El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

El objetivo general de este procedimiento es aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado que puedan utilizarse posteriormente para el análisis de citometría de flujo o un medio alternativo de caracterización. Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en inmunología de la mucosa, como cómo afecta la microbiota al desarrollo del sistema inmunitario intestinal. Las principales ventajas de esta técnica son que son rápidas, reproducibles y no requieren laboriosos gradientes de Percoll.

Para comenzar este procedimiento, coloque el ratón con el lado dorsal hacia abajo y rocíe el abdomen con etanol al 70 por ciento, realice una laparotomía cortando secuencialmente la piel y luego la fascia peritoneal a lo largo de la línea media ventral desde la sínfisis púbica hasta la apófisis xifoides, exponiendo así la cavidad peritoneal. A continuación, separe el intestino delgado del estómago seccionando el esfínter pilórico. Retire suavemente el intestino delgado del peritoneo y retire la grasa mesentérica.

Para extirpar completamente el intestino delgado, haga una segunda incisión en la unión ileocecal. Coloque el intestino delgado aislado en un medio RPMI de cuatro grados Celsius que contenga un 10 por ciento de FBS para maximizar la viabilidad celular. Retire suavemente los trozos grandes de grasa con pinzas curvas y tenga cuidado para evitar desgarrar el tejido intestinal durante el proceso.

Para eliminar el contenido intestinal, canula el extremo proximal del intestino delgado con una aguja de alimentación de calibre 18 adherida a una jeringa y enjuague suavemente el intestino con 15 a 20 mililitros de PBS frío. Use tijeras para extirpar los parches de Peyer, que se encuentran en el lado antimesentérico del intestino delgado y aparecen como una masa blanca multilobulada. Luego, colóquelos en un medio RPMI frío que contenga un cinco por ciento de FBS.

A continuación, corte el intestino delgado en segmentos de tres a cuatro pulgadas, elimine la grasa residual enrollando cada segmento del intestino delgado sobre una toalla de papel humedecida con RPMI y use un bisturí sin filo para separar la grasa del tejido. Prestar estricta atención a la eliminación completa de la grasa mesentérica es fundamental para garantizar la viabilidad de los linfocitos, ya que incluso pequeños trozos de grasa pueden causar la muerte de las células. Después de eso, voltee el tejido al revés canulando los segmentos intestinales con pinzas curvas y agarrando el extremo distal del tejido, luego use un par de pinzas rectas para eliminar suavemente el segmento de tejido del extremo proximal, lo que resulta en que el tejido se invierta.

Coloque los segmentos de tejido en una taza que contenga 30 mililitros de medio de extracción y una barra para agitar. Asegure la tapa de la tapa y revuelva durante 15 minutos a 37 grados centígrados. La agitación debe ser vigorosa, pero no turbulenta.

Después de 15 minutos, use un colador de acero para separar las piezas de tejido del epitelio que contiene sobrenadante, que debe parecer turbio. Agite manualmente las piezas de tejido en medio RPMI para lavar los medios de extracción residuales. Luego, coloque el pañuelo sobre una toalla de papel seca y gírelo varias veces para facilitar la eliminación de la mucosa residual que no fue liberada por el medio de extracción.

Posteriormente, coloque los fragmentos de tejido en un tubo de cinco mililitros con 600 microlitros de medio de digestión. Picar el pañuelo hasta que los trozos ya no se peguen a las tijeras y la solución parezca homogénea. Este paso es fundamental para asegurar la digestión enzimática completa del tejido.

Picar el tejido hasta que las piezas ya no se peguen a las tijeras y la solución parezca homogénea es fundamental para garantizar el rendimiento celular, así como para garantizar la reproducibilidad de los resultados. Agregue el intestino delgado picado a una taza que contenga 25 mililitros de medio de digestión y revuelva durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A mitad de la digestión, canalizarlo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica para ayudar a descomponer los trozos grandes de tejido.

A continuación, filtre el tejido digestivo a través de un colador de células de 100 micrómetros en un tubo de 15 mililitros. Enjuague el colador con 20 mililitros de medio RPMI que contenga 10 por ciento de FBS. Después, centrifugar la solución filtrada durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Decantar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en un mililitro de medio RPMI que contenga un 10 por ciento de FBS. Filtre las células resuspendidas a través de un filtro de células de 40 micrómetros en un tubo de 15 mililitros. Enjuague el colador con 20 mililitros de RPMI que contengan 10 por ciento de FBS.

Posteriormente, centrifugar la solución filtrada durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en un mililitro de medio RPMI, que contenga un dos por ciento de FBS. En este procedimiento, transfiera los parches de Peyer extirpados a una taza con 25 mililitros de medios de digestión y una barra para agitar.

Asegure la tapa y gire durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Luego, filtre los parches de Peyer digeridos a través de un colador de celdas de 40 micrómetros en un tubo de 15 mililitros. Si quedan grumos, presiónelos a través del colador usando el extremo plano del émbolo de una jeringa de un mililitro.

Luego, enjuague el colador con 10 mililitros de medio RPMI, que contenga un 10 por ciento de FBS. Centrifugar la solución filtrada durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, decantar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet en un mililitro de medio RPMI que contenga un dos por ciento de FBS.

El análisis de citometría de flujo de suspensiones unicelulares de linfocitos del intestino delgado debería producir una población discreta de células que tengan características de dispersión frontal y lateral similares a las de los esplenocitos. Los linfocitos pueden comenzar a morir si el tejido no se mantiene a cuatro grados centígrados durante las etapas iniciales del aislamiento, lo que resulta en que la población de linfocitos tenga una dispersión hacia adelante más baja y sea más difícil de separar de otras células epiteliales y muertas. Además, si la grasa mesentérica no se elimina completamente del tejido del intestino delgado, habrá una pérdida prácticamente completa de linfocitos.

Por lo general, se obtiene una viabilidad del 80 por ciento para los linfocitos LP del intestino delgado. Una vez dominado, se pueden procesar cuatro ratones y tener suspensiones unicelulares listas para la tinción en menos de cuatro horas. Durante este procedimiento, es importante eliminar por completo toda la grasa mesentérica y picar bien el tejido para garantizar una digestión completa.

Siguiendo este procedimiento, las suspensiones de células individuales se pueden utilizar para fines distintos de la citometría de flujo, como experimentos in vitro, análisis de expresión génica o transferencia adoptiva para caracterizar aún más la función de estas células. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en inmunología de la mucosa exploraran la ontogenia y las implicaciones funcionales del sistema inmunitario intestinal en ratones. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar suspensiones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado, limpiando la grasa mesentérica, extrayendo la capa epitelial y digiriendo el tejido con colagenasa.