Grabación de la actividad neuronal inducida por temperatura a través de la supervisión de cambios de calcio en el bulbo olfatorio de Xenopus laevis

El objetivo general de este procedimiento es registrar los cambios de calcio en las neuronas del bulbo olfativo en respuesta a las caídas de temperatura inducidas en el epitelio nasal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las afecciones, como la forma en que el bulbo olfativo se integra y procesa la información de temperatura adquirida en la nariz. Las neuronas de primer y segundo orden del bulbo olfatorio se tiñen diferencialmente y los efectos de las fluctuaciones de temperatura en el epitelio nasal se miden mediante imágenes de calcio.

La demostración visual de la electroporación celular, la carga del bolo y las imágenes de correlación de actividad facilitará la implementación de estas técnicas en redes cerebrales distintas al bulbo olfatorio. Para comenzar este procedimiento, coloque un renacuajo sobre una almohadilla de gel. Arréglalo colocando agujas alrededor y ten cuidado de no pinchar las agujas a través de su piel.

A continuación, coloque al animal bajo el microscopio estereoscópico y concéntrese en las fosas nasales. Luego, coloque un cristal de tinte en una de las cavidades nasales y espere hasta que se disuelva por completo, lo que debería tomar menos de un minuto. Si los cristales son más pequeños, agregue dos o tres en cada cavidad hasta que produzcan una solución no translúcida y altamente concentrada.

Después de eso, coloque el cátodo en la piel del renacuajo y el ánodo en una de las fosas nasales. Aplique seis pulsos de 20 voltios y 20 milisegundos con aproximadamente 0,5 segundos de intervalo de estímulo. Para tintes con una polaridad diferente, los resultados de la tinción pueden mejorarse colocando el cátodo en las fosas nasales.

Si no está seguro de la polaridad del tinte, ambos electrodos pueden colocarse simultáneamente en las fosas nasales y alternar la polaridad entre pulsos de voltaje único. Después de sacrificar al animal, use un bisturí para diseccionar un bloque de tejido que contenga las cavidades nasales, los nervios olfativos y los bulbos olfativos. Realice la primera incisión cerca de la fosa nasal izquierda y mueva la cuchilla hacia adelante, cortando a lo largo del nervio olfatorio izquierdo y el bulbo hasta el borde telencefálico-diencefálico.

Repita lo mismo en el lado derecho. A continuación, aísla la preparación del resto del sistema nervioso haciendo un corte final posterior al telencéfalo. Vuelva a sujetar el bloque de tejido insertando dos agujas entre los nervios olfativos.

Luego, coloque una gota de solución de Frog Ringer en el pañuelo. Bañar la preparación en solución de Ringer evitará que los tejidos cerebrales colapsen durante la disección. Después de eso, retire las meninges que cubren la zona de clasificación de axones y los bulbos olfativos haciendo tres incisiones.

Comenzando desde el borde posterior del bloque de tejido, corte caudorostralmente a lo largo del bulbo olfatorio izquierdo hasta el punto de entrada de los nervios olfativos en los bulbos. Repita este procedimiento para el hemisferio derecho. Posteriormente, elevar las meninges con pinzas y realizar el tercer corte perpendicular a los anteriores en la zona de clasificación de axones.

Después de eso, transfiera la muestra a una cámara de grabación llena de Frog Ringer para su posterior procesamiento e imagen. Asegúrese de que el lado ventral esté hacia arriba y asegure la muestra con una red de fibras de nailon extendida sobre un pequeño marco de platino. Para una aplicación más fácil de los estímulos, coloque las cavidades nasales encima de una de las fibras de nylon.

En este procedimiento, llene la micropipeta con 10 microlitros de la solución y elimine las burbujas de aire agitando la micropipeta. A continuación, monte la micropipeta en un soporte para pipetas. Asegúrese de que la presión se pueda aplicar manualmente con una jeringa o un dispositivo neumático de expulsión de medicamentos y controle la presión aplicada con un manómetro.

A continuación, baje la pipeta sobre la superficie del bulbo olfativo con la punta apuntando hacia la dirección rostral de la preparación. Aplique una presión positiva pequeña y constante a la micropipeta para evitar la obstrucción de la pipeta. Inserte suavemente la micropipeta en el tejido y aplique una presión positiva.

Confirme el flujo de salida de la pipeta observando los ligeros movimientos del tejido visibles bajo una iluminación de luz brillante cuando se aplica la presión. Después de 10 minutos de carga, reduzca la presión aplicada a cero y verifique la mancha. El tamaño del área manchada varía significativamente y depende de varios parámetros, como la cantidad de tinte inyectado y la ubicación del sitio de expulsión.

Una buena tinción cubre un área de aproximadamente 100 micrómetros por 100 micrómetros. Controlar la carga progresiva de colorante de los somas de células mitrales a lo largo del tiempo durante la carga en bolo. Si la intensidad de la tinción o el número de células mitrales teñidas no aumentan, compruebe si la pipeta está obstruida y sustitúyala si es necesario.

En este paso, controle la temperatura del timbre enfriado insertando la sonda de termómetro limpia en el tubo. Espere hasta que la temperatura baje de un grado centígrado antes de comenzar el experimento. A continuación, utilice un aplicador de embudo que permita la entrega de estímulos de forma concomitante al timbre perfundidor para que el flujo de agua en la cámara permanezca constante e ininterrumpido durante la liberación de la solución de estímulo.

A continuación, coloque el embudo de tal manera que la salida distal esté a menos de un milímetro del epitelio olfativo. A continuación, coloque un sensor de temperatura de nicromo conectado a un termómetro digital cerca del epitelio y de la salida del aplicador de embudo. Conecte el puerto de salida del termómetro a una computadora para registrar y mostrar visualmente los cambios de voltaje que reflejan pequeñas fluctuaciones de temperatura.

Después de eso, inicie la adquisición de imágenes y aplique secuencialmente de 200 a 400 microlitros de Ringer frío, L-histidina y Ringer a temperatura ambiente a través de una pipeta electrónica con un intervalo entre estímulos de 20 a 30 segundos. Para un mejor control de la aplicación del estímulo, libere el estímulo con una señal de activación enviada por la configuración de imagen elegida a la pipeta si es posible. En este procedimiento, cargue los datos brutos adquiridos como una variable en el espacio de trabajo del usuario de MATLAB, organizados como una matriz x, y, z, t, donde x e y se refieren a las dimensiones laterales, z, la dirección axial, y t, el curso del tiempo.

A continuación, llame a ACI desde la línea de comandos de MATLAB. En la interfaz de usuario, seleccione Preparar datos y, a continuación, seleccione la variable que contiene los datos y un directorio en el que se guardarán los resultados. Desplácese por las capas z medidas moviendo el control deslizante correspondiente en la interfaz de usuario para obtener una descripción general del mapa de varianza que se muestra.

Después de eso, ingrese el tamaño del ROI en la interfaz de usuario. Para un soma de células mitrales, ajuste el ROI para abarcar aproximadamente 10 micrómetros en la dirección lateral y cinco micrómetros en la dirección axial. Para un glomérulo, los valores ligeramente más altos de 20 micrómetros lateralmente y 10 micrómetros axialmente son apropiados. A continuación, seleccione un ROI que contenga el glomérulo gamma y regiones adicionales para cada soma visible de las células mitrales circundantes haciendo clic con el botón central del ratón en el centro de la célula o glomérulo.

Después, cierre la interfaz de usuario principal, que desencadena el cálculo de mapas de correlación para todos los seguimientos de referencia. El resultado se guarda y se muestra automáticamente. Esta imagen muestra que los axones de los ORNs que terminan en el pequeño grupo fueron teñidos por electroporación con un colorante no sensible al calcio, Alexa 647 Dextran.

La línea punteada delinea el glomérulo gamma. Aquí se muestra una imagen de la misma región en el segundo canal de medición después de la carga en bolo con un colorante sensible al calcio, Fluo-8 AM. Algunos somas de células mitrales eran visibles, pero el contraste era limitado. Se trazaron dos trazas de respuesta para las imágenes de correlación de actividad, las barras azules, rojas y negras debajo de las trazas representan el inicio de la aplicación de Ringer frío, histidina a 10 micromolares y Ringer a temperatura ambiente como control negativo, respectivamente.

Aquí se muestra el resultado ACI del seguimiento en las áreas resaltadas que responden predominantemente al timbre frío. Y aquí está el resultado ACI del rastreo en las áreas resaltadas que responden predominantemente a la histidina. Esta imagen muestra la superposición de los dos mapas ACI.

Las células mitrales que respondieron a la histidina y al glomérulo inervado se distinguieron fácilmente de las células mitrales termosensibles en el glomérulo gamma. Este procedimiento se puede realizar para investigar si la termosensibilidad y la quimiosensibilidad están en redes neuronales encubiertas y superpuestas del bulbo olfatorio. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo registrar el procesamiento de la temperatura en el bulbo olfativo mediante la electroporación celular en animales vivos, la carga de bolo y las imágenes de correlación de actividad, también llamadas ACI.

La carga en bolo y el ACI son herramientas poderosas para observar y comparar la actividad y la conectividad de docenas de neuronas en 3D, lo que los hace fácilmente aplicables a diferentes regiones del cerebro y redes neuronales.