Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

El objetivo general de este procedimiento es diseñar un sistema de administración que pueda administrar fármacos de moléculas pequeñas como el ARNip al cerebro. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la neurodegeneración, como ¿Es el siRNA una opción terapéutica viable para las enfermedades de mal plegamiento de proteínas? y ¿Podemos diseñar un sistema fiable de administración de fármacos al cerebro?

La principal ventaja de crear un sistema de administración de fármacos liposomales es que podemos administrar nuestro siRNA por vía intravenosa o a través del torrente sanguíneo en lugar de hacerlo directamente a través del tejido neuronal, lo que provoca daño neuronal. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapéutica y el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas, ya que esta técnica permite la administración específica a través de la barrera hematoencefálica, específicamente a las neuronas que expresan acetilcolina. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que las inyecciones de la vena de la cola de ratón son difíciles de aprender debido al pequeño tamaño de la vena de la cola de ratón.

Comience preparando una proporción uno a uno de DOTAP a colesterol. Para una preparación de liposomas animales extraños, mezcle dos nanomoles de DOTAP y dos nanomoles de colesterol en diez mililitros de una solución de cloroformo a metanol uno a uno. Luego, evapore nueve mililitros de la solución de cloroformo y metanol usando gas nitrógeno.

Evapore el último mililitro de solvente en una campana extractora durante la noche sin gas. Al día siguiente, debe verse una fina película lipídica en el fondo del matraz. Calentar este matraz con la película lipídica y diez mililitros de una solución de sacarosa al diez por ciento a 55 grados centígrados.

A continuación, pipetee lentamente la solución de sacarosa calentada sobre la fina película lipídica mientras agita suavemente el matraz. A continuación, ensamble un extrusor con filtros de una micra de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, añade un mililitro de la suspensión de liposomas calentada a una de las jeringas del extrusor.

A continuación, pase la suspensión entre las dos jeringas 11 veces. Mientras mantiene la suspensión de liposomas calentada para facilitar el dimensionamiento, dimensione los liposomas a 45 micras y un filtro de 2 micras Para generar vesículas grandes y unilamelares, a continuación, agregue 20 microlitros de la suspensión de liposomas de cuatro nanomoles a 200 microlitros de una solución de siRNA de 20 micromolares e incube durante diez minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada 80 microlitros de un caldo de 500 micromolares de péptido dirigido RVG-9R a la solución de liposoma siRNA e incube durante diez minutos a temperatura ambiente.

Prepare una suspensión de lipsomoe de un animal extraño mezclando 2,2 nanomoles de DSPE o DOTAP en diez mililitros de una solución de cloroformo a metanol de dos a uno con 1,6 nanomoles de colesterol y 2 nanomoles de DSPE peg. A continuación, aplique gas nitrógeno y cuando se haya evaporado la mayor parte del disolvente, deje el matraz en la campana extractora durante la noche. Luego, agregue lentamente diez mililitros de 1X PBS calentado a 75 grados Celsius a la fina película lipídica.

Deje que los lípidos se rehidraten a 75 grados centígrados durante al menos una hora antes de dimensionarlos. Después de dimensionar la suspensión de liposomas con una extrusora como antes, pipetee 20 microlitros de cada una de las cuatro suspensiones de liposomas de nanomoles en alícuotas de un solo uso y liofilicela durante 30 minutos con un liofilizador de sobremesa. A continuación, agregue 1,4 microlitros de una solución de 26,6 micromolares de sulfato de protamina a 200 microlitros de solución de siRNA de 20 micromolares e incube durante diez minutos a temperatura ambiente para condensar el siRNA.

Después de la incubación, rehidratar los palets de DSPE con 201,4 microlitros de solución de siRNA protamina. Rehidratar las paletas DOTAP con 200 microlitros de una solución madre de animales extraños de siRNA. Incubar cada solución de siRNA liposomada durante diez minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue diez microlitros de una solución de EDC de 60 milimolares a cada tubo de liposomas rehidratados. A continuación, añada diez microlitros de 150 milimolares de solución de sulfo-NHS a la solución de siRNA liposoma para los palets DOTAP y DSPE. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente.

Por último, agregue 80 microlitros de caldo de 500 micromolares del péptido RVG-9R a la solución de reticulación de liposomas siRNA e incube durante diez minutos a temperatura ambiente. Después de anestesiar a un ratón, usando un dos a tres por ciento de isoflurano en oxígeno, cubra los ojos del ratón con ungüento aptálmico y confirme una anestesia realizando un pellizco en el dedo del pie. Proceda solo si no hay una reacción.

Mientras mantiene la anestesia, coloque el ratón boca arriba o de lado para acceder a la vena de la cola. Limpie la cola con etanol al 70 por ciento y luego use una jeringa de insulina de calibre 26 para inyectar 300 microlitros de LSPC o palets en la vena de la cola. Comience a inyectar distalmente y muévase proximalmente si la vena colapsa o se rompe.

Coloque al ratón en una jaula limpia hasta que mantenga la decúbito esternal. Monitoree al animal durante varias horas después de la inyección para asegurarse de que el efecto de la anestesia desaparezca y no haya efectos nocivos del tratamiento. Después de permitir que los LSPC o paletas circulen durante al menos 24 horas y luego sacrificar al ratón, diseccione la mitad de un hemisferio del cerebro.

A continuación, coloque la mitad del hemisferio y 2,5 mililitros de tampón de fax en un colador de células de malla de 40 micras y utilice el émbolo de una jeringa para presionar el tejido a través del filtro en una placa de Petri. Enjuague el filtro de celdas y la placa de Petri con 2,5 mililitros adicionales de tampón de fax. A continuación, transfiera la suspensión de una sola célula a un tubo cónico de 15 mililitros y colóquela en hielo.

A continuación, pipetee 100 microlitros de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga y centrifugue durante cinco minutos a 350 veces G. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet de celda en un mililitro de tampón de fax y vuelva a centrifugar. A continuación, añada otro mililitro de tampón de fax y coloque la suspensión de la célula en hielo. Ahora, incube las células en 100 microlitros de bloque Fc anti-ratón para ratas en tampón de fax durante 30 a 60 minutos en hielo.

Después de peletizar y lavar como antes, agregue 100 microlitros de solución de anticuerpos primarios fluorescentes y colóquelos en hielo durante 30 a 60 minutos. Después de un lavado final, vuelva a suspender las células en un mililitro de tampón de lisis RVC durante un minuto. Luego, granule las células.

Después de desechar el tampón, vuelva a suspender en un mililitro de tampón de fax y colóquelo en hielo. Las celdas ya están listas para el análisis por fax. Los ratones tratados con siRNA administrado a través de LSPC mostraron una disminución significativa de los niveles de proteína priónica celular en comparación con un control PBS que muestra los niveles de proteína priónica celular de tipo tipo.

Los ratones tratados con LSPCs mostraron niveles de proteína priónica celular cercanos a los de un ratón knock-out de proteína priónica. A lo largo de tres experimentos, los ratones tratados con LSPC mostraron disminuciones significativas en los niveles de proteínas priónicas celulares en comparación con los controles de tipo PBS. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los liposomas se pueden almacenar en el refrigerador durante varios meses, pero los LSPC completos deben usarse dentro de las 24 horas posteriores al ensamblaje.

Tras su desarrollo, la generación de LSPCs o palets allanará el camino para que los investigadores exploren más opciones terapéuticas en el campo de las enfermedades neurodegenerativas.