. Preparación de palets <ol><li> Use un 55: 5 relación molar de cualquiera de DSPE (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina):: 40 colesterol: DSPE-PEG o DOTAP: colesterol: DSPE-PEG para PALETS. Para una preparación de liposomas nmol 4, mezclar 2,2 nmoles de o bien DSPE o DOTAP, 1,6 nmoles de colesterol, y 0,2 nmoles de DSPE-PEG en 10 ml de una mezcla 2: solución de metanol en un matraz: cloroformo 1. </li><li> Preparar suspensión de liposomas exactamente como se describe en el paso 1.1 y 1.2 anterior. Rehidratar los liposomas DSPE en 10 ml de PBS 1x calentó a 75 ° C, la adición de 1 ml / min. Permitir lípidos para rehidratar a 75 ° C durante por lopor lo menos 1 hora antes de dimensionar. </li><li> Tamaño de la suspensión de liposomas exactamente como se describe en el Paso 1.6 a 1.8. </li><li> Pipetear 20 l de cada una de las suspensiones de liposomas 4 nmol (200 mM) en alícuotas de un solo uso después de DOTAP y DSPE liposomas han sido tamaño, y liofilizar durante 30 minutos utilizando un secador de congelación de sobremesa (Figura 2). </li><li> Incubar 200 l de una solución madre 20 mM (4 en total nmol) siRNA con 1,4 l de una solución 26,6 M de sulfato de protamina durante 10 min a RT para siRNA que ha de ser encapsulado en liposomas DSPE PALETS. </li><li> Rehidratar los liposomas DOTAP palets 200 l de una solución madre nmol 4 de siRNA o rehidratar los liposomas DSPE palets 201,4 l de la solución / protamina siRNA. Incubar solución / siRNA liposoma durante 10 min a RT. </li><li> Añadir 10 l de una solución 60 mM de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) a la solución de liposomas / siRNA para ambos DOTAP y DSPE PALETS. </li><li> Añadir 10 l de una solución 150 mM N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) a la solución de liposomas / siRNA para ambos DOTAP y DSPE PALETS. </li><li> Incubar la EDC y sulfo-NHS con la suspensión / liposoma siRNA durante 2 horas a RT. </li><li> Incubar 80 l de una 500 mM (40 nmol total de) solución RVG-9R de valores con el siRNA / liposoma solución durante 10 min a RT reticulación. NOTA: La EDC / sulfo-NHS permite la RVG-9r para unir covalentemente a los lípidos PEG. PALETS utilizar dentro de varias horas después de la preparación. PALETS se almacena a 4 ° C durante varias horas después de la preparación. </li><li> Para determinar la eficiencia de encapsulación siRNA de palets: <ol><li> Medir la concentración de siRNA antes y después de la adición de protamina y liposomas usando un espectrofotómetro ajustado a 260 nm. </li><li> Se filtra la no encapsulado siRNA desde el liposoma suspensión siRNA / encapsulado usando 50 kDa filtros centrífugos. Centrifugar a 1000 xg durante 20 min. </li><li> Medir la concentración desiRNA no encapsulado en el filtrado y la concentración de siRNA encapsulado en el material retenido usando un espectrofotómetro a 260 nm. </li></ol></li></ol> 3. La inyección de ratones con LSPCs o PALETS <ol><li> Exponer a los ratones durante 5-10 minutos a una lámpara de calor para dilatar la vasculatura. </li><li> Anestesiar ratón con un 2-3% de isofluorano / oxígeno fluya 5-10 min antes de la inyección, y durante la inyección. Confirmar la anestesia cuando los animales ya no es ambulante y respiraciones han frenado haciendo una pizca dedo del pie. Coloca el ratón sobre su parte posterior o lateral para acceder a la vena de la cola. Utilice ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar que se seque mientras está bajo anestesia. </li><li> Limpiar / rociar la cola con 70% de EtOH y se inyecta 300 l de LSPCs o PALETS en la vena de la cola del ratón utilizando una jeringa de 26 G de insulina. Iniciar la inyección distalmente en la vena de la cola y mover proximalmente Si la vena se derrumba o se rompe. </li><li> Coloque el ratón en una jaula limpia hasta que se mantiene decúbito esternal. No coloque moutilizar con otros compañeros de jaula hasta que se haya recuperado por completo. Los ratones deben recuperarse en 5 a 15 minutos. Se pueden colocar en una almohadilla eléctrica o bajo una lámpara de calor para mantener la temperatura corporal si la recuperación tarda más tiempo. Los ratones deben ser vigilados estrechamente para proteger contra el sobrecalentamiento. </li><li> Monitorear los animales varias horas después de la inyección para asegurar efecto de la anestesia, y no hay efectos nocivos del tratamiento. Permitir a los LSPCs o palets a circular por lo menos durante 24 horas. </li></ol> 4. Análisis de la expresión de proteínas a través de Citometría de Flujo <ol><li> La eutanasia a los ratones con un CO 2 velocidad de flujo 20% durante 15 min. </li><li> Diseccionar la mitad de un hemisferio del cerebro mediante el corte de la piel y el cráneo del ratón usando tijeras. Peel distancia media de un hemisferio cerebral lejos de la cráneo con unas pinzas o el extremo de un par de tijeras. </li><li> Press medio de un hemisferio cerebral de cada ratón a través de un filtro de células de malla de 40 micras utilizando 2,5 ml de tampón FACS (1x; PBS, 1% de suero bovino fetal, 10 mM EDTA) en una placa de Petri con el émbolo de una jeringa. </li><li> Enjuague el filtro de células y la placa de Petri con un adicional de 2,5 ml de tampón FACS. Poner la suspensión de células individuales en un tubo cónico de 15 ml en hielo. </li><li> Pipetear 100 l de la 5 ml de suspensión de células individuales en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar durante 5 min a 350 x g. Desechar el sedimento celular sobrenadante y resuspender en 1 ml de tampón de FACS. Girar a 350 xg durante 5 min. Repita con el otro 1 ml de tampón FACS. Mantener la suspensión de células en hielo. </li><li> Se incuban las células en 100 l de dilución 1: 100 de un / ml rata bloque anti-ratón Fc 0,5 mg en tampón FACS durante 30-60 min en hielo. Pellets y lavar las células como en el paso 4.5. Mantener la suspensión de células en hielo. </li><li> Se incuban las células en 100 l de un anticuerpo de 20 mg / ml fluorescente contra ratón PrP C en suero de ratón 7% en tampón FACS en hielo durante 30-60 min. Pellets y lavar las células como en el paso 4.5. Mantener la suspensión de célulassobre hielo. </li><li> Pellets y resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (1x PBS, 155 mM NH 4 Cl, 12 mM de NaHCO3, EDTA 0,1 mM) durante 1 min. Pellet como en el paso 4.5 y resuspender las células en 1 ml de tampón de FACS. Mantener la suspensión de células en hielo. </li><li> Analizar la expresión de PrP C usando un citómetro de flujo como se ha descrito previamente 10. Puerta de las células de la población total de células en vivo. Puerta de PrP C + células de la población de células vivas para determinar MFI (intensidad de fluorescencia media). </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este informe describe un protocolo para crear dos sistemas de administración dirigida que transporta de manera eficiente ARNsi al SNC. Los métodos anteriores de la entrega de siRNA en el SNC incluyen la inyección de vectores de siRNA / shRNA directamente en el cerebro, la inyección intravenosa de siRNA dirigidos, o inyección intravenosa de complejos de liposomas-siRNA no dirigidas. La inyección de los vectores de siRNA / shRNA en el SNC no causa una disminución en los niveles de expresión de proteína objetivo. Sin embar...

Los priones son enfermedades neurodegenerativas graves que afectan el SNC. Las enfermedades priónicas son el resultado de la mal plegamiento de la proteína priónica celular normal, PrP C, por un isómero infecciosa llamada PrP Res. Estas enfermedades afectan a una amplia variedad de especies, incluyendo la encefalopatía espongiforme bovina en vacas, scrapie en ovejas, la caquexia crónica en los cérvidos, y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos 1-3. Los priones causan neurodegeneración que se inicia con la pérdida sináptica, y progresa a vacuolización, gliosis, pérdida neuronal, y los depósitos de placa. Con el tiempo, dando como resultado la muerte del animal / persona 4. Durante décadas, los investigadores han investigado compuestos destinados a ralentizar o detener la progresión de la enfermedad priónica. Sin embargo, los investigadores no han encontrado ya sea una terapia exitosa o un vehículo de administración sistémica eficaz. Se requiere la expresión endógena PrP C para el desarrollo de las enfermedades priónicas 5 </sarriba&gt;. Por lo tanto, disminuir o eliminar la expresión de PrP C puede resultar en un retraso o mejora de la enfermedad. Varios grupos crearon ratones transgénicos con niveles reducidos de PrP C o lentivectores inyectados que expresan shRNA directamente en el tejido cerebral murino para investigar el papel de los niveles de expresión PrP C en la enfermedad priónica. Estos investigadores han encontrado que reduce la cantidad de PrP C neuronal resultó en la detención de la neuropatología progresivo de las enfermedades priónicas y extendieron la vida de los animales 6-9. Nos han informado de que los resultados del tratamiento PrP C siRNA en el aclaramiento de la PrP Res en células de neuroblastoma de ratón 10. Estos estudios sugieren que el uso de terapias para disminuir PrP C los niveles de expresión, como pequeños ARN de interferencia (siRNA), que escinde mRNA, puede suficientemente retrasar la progresión de las enfermedades priónicas. Sin embargo, la mayoría de las terapias para las enfermedades priónicas investigados fueron entregados en una forma que no sería prácticoen un entorno clínico. Por lo tanto, una terapia de ARNip necesita un sistema de administración sistémica, que se entrega por vía intravenosa y dirigido al SNC. Los investigadores han estudiado el uso de liposomas como vehículos de administración para los productos de terapia génica. Los lípidos catiónicos y aniónicos se utilizan ambos en la formación de liposomas. Los lípidos catiónicos son los más utilizados que los lípidos aniónicos debido a que la diferencia de carga entre el lípido catiónico y el ADN / ARN permite para el embalaje eficiente. Otra ventaja de los lípidos catiónicos es que atraviesan la membrana celular más fácilmente que otros lípidos 11-14. Sin embargo, los lípidos catiónicos son más inmunogénicos que los lípidos aniónicos 13,14. Por lo tanto, los investigadores han comenzado a cambiar el uso catiónico a los tensioactivos aniónicos lípidos en liposomas. Productos de terapia génica se pueden empaquetar de manera eficiente en liposomas aniónicos utilizando el péptido cargado positivamente sulfato de protamina, que se condensa moléculas de ADN / ARN de 15-19. Desde lipi aniónicods son menos inmunogénicas que los lípidos catiónicos que pueden haber aumento de los tiempos de circulación, y pueden ser más toleradas en modelos animales 13,14. Los liposomas se dirigen a tejidos específicos utilizando péptidos dirigidos que se unen a los liposomas. El neuropéptido RVG-9R, que se une a los receptores nicotínicos de la acetilcolina, se ha utilizado para orientar siRNA y liposomas para el SNC 17-20. Este informe describe un protocolo para producir tres vehículos de entrega de siRNA, y para empaquetar y entregar el siRNA para las células neuronales (Figura 1). complejos liposoma-siRNA-péptido (LSPCs) se componen de liposomas con siRNA y el RVG-9R péptido dirigido electrostáticamente unidos a la superficie exterior del liposoma. Péptido dirigida encapsulado en liposomas terapéuticos siRNA (PALETS) se componen de siRNA y protamina encapsulado dentro del liposoma, con RVG-9R covalentemente unido a grupos PEG de lípidos. El uso de los métodos siguientes para generar LSPCs y PALETS, PrP C siRNA disminuye la expresión PrP C hasta el 90% en las células neuronales, que posee una gran promesa para curar o retrasar la aparición de patología de la enfermedad de priones sustancialmente.

<table><tbody><tr><td>Lípidos DOTAP</td><td>Avanti Lípidos</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Lípidos Avanti</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>DSPE</td><td>Lípidos Avanti</td><td>850715</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG</td><td>Lípidos Avanti</td><td>880125</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC268320010</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>EMD Millipore</td><td>113351</td><td></td></tr><tr><td>N2 Gas</td><td>AirGas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrusora</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lípidos Avanti</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>1.0, 0.4 y 0.2 &#956; Filtros Avanti</td><td>Lípidos</td><td>610010, 610007, 610006</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de protamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10275205</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>Aliquoted para un solo uso</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td>Aliquoted para un solo uso</td></tr><tr><td>40 &#956; m Filtro de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD16/CD32 Fc block</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PrP (PRC5)</td><td>Patentado - PRC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

entrega de therapeutic sirna al snc usando catiónicos y aniónicos los liposomas

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Las enfermedades priónicas son el resultado del mal plegamiento de la proteína priónica celular normal (PrPC) a un isómero anormal resistente a la proteasa llamado PrPRes. La aparición de enfermedades priónicas en las poblaciones de fauna silvestre y su creciente amenaza para la salud humana ha llevado a aumentar los esfuerzos para encontrar un tratamiento para estas enfermedades. Estudios recientes han encontrado numerosos compuestos antipriónicos que pueden inhibir el isómero infeccioso PrPRes o regular a la baja la proteína priónica celular normal. Sin embargo, la mayoría de estos compuestos no atraviesan la barrera hematoencefálica para inhibir eficazmente la formación de PrPRes en el tejido cerebral, no se dirigen específicamente a la PrPC neuronal y, a menudo, son demasiado tóxicos para su uso en animales o seres humanos. 
Investigamos si el siRNA administrado por vía intravascular y dirigido a la PrPC neuronal es un compuesto antipriónico más seguro y eficaz. Este informe describe un protocolo para producir dos vehículos de administración liposomal de siRNA y para empaquetar y administrar siRNA de PrP a las células neuronales. Los dos vehículos de administración liposomal son 1) la formulación de liposomas de siRNA complejados que utiliza liposomas catiónicos (LSPC) y 2) la formulación de liposomas de siRNA encapsulados que utilizan liposomas catiónicos o aniónicos (PALETS). En el caso de los LSPC, el siRNA cargado negativamente se une electrostáticamente al liposoma catiónico. Se añade al complejo un péptido cargado positivamente (RVG-9r [glicoproteína del virus de la rabia]), que se dirige específicamente a los complejos liposoma-siRNA-péptido (LSPC) a través de la barrera hematoencefálica (BBB) para las neuronas que expresan acetilcolina en el sistema nervioso central (SNC). Para los PALETS (siRNA terapéutico encapsulado con liposomas dirigidos a péptidos), los lípidos catiónicos y aniónicos fueron rehidratados por el siRNA de PrP. Este procedimiento da como resultado la encapsulación del siRNA dentro de los liposomas catiónicos o aniónicos. Una vez más, el neuropéptido RVG-9r se unió a los liposomas para dirigirse a los complejos siRNA/liposomas al SNC. Con el uso de estas formulaciones, hemos entregado con éxito siRNA de PrP a las neuronas que expresan AchR y hemos disminuido la expresión de PrPC de las neuronas en el SNC.

Para aumentar la eficiencia de la encapsulación dentro de siRNA PALETS aniónicos, el ARNsi se mezcló con protamina. Para determinar la mejor concentración de protamina para el siRNA, el ARNsi se mezcló con diferentes concentraciones de protamina, a partir de 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). Había una eficiencia de encapsulación siRNA 60-65% en liposomas aniónicos sin el uso de protamina. Las muestras con protamina: relaciones molares siRNA de 1: 1 a 1,5: 1 (133 a 266 nM) tenían ...

El objetivo de este protocolo es utilizar liposomas catiónicos/aniónicos con un péptido neuro-dirigido como sistema de administración del SNC para permitir que el siRNA atraviese la BBB. La optimización de un sistema de administración de tratamientos, como el siRNA, permitiría más opciones de tratamiento para los priones y otras enfermedades neurodegenerativas.

Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

El objetivo general de este procedimiento es diseñar un sistema de administración que pueda entregar fármacos de molécula pequeña, como el siRNA, al cerebro. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la neurodegeneración, tales como: ¿Es el siRNA una opción terapéutica viable para las enfermedades por mal plegamiento de proteínas? y ¿Podemos diseñar un sistema confiable de administración de fármacos al cerebro?La principal ventaja de crear un sistema de administración de fármacos liposomal es que podemos entregar nuestro ARNsi por vía intravenosa o a través del torrente sanguíneo, en lugar de hacerlo directamente en el tejido neuronal, lo que provoca daño neuronal. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia terapéuticas y diagnósticos de enfermedades neurodegenerativas, ya que permite una administración específica a través de la barrera hematoencefálica, específicamente hacia neuronas que expresan acetilcolina. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que las inyecciones en la vena de la cola del ratón son difíciles de aprender debido al pequeño tamaño de la vena de la cola del ratón.Comience preparando una relación uno a uno de DOTAP y colesterol. Para una preparación de liposomas con lípidos de animales foráneos, mezcle dos nanomoles de DOTAP y dos nanomoles de colesterol en diez mililitros de una solución uno a uno de cloroformo y metanol. Luego, evapore nueve mililitros de la solución de cloroformo y metanol utilizando gas nitrógeno.Evapore el último mililitro de disolvente en una campana extractora durante la noche sin gas. Al día siguiente, debería observarse una película delgada de lípidos en el fondo del matraz. Caliente tanto este matraz con la película de lípidos como diez mililitros de una solución de sacarosa al diez por ciento a 55 grados Celsius.Luego, pipetee lentamente la solución de sacarosa calentada sobre la película lipídica delgada mientras gira suavemente el matraz. A continuación, arme un extrusor con filtros de un micrón según las instrucciones del fabricante. Después, agregue un mililitro de la suspensión de liposomas calentada a una de las jeringas del extrusor.Luego, pase la suspensión entre las dos jeringas 11 veces. Mientras mantiene la suspensión de liposomas calentada para facilitar el ajuste de tamaño, pase los liposomas a través de un filtro de 45 micrones y luego a través de un filtro de 2 micrones. Para generar vesículas unilamelares grandes, agregue 20 microlitros de la suspensión de liposomas de cuatro nanomoles a 200 microlitros de una solución stock de siRNA de 20 micromoles y deje incubar durante diez minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue 80 microlitros de un stock de 500 micromoles del péptido diana RVG-9R a la solución de liposomas con siRNA y deje incubar durante diez minutos a temperatura ambiente.Prepare una suspensión de liposomas de origen animal mezclando 2,2 nanomoles de DSPE o DOTAP en diez mililitros de una solución de cloroformo a metanol en proporción dos a uno, con 1,6 nanomoles de colesterol y 2 nanomoles de DSPE peg. Posteriormente, aplique gas nitrógeno y, cuando se haya evaporado la mayor parte del disolvente, deje el matraz en la campana extractora durante la noche. Luego, agregue lentamente diez mililitros de PBS 1X calentado a 75 grados Celsius sobre la película lipídica delgada.Deje que los lípidos se rehidraten a 75 grados Celsius durante al menos una hora antes de ajustar el tamaño. Después de ajustar el tamaño de la suspensión de liposomas utilizando un extrusor como antes, pipetee 20 microlitros de cada una de las cuatro suspensiones de liposomas de nanomoles en alícuotas de un solo uso y liofilice durante 30 minutos utilizando un liofilizador de banco. A continuación, agregue 1,4 microlitros de una solución de sulfato de protamina de 26,6 micromolar a 200 microlitros de una solución stock de siRNA de 20 micromolar e incube durante diez minutos a temperatura ambiente para condensar el siRNA.Después de la incubación, rehidrate los pastillos de DSPE con 201,4 µL de solución de siRNA con protamina. Rehidrate los pastillos de DOTAP con 200 µL de una solución stock de siRNA de origen animal extranjero. Incube cada solución de liposomas con siRNA durante diez minutos a temperatura ambiente.A continuación, agregue diez microlitros de una solución de EDC 60 milimolar a cada tubo de liposomas rehidratados. Luego, agregue diez microlitros de una solución de sulfo-NHS 150 milimolar a la solución de liposomas con siRNA para ambos pallets de DOTAP y DSPE. Incube durante dos horas a temperatura ambiente.Por último, agregue 80 microlitros de una solución stock de 500 micromolar del péptido RVG-9R a la solución de entrecruzamiento de liposomas con siRNA e incube durante diez minutos a temperatura ambiente. Después de anestesiar un ratón utilizando del 2 al 3 por ciento de isoflurano en oxígeno, cubra los ojos del ratón con una pomada oftálmica y confirme la anestesia realizando una compresión del dedo del pie. Continúe solo si no hay ninguna reacción.Mientras se mantiene la anestesia, coloque al ratón en posición supina o lateral para acceder a la vena de la cola. Limpie la cola con etanol al 70 por ciento y luego utilice una jeringa de insulina de calibre 26 para inyectar 300 microlitros de LSPCs o palets en la vena de la cola. Comience a inyectar de forma distal y desplácese hacia proximal si la vena colapsa o se rompe.Coloque el ratón en una jaula limpia hasta que mantenga recostado esternal. Observe al animal durante varias horas después de la inyección para asegurarse de que la anestesia desaparezca y de que no haya efectos adversos del tratamiento. Después de permitir que las LSPCs o palets circulen durante al menos 24 horas y luego sacrificar al ratón, extirpe la mitad de un hemisferio cerebral.Luego, coloque la media hemiesfera y 2.5 mililitros de tampón fax sobre un filtro celular de malla de 40 micrones y utilice el émbolo de una jeringa para presionar el tejido a través del filtro hacia una placa de Petri. Enjuague el filtro celular y la placa de Petri con 2.5 mililitros adicionales de tampón fax. A continuación, transfiera la suspensión de células individuales a un tubo cónico de 15 mililitros y colóquelo en hielo.A continuación, pipete 100 microlitros de la suspensión celular en un tubo microcentrífugo y centrifugue durante cinco minutos a 350 ×g. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda el botón celular en un mililitro de tampón fax y centrifugue nuevamente. Luego, agregue otro mililitro de tampón fax y coloque la suspensión celular en hielo. Ahora, incube las células en 100 microlitros de bloqueador de Fc ratón anti-ratón en tampón fax durante 30 a 60 minutos en hielo.Después de centrifugar y lavar como antes, agregue 100 microlitros de solución fluorescente del anticuerpo primario y coloque en hielo durante 30 a 60 minutos. Tras un lavado final, resuspenda las células en un mililitro de tampón de lisis RVC durante un minuto. Luego, centrifugue las células.Después de desechar el tampón, resuspender en un mililitro de tampón de fax y colocar en hielo. Las células ya están listas para el análisis de fax. Los ratones tratados con siRNA administrado mediante LSPCs mostraron una disminución significativa de los niveles de proteína priónica celular en comparación con un control de PBS, que muestra niveles normales de proteína priónica celular.Los ratones tratados con LSPCs mostraron niveles de proteína priónica celular cercanos a los de un ratón con proteína priónica eliminada. En tres experimentos, los ratones tratados con LSPCs mostraron disminuciones significativas en los niveles de proteína priónica celular en comparación con los controles tratados con PBS. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los liposomas pueden almacenarse en el refrigerador durante varios meses, pero los LSPCs completos deben usarse dentro de las 24 horas posteriores al ensamblaje.Después de su desarrollo, la generación de LSPCs o palets allanará el camino para que los investigadores exploren más opciones terapéuticas en el campo de las enfermedades neurodegenerativas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

La encapsulación del fármaco mejora la especificidad de las células tumorales y reduce la neurotoxicidad.

Liberación mejorada por convección de liposomas cargados recubiertos de polietilenglicol en un tumor cerebral de rata

Fuente: Ullah, I., et.al. Un dispositivo de posicionamiento para la colocación de ratones durante la administración intranasal de ARNip al sistema nervioso central. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra una técnica de administración intranasal precisa para administrar complejos de péptido-ARNip dirigidos a neuronas al cerebro del ratón utilizando un dispositivo de posicionamiento especializado. Los ratones anestesiados se aseguran en una posición con la cabeza hacia abajo y hacia adelante...

Entrega intranasal de ARNip al cerebro del ratón mediante un dispositivo de posicionamiento

Fuente: Bender, H. R., et.al. Entrega de ARNip terapéutico al SNC mediante liposomas catiónicos y aniónicos. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la administración dirigida de ARNip de proteína priónica (PrP) a las neuronas utilizando complejos liposomales de ARNip-péptido (LSPC). Los liposomas catiónicos se unen electrostáticamente al ARNip dirigido a PrP, que se estabiliza aún más con el péptido RVG-9r para el transporte mediado por receptores a través de la barrera hematoencefálica. Una...

Administración dirigida de ARNip a las neuronas para el silenciamiento de proteínas priónicas mediante complejos liposomales

Inyecciones retro-orbitales repetidas de complejos catiónicos liposomes/siRNA/ITSN-1s en ratones, cada 72 horas durante 24 días, eficiente entregar el dúplex siARN de la microvasculatura pulmonar del ratón la reducción de ARNm ITSN-1s y expresión de la proteína en un 75%. Esta técnica es altamente reproducible en un modelo animal, no tiene efectos adversos y evita accidentes mortales.

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

Se describe un método para dirigir fármacos al sistema nervioso central ya sea por la implantación de un catéter o la realización de una inyección en bolo en el ventrículo lateral derecho en ratones. Nos centramos específicamente en la entrega de los oligonucleótidos antisentido. Esta técnica es fácilmente adaptable a otras drogas y para ratas.

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

Entrega sigue siendo el principal desafío para la aplicación terapéutica de pequeños ARN de interferencia (siRNA). Este protocolo implica el uso de una plataforma de entrega siRNA multifuncional y biocompatible, que consiste en arginina y polietilenimina injertada micropartículas de silicio poroso.

Silicio Poroso micropartículas para la entrega de siRNA Terapéutica

Aquí se describe un protocolo para la generación de nanoliposomas catiónicos, que se basan en el método de película seca y pueden ser utilizado para la caja fuerte y una entrega eficiente de in vitro transcribe ARN mensajero.

Generación de nanoliposomas catiónicos para la entrega eficiente de In Vitro transcribe ARN mensajero

Aquí, presentamos un protocolo utilizando un dispositivo de posicionamiento del ratón que permite la colocación adecuada de ratones para la administración intranasal de una formulación de péptido-siRNA dirigida al cerebro que permite un silenciamiento eficaz del gen en el sistema nervioso central.

Un dispositivo de posicionamiento para la colocación de ratones durante la entrega de siRNA intranasal al sistema nervioso central

Se presentan los métodos para preparar y caracterizar las propiedades fisicoquímicas y la bioactividad de las nanopartículas de siRNA con respuesta al pH, que son neutralmente cargadas. Se discuten los criterios para los nanomedicamentos siRNA exitosos, como el tamaño, la morfología, la carga superficial, la carga de siRNA y el silenciamiento del gen.

La preparación de nanopartículas poliméricas con capacidad de pH, cargadas de neutralmente, para la entrega de siRNA citosólica

Aquí, describimos un método para suministrar medicamentos al sistema nervioso central de la rata mediante la implantación de un catéter en el espacio intratecal lumbar de la columna vertebral. Nos centramos en la entrega de oligonucleótidos antisentido, aunque este método es adecuado para la entrega de otras modalidades terapéuticas también.

Entrega intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de Rata

Aprenda a diseñar un sistema de liberación de siRNA al cerebro usando liposomas catiónicos y aniónicos con péptidos neurodirigidos. Este método permite el transporte intravenoso a través de la barrera hematoencefálica para tratar enfermedades neurodegenerativas.

Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

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