Name: Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprende a registrar cambios de calcio en neuronas del bulbo olfatorio de Xenopus laevis usando tinción diferencial e imagen de calcio. Este método permite estudiar la sensibilidad térmica en redes neuronales olfativas.

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Este proyecto fue financiado por el DFG Excellence Cluster 171, el Centro de Microscopía a Nanoescala y Fisiología Molecular del Cerebro, el Centro Bernstein de Neurociencia Computacional y la Red ENC, un Programa Conjunto de Doctorado Erasmus Mundus. Los autores agradecen a Stephan Junek, Mihai Alevra y Guobin Bao por proporcionar códigos de MATLAB y programas personalizados para la evaluación de imágenes y el análisis de datos.

<ol><li>Mamasuew, K., Breer, H., Fleischer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+neurons+respond+to+cool+ambient+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion neurons respond to cool ambient temperatures.</a> Eur J Neurosci. 28 (9), 1775-1785 (2008).</li>
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<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
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<li>Junek, S., Chen, T. W., Alevra, M., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+correlation+imaging%3A+visualizing+function+and+structure+of+neuronal+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Activity correlation imaging: visualizing function and structure of neuronal populations.</a> Biophys J. 96 (9), 3801-3809 (2009).</li>
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<li>Bao, G., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+Accurate+Fitting+and+Filtering+of+Noisy+Exponentials+in+Legendre+Space%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSONE%22%5BJournal%5D)">Fast and Accurate Fitting and Filtering of Noisy Exponentials in Legendre Space.</a> PLoSONE. 9 (3), (2014).</li>
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<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li>
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<li>Hjorth, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+silent+cells%2C+synchronization+and+modulatory+activity+in+developing+cellular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Detection of silent cells, synchronization and modulatory activity in developing cellular networks.</a> Dev Neurobiol. , (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos presentados en este documento tienen por objeto el procesamiento de registro de la temperatura en el bulbo olfatorio de Xenopus laevis renacuajos. Las manchas de protocolo primeras y las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio y proporciona una preparación de la muestra en la que el sistema olfativo sigue siendo fundamentalmente intacta. Por lo tanto, la activación de la γ-glomérulo sensible a la temperatura se puede controlar y se compara con sus vecinos glomérulos quimio-sensible. La inervación bilateral única de este glomérulo se visualiza mediante la electroporación de células con espectralmente diferentes colorantes. Además, la carga de bolo permite la tinción de las células mitrales que abarcan un gran volumen dentro del bulbo olfatorio. Las señales inducidas por la temperatura de procesamiento de la red neuronal se revela mediante la adopción de medidas de estímulo de calcio con aplicaciones repetidas y, posteriormente, el análisis de los datos de imagen con la actividad de correlación. El protocolo se destacan dos sofisticada proce tinción<html> mientos, los cuales requieren la manipulación y la práctica prudente con el fin de lograr resultados satisfactorios y reproducibles. Durante la electroporación cualquier lesión de los animales se tiene que evitar, sobre todo cuando la colocación de los electrodos en las fosas nasales. De manera óptima, debe producirse ningún contacto con el epitelio olfativo. Tenga en cuenta que los animales siguen viviendo después del procedimiento de electroporación y su tiempo de recuperación deben tenerse en cuenta. Si la tinción sigue siendo demasiado débil después de una ronda de electroporación, que puede suceder dependiendo de los tipos de tintes utilizados, su intensidad puede ser mejorada mediante el aumento de la concentración de colorante en las fosas nasales. Dado que las moléculas de dextrano acoplado se transportan a través de varios mecanismos, incluyendo el transporte axonal lenta (a una velocidad de 1 a 2 mm / día 10) y difusión pasiva, otra alternativa es esperar 48 horas después de la electroporación antes de sacrificar los animales. Alternativamente, la electroporación se puede repetir después de un día de recuperación. jove_content &quot;&gt; carga bolo es un paso crítico ya que la cantidad de colorante entrar en las células mitrales es difícil de regular y depende de varios parámetros como el tamaño de la punta de la pipeta y la ubicación de la aplicación. Seguimiento del procedimiento bajo un microscopio de fluorescencia confocal demuestra ser útil para el ajuste de la duración de la aplicación de colorante y por lo tanto la generación de resultados de tinción similares a través de las preparaciones. Además, renacuajos previamente electroporadas se deben utilizar para determinar la mejor posición para la aplicación de colorante mediante la identificación de la posición del pequeño grupo (que comprende la γ-glomérulo). la mayoría paso crítico durante las mediciones es evitar tanto cambio y el blanqueo de la muestra. el cambio se puede evitar colocando cuidadosamente el flujo de dos colores en el microscopio. en cuanto a limitar el blanqueo de la zona de interés, el tiempo de medición se debe reducir a lo esencial . Bolus tinción de carga con colorantes sensibles al calcio sólo proporciona muycontraste limitado, ya que las células sanas generalmente tienen niveles bajos de calcio y por lo tanto muestran la fluorescencia basal débil. La aplicación de imágenes de actividad correlación elude esta limitación mediante la generación de contraste basado en estructuras de actividad y se destacan con señales de calcio similares. Este método de análisis post-adquisición calcula el factor de correlación entre la señal de calcio de una región seleccionada de interés (traza de referencia) y la de cada pixel individual en el volumen 3D. Por lo tanto, los resultados obtenidos dependen fuertemente el patrón de actividad seleccionado como traza de referencia. Si el principal objetivo es visualizar los patrones de inervación de células mitrales, se prefiere una señal de referencia derivada de la actividad neuronal espontánea, y la elección de las células mitrales más activos producirá los mejores resultados. Para revelar las redes de quimio o termo-sensibles de las células mitrales, rastros de referencia sólo contienen respuestas a cualquiera de histidina o Ringer frío deben ser seleccionados. La selección de un glomérulo toda or soma celular mitral como región de interés no siempre puede dar una traza de referencia clara, sobre todo si las estructuras que responden a los dos estímulos diferentes son acostado en uno encima del otro. En tal caso, a menudo es útil para seleccionar un área más pequeña del glomérulo o cuerpo de la célula como región de interés. En las últimas décadas, la electroporación se ha descrito como un método eficaz para teñir las células individuales o múltiples 11,12. Aquí se utiliza para etiquetar específicamente neuronas receptoras olfativas. Moléculas de dextrano conjugado dan la más alta eficiencia, y para colorantes no sensibles al calcio, el rango de selección es amplio y abarca el espectro completo que se utiliza típicamente en microscopía de fluorescencia 13. Sin embargo, colorantes sensibles al calcio que están sometidas a electroporación con éxito en las neuronas receptoras olfativas son por el momento limitado a dextrano de calcio-verde, y Fluo-4 dextrano si todavía está disponible comercialmente. Además, las grabaciones se dirigen principalmente superficial capas en la superficie ventral de sólo el bulbo olfatorio, ya que la profundidad de penetración de las técnicas de medición rápido es limitada. de dos fotones puede superar en parte esta limitación, pero a menudo carece de velocidad y restringe la cantidad de colorantes sensibles al calcio seleccionables más. Hemos descrito aquí un protocolo para medir la actividad inducida por la temperatura en el bulbo olfatorio. El neurópila cerebro es escaneada como un volumen tridimensional para visualizar las complejas redes celulares implicados en el procesamiento olfativo de la temperatura. Medición de la actividad inducida por la temperatura en el bulbo olfativo se ha informado muy recientemente 5 y requiere un procedimiento adaptado específicamente la combinación de diferentes técnicas. Un activo importante de las técnicas presentadas anteriormente es que cientos de células se crean imágenes en tres dimensiones en una preparación en donde la mayor parte del sistema olfativo se mantiene intacta. Estas ventajas ponen altas exigencias en las técnicas de tinción, así como el cerebro pla reparación y la proyección de imagen. Por ejemplo, la electroporación de células y carga de bolo golpean grandes cantidades de células en el epitelio olfativo y bulbo, y por lo tanto permiten la visualización de las redes celulares completos. Por otra parte, la entrega de los indicadores químicos a través de la carga de bolo en lugar de fluoróforos genéticamente codificados permite realizar mediciones en un conjunto potencialmente mayor de especies. Otras alternativas como la incubación baño con tintes de AM trabajan principalmente en rodajas que dañan gravemente el bulbo olfatorio, dejando sólo unos pocos cientos de micrómetros de tejido intacto. En comparación, la preparación entera de montaje utilizado en nuestro protocolo asegura por ejemplo que la inervación bilateral de la γ-glomérulo permanece intacto y las grabaciones son entonces retirados en un sistema todavía operativa. Por último, la formación de imágenes en sí se realiza mediante microscopía de línea de iluminación que permite la adquisición de volúmenes 3D. Microscopía Line-iluminación es una de las técnicas confocales proporcionan las velocidades de adquisición de posibles más altos 6 &lt;/ Sup&gt;, que son necesarios para cubrir una gran parte del bulbo olfatorio. sistemas de adquisición más lentos pueden ser usados ​​pero tienen la desventaja de que el tamaño del volumen registrado debe ser reducida. En los últimos años, otros métodos para la adquisición rápida de imágenes se han desarrollado y se pueden utilizar como alternativas 14,15. Sin embargo, la microscopía de línea de iluminación sigue siendo uno de los métodos más fáciles para ganar velocidad y resolución suficiente. Aquí sigue una cierta información como guía para seleccionar las configuraciones de imagen adecuados. Desde imágenes de calcio se realiza dentro de las preparaciones de cerebro de espesor, la configuración debe proporcionar confocalidad decente y los objetivos debe tener aperturas numéricas de 1.0 o superior. Para un punto de referencia, las grabaciones tomadas con el microscopio línea de iluminación corresponden a las imágenes tomadas con un microscopio de barrido láser estándar con un tamaño del agujero de alfiler de 0,5-1 unidades ventiladas. la velocidad de adquisición rápida es deseable. Un volumen con un espesor de 20 micras cubierto por al menos 5 lAyers, un campo lateral de vista de 100 micras x 100 micras y un tamaño de píxel de 0,5 micras o menor debe ser escaneado a una velocidad mínima de 1 Hz por pila. La reducción de la confocalidad puede aumentar la cantidad de fotones contados y por lo tanto permite adquisiciones más rápidas si es necesario, pero tiene el inconveniente de grabación más luz fuera de foco. Sin embargo, ya que este enfoque aumenta el grosor de las rodajas ópticos, sino que puede facilitar la localización de dendritas a través de diferentes planos z después de la aplicación de ACI 6. Las herramientas necesarias para estudiar ampliamente en las redes de procesamiento de temperatura del bulbo olfatorio se presentan en este documento. la actividad inducida por la temperatura se registra en el primer y segundo orden neuronas a través de los tintes y las señales de llegada o de salida de la γ-glomérulo sensibles al calcio. Además, el grado en que procesar las células mitrales individuales tanto información química y la temperatura se puede evaluar. Dado que la lea preparaciónves el bulbo olfatorio intacto, el papel de la inervación bilateral en el procesamiento olfativo puede ser estudiado más. El procedimiento también es útil para revelar si y cómo termopar y chemoinformation está codificado en la superposición de las redes olfativas 5. Por último, las técnicas mencionadas anteriormente no se limitan al estudio de las respuestas de temperatura en el bulbo olfatorio, pero se pueden aplicar para una evaluación más general del sistema olfativo, especialmente las redes de procesamiento celulares en grandes volúmenes tres dimensiones. Bolo de carga y de imagen actividad de correlación son herramientas poderosas para observar y comparar la actividad de las neuronas de decenas, por lo que es aplicable a diferentes redes cerebrales 16.

En los últimos años, la sensibilidad a la temperatura ya no se ha descrito solo como un sentido somestésico, sino también como una función fisiológica relevante para el sistema olfativo. En los roedores, el bulbo olfativo principal recibe información del ganglio de Grueneberg (GG), un órgano de la cavidad nasal formado por neuronas termosensibles. Las neuronas GG responden a las temperaturas frías1 así como a los estímulos químicos, y su quimiosensibilidad está modulada por las fluctuaciones de temperatura2. Estas observaciones sugieren que el bulbo olfatorio puede integrar información química y de temperatura recogida en la nariz. Con el fin de explorar esta hipótesis, presentamos aquí un conjunto de experimentos que permiten la detección de respuestas a la temperatura en el bulbo olfativo de animales no transgénicos, utilizando como modelo la larva de Xenopus laevis. La organización del sistema olfativo en estos animales se asemeja mucho a la de los mamíferos. Las neuronas receptoras olfativas de X. laevis premetamórfica terminan en penachos y hacen contactos sinápticos con las dendritas de las neuronas de segundo orden, las células mitrales. Las fibras pre y postsinápticas se entremezclan y forman estructuras neuropílicas en forma de madeja llamadas glomérulos3. Las abundantes sinapsis de la capa glomerular representan el primer centro de procesamiento de la información olfativa. Las células mitrales integran aún más la información sensorial y la transportan a las áreas olfativas más altas.
Hemos desarrollado un protocolo que combina la electroporación de neuronas receptoras olfativas (ORNs) con colorantes sensibles al calcio y no sensibles seguido de la carga en bolo de la red postsináptica de células glomérulas y mitrales. La tinción por electroporación de dos colorantes espectralmente distintos cargados en las cavidades nasales sirve para identificar el γ-glomérulo3 a través de su inervación bilateral por ORNs de ambos epitelios olfativos. Por lo tanto, la ubicación del γ-glomérulo se identifica antes de realizar mediciones adicionales. Posteriormente, se lleva a cabo la carga en bolo4 con acetoximetilo Fluo-8 (Fluo-8 AM) en un volumen que comprende el γ-glomérulo. La obtención de imágenes de los cambios en el calcio con microscopía confocal rápida permite la visualización de las respuestas de temperatura en el neuropilo 3D que rodea al γ-glomérulo, un glomérulo sensible a la temperatura único en este sistema5. Las células mitrales que inervan esta estructura específica también se pueden identificar por sus señales de Ca2+ que responden a las caídas de temperatura inducidas. A continuación, las imágenes de correlación de actividad6 utilizan las trazas específicas de Ca2+ de estas células para revelar la morfología dendrítica de las células mitrales termosensibles. Se pueden utilizar aplicaciones repetidas alternas de solución fría de Ringer y odorantes químicos en una medición para visualizar las redes de células mitrales para el procesamiento de olores y temperaturas que rodean el γ-glomérulo e identificar posibles superposiciones. Para asignar sin ambigüedades las respuestas al estímulo químico o a la temperatura, monitoreamos constantemente la temperatura en el epitelio olfativo.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td>Cloruro de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodio</td><td>Merck Millipore</td><td>1064040500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Merck Millipore</td><td>1049360250</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Merck Millipore</td><td>1023820250</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Merck Millipore</td><td>1058330250</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa</td><td>Merck Millipore</td><td>1083371000</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck Millipore</td><td>1101100250</td><td></td></tr><tr><td>Verde Calcio 10 kDa Dextrano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C-3713</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-22914</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>TEFlabs</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>MK571</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>340-021-M005</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Ácido plurónico F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>polvo</td></tr><tr><td>L-Histidina monoclorhidrato monohidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53370</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck Millipore</td><td>1029522500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr>Electronic pipeta de <tr><td></td><td>repetición BrandTech HandyStep Pipeta</td><td></td>electrónica <td></td> de repetición</tr><tr><td>Termopar NiCr-Ni</td><td>Greisinger Elektronik</td><td>GTF 300</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Narishige</td><td>Modelo PC-10</td><td>Tirador de dos pasos</td></tr><tr><td>Aplicador de embudo</td> <td>(hecho a medida)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de iluminación lineal</td> <td>(hecho a medida)</td><td></td> <td>de lo contrario, un microscopio de disco giratorio disponible en el mercado</td></tr><tr><td>Objetivo W Plan-Apochromat 63X/1.0&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>441470-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Los MathWorks</td><td></td><td>desde R2010b en adelante</td></tr></tbody></table>

grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de<em&gt; xenopus laevis</em

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

El sistema olfativo, especializado en la detección, integración y procesamiento de moléculas químicas, es probablemente el sistema sensorial más estudiado. Sin embargo, cada vez hay más pruebas de que el olfato no se limita únicamente a la sensibilidad química, sino que también incluye la sensibilidad a la temperatura. Los Xenopus laevis premetamórficos son animales translúcidos, con cavidades nasales protuberantes privadas de la placa cribiforme que separa la nariz y el bulbo olfatorio. Estas características los hacen muy adecuados para el estudio del olfato y, en particular, de la termosensibilidad. El presente artículo describe el procedimiento completo para medir las respuestas de temperatura en el bulbo olfatorio de larvas de X. laevis. En primer lugar, la electroporación de las neuronas receptoras olfativas (ORNs) se realiza con tintes espectralmente distintos cargados en las cavidades nasales con el fin de teñir sus terminales axónicos en el neuropilo bulbar. La tinción diferencial entre las neuronas receptoras izquierda y derecha sirve para identificar el γ-glomérulo como la única estructura inervada por aferentes presinápticos contralaterales. En segundo lugar, la electroporación se combina con la carga focal del bolo en el bulbo olfatorio para teñir las células mitrales y sus dendritas. A continuación, se escanea el volumen cerebral en 3D bajo microscopía de iluminación lineal para la adquisición de datos rápidos de imágenes de calcio, mientras que se inducen pequeñas caídas de temperatura en el epitelio olfativo. Por último, el análisis post-adquisición permite la reconstrucción morfológica de la red termosensible que comprende el γ-glomérulo y sus células mitrales inervantes, a partir de trazas específicas de Ca2+ inducidas por temperatura. El uso de odorantes químicos como estímulos, además de los saltos de temperatura, permite la comparación entre redes termosensibles y quimiosensibles en el bulbo olfativo.

La electroporación de las neuronas olfativas del receptor (NRO) se logró con colorantes Alexa Fluor o indicadores de calcio conjugados con moléculas de dextrano para el etiquetado anterógrada a través del transporte axonal activo. Mientras que el primero colorantes proporcionan una tinción brillante de las neuronas sensoriales y sus terminales de los axones de ramificación en la capa glomerular del bulbo, este último permitir la medición de la actividad neuronal en estas células (figuras 1 y 2). En primer lugar, la posición de la termosensible γ-glomérulo y su patrón de inervación se visualizó mediante electroporación Alexa Fluor 647 dextrano y Alexa Fluor 546 de dextrano en el epitelio olfativo izquierda y derecha, respectivamente (Figura 1A). Veinticuatro horas después del procedimiento, los ORNs en las fosas nasales, los dos nervios olfativos y los glomérulos en ambos hemisferios eran visibles bajo microscopía fluorescente. Los diferentes grupos glomerulares fueron identifiable por sus respectivas posiciones, en particular el pequeño grupo que comprende la γ-glomérulo (Figura 1B). Un pequeño número de fibras olfativas contralateral corrió a través del bulbo olfatorio contralateral, cruzó la comisura anterior y terminado en el mismo lado γ-glomérulo (Figura 2A). Con el fin de registrar las respuestas de calcio de las fibras presinápticas de la γ-glomérulo, calcio verde dextrano se sometió a electroporación en ORNs, de acuerdo con el mismo procedimiento. saltos de temperatura negativos fueron inducidos en la ventana de la nariz a través de la liberación controlada de solución de Ringer enfriada con hielo (0-1 ° C). Un volumen 3D que comprende la γ-glomérulo fue fotografiada con un microscopio confocal línea de iluminación-rápido. Delta TS de -1 ° C fueron suficientes para desencadenar respuestas frías en la γ-glomérulo y sus aferentes, reconocibles como picos reversible en el Delta F / F de Ca2 + trazas (Figura 2B &lt;/ strong&gt;, C). Otras medidas experimentales se llevaron a cabo para medir la actividad inducida por el frío en las células mitrales conectados a la γ-glomérulo a través de sus terminaciones dendríticas ramificadas. Estas fibras postsinápticas y el neurópila rodea se tiñeron con eficacia por la carga de bolo del colorante sensible al calcio Fluo-8 de la mañana, llevaron a cabo pocos días después de Alexa 647 dextrano había sido electroporación en NRO (Figura 3A, B). células mitrales se llenaron con Fluo-08 a.m., y el epitelio olfativo se estimularon dos veces de acuerdo con el siguiente paradigma: Ringer frío, histidina (10 mM) y a temperatura ambiente Ringer, aplicados posteriormente. Dos rastros de referencia se tomaron de las regiones de interés en el volumen registrado, una de responder exclusivamente a temperatura baja, el otro, a histidina solamente. Actividad de formación de imágenes de correlación (ACI) 6 se calcula en base a la referencia seleccionadatraza de visualizar con alto contraste en la morfología dendrítica de las redes postsinápticos correspondientes ya sea a la temperatura o la señal de Ca2 + histidina-sensible (Figura 3C, D). Finalmente, mapas termosensibles y sensibles a la quimioterapia eran un código de colores y superpuestos uno encima del otro, que muestra cómo la temperatura y la información química se transporta desde los glomérulos individuales a las neuronas de segundo orden olfativas (Figura 3E). Para una descripción de la integración y el procesamiento de los dos tipos de información en redes de olfativas compartidas, consulte Kludt et al. 5 <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig1.jpg" /> Figura 1: Visión general de la electroporación ORN y el bolo de carga (A) neuronas olfativas del receptor en ambas cavidades nasales de X.. laevis larvas se sometieron a electroporación con colorantes Alexa o Calciucolorantes-m sensible acoplados a moléculas de dextrano. Los indicadores fluorescentes fueron transportados anterogradely hasta que la arborización axonal terminal. 24 horas después de la electroporación, la capa glomerular en ambos hemisferios mostró tinción fluorescente. (B) Representación esquemática de la organización celular del bulbo olfatorio en un hemisferio. La capa glomerular se extiende por la bombilla en grupos: los grupos mediales, pequeños, intermedios y laterales. La información olfativa se transfiere de las neuronas receptoras mitral células a través de las sinapsis excitadoras en glomérulos. células periglomerular y células granulares son neuronas inhibitorias que modulan el procesamiento olfativo y codificación. El γ-glomérulo (cian) se identificó fácilmente como la pequeña neuropil donde ipsilateral (rojo) y fibras olfativas contralaterales (naranja) se fusionaron. (C) de carga de bolo se logró en el entorno de la γ-glomérulo para teñir el neuropilo post-sináptica que consiste principalmente de células mitrales y su dendritic árboles de ramificación considerablemente en la capa glomerular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig2.jpg" /> Figura 2: La electroporación de ORNs revela la conectividad estructural y funcional (A) inervación bilateral de la γ-glomérulo por ipsilateral (verde) y contralaterales (rojo), las neuronas olfativas del receptor (ORNs).. Barra de escala = 50 micras. (B) El bulbo olfatorio después de la electroporación con el calcio colorante sensible al calcio verde dextrano. El intermedial (IMC), medial (MC) y el pequeño grupo (SC) son visibles. La imagen es una proyección máxima de volumen de medición micras de espesor 100. Barra de escala = 50 micras. (C) Vista de primer plano del pequeño grupo. El volumen registrado (12 micras) esrepresentado en una proyección máxima. La imagen representa el nivel de fluorescencia basal en el mapa gris y el código de colores? F / F como una superposición. La respuesta máxima a la estimulación con solución de Ringer frío se representa. El γ-glomérulo reaccionó fuertemente, mientras que los dos glomérulos vecinos permanecen en silencio. El recuadro muestra la traza Delta F / F para la γ-glomérulo correspondiente a la región indicada de interés. La barra azul representa la aplicación de estímulos. Barra de escala = 20 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54108/54108fig3.jpg" /> Figura 3:. Bolo de carga y ACI se disocian termosensible y redes sensibles a la quimioterapia (A) Los axones de la NRO que terminan en el pequeño grupo se tiñeron mediante electroporación con el no-calcium colorante sensible Alexa 647 dextrano. La línea punteada describe la γ-glomérulo. (B) Imagen de la misma región que en (A) en el segundo canal de medición después de la carga de bolo con el colorante sensible al calcio Fluo-08 a.m.. Algunos cuerpos celulares de células mitrales eran visibles, pero el contraste era limitado. Siguiendo las flechas, dos trazas de respuesta se representaron gráficamente, que se utilizaron para obtener imágenes de la actividad de correlación (ACI). Azul, rojo y negro bares por debajo de los restos representan el inicio de la aplicación de Ringer frío, histidina (10 mM) y la temperatura ambiente en dos colores como control negativo, respectivamente. Los dos Ca 2 + trazas fueron tomadas de diferentes regiones de interés del volumen medido. (C) El resultado de la traza de ACI en (B) destacando las áreas que responden predominantemente a Ringer frío. (D) El resultado de la traza de ACI en (B) destacando las áreas que responden predominantemente a la histidina. (E) Superposición de los dos mapas de ACI. células mitrales que responden a histidine y el glomérulo inervado (rojo) eran fácilmente distinguibles de las células mitrales termosensibles y la γ-glomérulo (cian). Todas las imágenes de esta figura son proyecciones de máxima intensidad de un volumen de 28 micras de espesor. Barra de escala = 20 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54108/54108fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí describimos un protocolo para medir y analizar las respuestas de temperatura en el bulbo olfatorio de Xenopus laevis. Las neuronas receptoras olfativas y las células mitrales se tiñen diferencialmente, después de lo cual se registran los cambios en el calcio, lo que refleja una sensibilidad de algunas redes neuronales en el bulbo a las caídas de temperatura inducidas en la nariz.

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

El objetivo general de este procedimiento es registrar los cambios de calcio en neuronas del bulbo olfatorio en respuesta a descensos de temperatura inducidos en el epitelio nasal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las afecciones, como la forma en que el bulbo olfatorio integra y procesa la información de temperatura adquirida en la nariz. Las neuronas de primer y segundo orden del bulbo olfatorio se tiñen de manera diferencial y los efectos de las fluctuaciones de temperatura en el epitelio nasal se miden mediante imágenes de calcio.La demostración visual de la electro poración celular, la carga en bolo y la imagen de correlación de actividad facilitará la implementación de estas técnicas en redes cerebrales distintas del bulbo olfatorio. Para comenzar este procedimiento, coloque una renacuaja sobre un cojín de gel. Fíjela colocando agujas alrededor y tenga cuidado de no atravesar la piel con las agujas.A continuación, coloque el animal bajo el microscopio estereoscópico y enfoque las fosas nasales. Luego, coloque un cristal de colorante en una de las cavidades nasales y espere hasta que se disuelva completamente, lo cual debería tardar menos de un minuto. Si los cristales son más pequeños, agregue dos o tres en cada cavidad hasta que produzcan una solución altamente concentrada y no translúcida.A continuación, coloque el cátodo sobre la piel de la rana y el ánodo dentro de una de las fosas nasales. Aplique seis pulsos de 20 voltios y 20 milisegundos con un intervalo de estimulación de aproximadamente 0,5 segundos. Para colorantes con una polaridad diferente, los resultados de tinción pueden mejorar colocando el cátodo dentro de las fosas nasales.Si no está seguro sobre la polaridad del colorante, se pueden colocar ambos electrodos simultáneamente en las fosas nasales e intercambiar la polaridad entre pulsos de voltaje individuales. Después de sacrificar el animal, use un escalpelo para diseccionar un bloque de tejido que contenga las cavidades nasales, los nervios olfatorios y los bulbos olfatorios. Realice la primera incisión cerca de la fosa nasal izquierda y mueva la hoja hacia adelante, cortando junto al nervio y al bulbo olfatorio izquierdo hasta alcanzar el límite telencefálico-diencefálico.Repita de manera similar en el lado derecho. A continuación, aísle la preparación del resto del sistema nervioso realizando un corte final posterior al telencéfalo. Fije nuevamente el bloque de tejido insertando dos agujas entre los nervios olfatorios.Luego, coloque una gota de solución de Ringer para rana sobre el tejido. Bañar la preparación en solución de Ringer evitará que los tejidos cerebrales colapsen durante la disección. Después de eso, retire las meninges que cubren la zona de clasificación de axones y los bulbos olfatorios realizando tres incisiones.Comenzando desde el borde posterior del bloque de tejido, corte de caudal a rostral justo a lo largo del bulbo olfatorio izquierdo hasta el punto de entrada de los nervios olfatorios en los bulbos. Repita este procedimiento para el hemisferio derecho. Posteriormente, levante las meninges con pinzas y realice el tercer corte perpendicular a los anteriores en la zona de clasificación de axones.A continuación, transfiera la muestra a una cámara de registro llena con Ringer de rana para su procesamiento e imagen adicional. Asegúrese de que el lado ventral esté orientado hacia arriba y sujete la muestra con una red de fibras de nailon extendida sobre un pequeño marco de platino. Para facilitar la aplicación de estímulos, coloque las cavidades nasales encima de una de las fibras de nailon.En este procedimiento, llene la micropipeta con 10 microlitros de la solución y elimine las burbujas de aire golpeando suavemente la micropipeta. A continuación, coloque la micropipeta en un soporte para pipetas. Asegúrese de que se pueda aplicar presión manualmente mediante una jeringa o un dispositivo neumático de expulsión de fármacos, y supervise la presión aplicada con un manómetro.Luego, baje la pipeta sobre la superficie del bulbo olfatorio con la punta orientada hacia la dirección rostral de la preparación. Aplique una pequeña presión positiva constante a la micropipeta para evitar el obstrucción de la pipeta. Inserte suavemente la micropipeta en el tejido y aplique una presión positiva.Confirme el flujo de salida de la pipeta observando pequeños movimientos del tejido visibles bajo iluminación con luz brillante cuando se aplica la presión. Después de 10 minutos de carga, reduzca la presión aplicada a cero y verifique la tinción. El tamaño del área teñida varía significativamente y depende de varios parámetros, como la cantidad de colorante inyectado y la ubicación del sitio de eyección.Una buena tinción cubre un área de aproximadamente 100 micrómetros por 100 micrómetros. Observe la carga progresiva del colorante en los somas de las células mitrales a lo largo del tiempo durante la carga en bolo. Si la intensidad de la tinción o el número de células mitrales teñidas no aumenta, verifique si la pipeta está obstruida y cámbiela si es necesario.En este paso, supervise la temperatura del Ringer enfriado insertando la sonda limpia del termómetro en el tubo. Espere hasta que la temperatura descienda por debajo de un grado Celsius antes de comenzar el experimento. A continuación, utilice un aplicador de embudo que permita la administración del estímulo simultáneamente al Ringer en perfusión, de modo que el flujo de agua en la cámara permanezca constante e ininterrumpido durante la liberación de la solución de estímulo.Luego, coloque el embudo de manera que la salida distal esté a menos de un milímetro del epitelio olfativo. Posteriormente, coloque un sensor de temperatura de níquel-cromo conectado a un termómetro digital cerca del epitelio y de la salida del aplicador de embudo. Conecte el puerto de salida del termómetro a una computadora para registrar y mostrar visualmente los cambios de voltaje que reflejan pequeñas fluctuaciones de temperatura.Después de eso, inicie la adquisición de imágenes y aplique secuencialmente de 200 a 400 microlitros de Ringer frío, L-histidina y Ringer a temperatura ambiente mediante una pipeta electrónica con un intervalo entre estímulos de 20 a 30 segundos. Para un mejor control de la aplicación del estímulo, libere el estímulo mediante una señal de activación enviada por el sistema de imagen elegido a la pipeta, si es posible. En este procedimiento, cargue los datos brutos adquiridos como una variable en el espacio de trabajo del usuario de MATLAB, organizados como una matriz x, y, z, t, donde x e y corresponden a las dimensiones laterales, z a la dirección axial y t al curso temporal.A continuación, llame a ACI desde la línea de comandos de MATLAB. En la interfaz de usuario, seleccione Preparar datos, luego seleccione la variable que contiene los datos y un directorio en el cual se guardarán los resultados. Desplácese a través de las capas z medidas moviendo el control deslizante correspondiente en la interfaz de usuario para obtener una visión general del mapa de varianza mostrado.A continuación, ingrese el tamaño de la ROI en la interfaz de usuario. Para el soma de una célula mitral, ajuste la ROI para que abarque aproximadamente 10 micrómetros en la dirección lateral y cinco micrómetros en la dirección axial. Para un glomérulo, son apropiados valores ligeramente superiores de 20 micrómetros en sentido lateral y 10 micrómetros en sentido axial. Luego, seleccione una ROI que contenga el glomérulo gamma y regiones adicionales para cada soma visible de las células mitrales circundantes haciendo clic con el botón central del ratón sobre el centro de la célula o del glomérulo.A continuación, cierre la interfaz de usuario principal, lo que desencadena el cálculo de los mapas de correlación para todas las trazas de referencia. El resultado se guarda y muestra automáticamente. Esta imagen muestra que los axones de las ORN que terminan en el cúmulo pequeño fueron marcados mediante electroporación con un colorante no sensible al calcio, el Dextrano Alexa 647.La línea punteada delinea el glomérulo gamma. Se muestra aquí una imagen de la misma región en el segundo canal de medición tras la carga rápida con un colorante sensible al calcio, Fluo-8 AM. Algunos somas de células mitrales eran visibles, pero el contraste era limitado. Se trazaron dos registros de respuesta para la imagen de correlación de actividad; las barras azul, roja y negra debajo de los trazos representan el inicio de la aplicación de Ringer frío, histidina a 10 micromolar y Ringer a temperatura ambiente como control negativo, respectivamente.El resultado del ICA de la traza en las áreas resaltadas que responden predominantemente al Ringer frío se muestra aquí. Y aquí se presenta el resultado del ICA de la traza en las áreas resaltadas que responden predominantemente a la histidina. Esta imagen muestra la superposición de los dos mapas de ICA.Las células mitrales que responden a la histidina y al glomérulo inervado eran fácilmente distinguibles de las células mitrales termosensibles en el glomérulo gamma. Este procedimiento puede realizarse para investigar si la termosensibilidad y la quimiosensibilidad se encuentran en redes neuronales solapadas y ocultas del bulbo olfatorio. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar el procesamiento de la temperatura en el bulbo olfatorio mediante la electroforesis celular en animales vivos, la carga en bolo y la imagen de correlación de actividad, también llamada ACI.La administración en bolo y la ACI son herramientas poderosas para observar y comparar la actividad y conectividad de docenas de neuronas en 3D, lo que las hace fácilmente aplicables a diferentes regiones cerebrales y redes neuronales.

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La comprensión de la función del sistema nervioso central de vertebrados requiere grabaciones de muchas neuronas porque la función cortical surge en el nivel de las poblaciones de neuronas. Aquí se describe un método óptico para registrar la actividad neuronal con suprathreshold resolución unicelular y único punta-, vaciló al azar escaneado en acceso. Este método graba somáticas fluorescencia señales de calcio de hasta 100 neuronas con alta resolución temporal. Un algoritmo de máxima...

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Visualización de la afluencia de calcio en las neuronas ventrales del mesencéfalo derivadas de embriones de ratón

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Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

Se describen procedimientos para realizar registros simultáneos del potencial o corriente de membrana y los cambios en la concentración de calcio intracelular. Las neuronas del núcleo supraquiasmático se llenan con el indicador de calcio bis-fura-2 mediante un electrodo de pinza de parche en la configuración de pinza de parche de toda la célula.

Registro electrofisiológico simultáneo e imágenes de calcio de neuronas del núcleo supraquiasmático

Aquí presentamos una novela Ca 2+ -Imagenología enfoque utilizando un reportero bioluminiscente. Este método utiliza una construcción GFP-aequorina fundida que se une a Ca 2+ y emite luz, eliminando la necesidad de excitación luz. Significativamente este método permite la proyección de imagen continua de largo, el acceso a las estructuras cerebrales profundas y alta resolución temporal.

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Este protocolo describe el uso de genéticamente codificados Ca2 + periodistas a registramos cambios en la actividad neuronal en comportarse gusanos Caenorhabditis elegans .

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso en vivo. Se describen metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de Xenopus larvas en condiciones normales de cría o después de la lesión.

Evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de Xenopus de vida

Aquí presentamos un protocolo con el que el calcio pre y/o postsináptico se puede visualizar en el contexto del aprendizaje y la memoria de Drosophila. La imagen de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinaptically se combina con un paradigma de acondicionamiento olfativo clásico de tal manera que se puede determinar la plasticidad sináptica subyacente a este tipo de aprendizaje asociativo.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Aprende a registrar cambios de calcio en neuronas del bulbo olfatorio de Xenopus laevis usando tinción diferencial e imagen de calcio. Este método permite estudiar la sensibilidad térmica en redes neuronales olfativas.

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal

Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de

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