Name: El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a aislar linfocitos intestinales de ratón mediante laparotomía y digestión enzimática para citometría de flujo. Este método rápido y reproducible facilita el estudio de la inmunología mucosa y el papel de la microbiota en la salud intestinal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NKS cuenta con el apoyo del premio K08 de los NIH AI108690.

Se llevaron a cabo todos los estudios que se examina y las directrices estrictas de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Facultad de Medicina de Harvard, que cumple con los estándares veterinarios establecidos por la American Association for Laboratory Animal Science (AALAS). 1. Horizontal transmisión de bacterias a través de co-vivienda (Opcional) <ol><li> Para minimizar la contaminación exógena (sobre todo si el uso de ratones gnotobióticos), practicar una técnica aséptica durante el montaje de las jaulas estériles desechables, el uso de alimentos y agua que ambos se han tratado en autoclave. </li><li> Use punzones para los oídos o etiquetas para marcar de forma individual 6 semanas de edad C57BL / 6 ratones que albergan diferentes microbiotas y alojarlos en la misma jaula. Dado que los ratones son coprofagia y comen bolitas fecales desde el suelo de la jaula, microbios, naturalmente, serán transmitidos horizontalmente entre los ratones. </li><li> los ratones co-Casa en ≥1 semana para dar tiempo a que la transferencia microbiana y el cambio inmunológica antes del análisis. </li></ol&gt; 2. Preparación de una suspensión de células individuales de la capa intraepitelial Small-intestinal y la lámina propia <ol><li> Preparación de las soluciones <ol><li> Preparar los medios de extracción (por intestino delgado): 30 ml de RPMI + 93 l 5% ditiotreitol (DTT) (v / w) + 60 l de EDTA 0,5 M + 500 l de suero bovino fetal (FBS). Añadir la TDT inmediatamente antes de su uso. </li><li> Preparar los medios de digestión (por el intestino delgado): 25 ml de RPMI + 12,5 mg dispasa + 37,5 mg colagenasa II + 300 l de FBS. Añadir la colagenasa y dispasa inmediatamente antes de su uso. </li><li> Para todas las incubaciones se realizan a 37 ° C, soluciones Precaliente a 37 ° C. </li></ol></li><li> La eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical. </li><li> Coloque el lado dorsal del ratón y rociar el abdomen con un 70% de etanol. Use las tijeras para realizar una laparotomía cortando secuencialmente la piel y la fascia peritoneal a continuación a lo largo de la línea media ventral lado a otrom la sínfisis púbica a la apófisis xifoides, exponiendo así a la cavidad peritoneal. </li><li> Con unas tijeras para separar el intestino delgado desde el estómago por transección del esfínter pilórico. Retire con cuidado el intestino delgado del peritoneo, las burlas lejos la grasa mesentérica. <ol><li> Para eliminar completamente el intestino delgado, hacer un segundo corte en la unión íleo-cecal. Coloque el intestino delgado aislado en frío (es decir., 4 ° C) RPMI que contiene 10% de FBS para maximizar la viabilidad celular. </li></ol></li><li> Retire con cuidado las grandes trozos de grasa utilizando pinzas curvas. Tenga cuidado para evitar que se rompa el propio tejido intestinal al intentar quitar la grasa. </li><li> Para eliminar el contenido intestinal, los intestinos suavemente a ras con 15 - 20 ml de PBS frío usando una aguja de alimentación 18 G colocada en una jeringa. </li><li> Use las tijeras para extirpar PP, y colocarlos en RPMI frío que contenía FBS al 5%. EPA se encuentra en el lado antimesentérico del intestino delgado y aparecen como un blanco multi-lobuladamasa. Dependiendo de la cepa específica, un ratón normalmente tiene 8 - 12 PP. </li><li> Cortar el intestino delgado hasta 3 - 4 pulgadas segmentos. </li><li> Eliminar la grasa residual enrollando cada segmento del intestino delgado en una toalla de papel humedecida con RPMI, utilizando un bisturí aburrida para provocar la grasa lejos del tejido. </li><li> Girar el tejido dentro por canulación de los segmentos intestinales con pinzas curvas y agarrar el extremo distal del tejido. A continuación, utilice un par de pinzas rectas para eliminar suavemente el segmento de tejido de las pinzas curvas (comenzando en el extremo proximal), lo que resulta en el tejido que se está invertida. </li><li> Coloque los segmentos de tejido en un vaso que contiene 30 ml de medio de extracción y una barra de agitación. Asegure la tapa en el recipiente, y se agita a 500 rpm durante 15 minutos a 37 ° C; agitación debe ser vigorosa pero no turbulento. </li><li> Después de la incubación, utilizar un filtro de acero para separar piezas de tejido a partir del sobrenadante que contiene epitelio, que debe aparecer turbia. Este sobrenadante contiene ilinfocitos ntraepithelial que se pueden analizar aún más, si se desea, proceder a la filtración de la muestra en los pasos 2.18 - 2.23. </li><li> agitar manualmente las piezas de tejido en RPMI para lavar medios de extracción residuales. </li><li> Coloque el tejido en una toalla de papel seca y se tapa de punta a punta varias veces para facilitar la eliminación de moco residuales que no fue liberado por el medio de extracción. </li><li> Coloque los fragmentos de tejido en un tubo de 1,5 ml con 600 l de medio de digestión. </li><li> Use las tijeras para picar el tejido hasta que las piezas ya no se adhieren a las tijeras y la solución parece homogénea. Este paso es crítico para asegurar la digestión enzimática completa del tejido. </li><li> Añadir el intestino delgado picada a una taza que contiene 25 ml de medio de digestión. Se agita a 500 rpm durante 30 min a 37 ° C. A mitad de camino a través de la digestión (es decir., A los 15 min), pipetear arriba y abajo con una pipeta serológica para ayudar a romper cualquier grandes trozos de tejido. </li><li> tejido digerido Filter (o epithELIAL capa de la etapa 2.12 si va a componer de procesamiento) a través de un filtro de células de 100 micras en un tubo de 50 ml. Enjuague el filtro con 20 ml de RPMI que contenía 10% de FBS. </li><li> Centrifugar la solución filtrada a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> decantar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de RPMI que contenía 10% de FBS. </li><li> Filtro de células se resuspendió a través de un filtro de 40 micras de células en un tubo de 50 ml. Enjuague filtro con 20 ml de RPMI que contenía 10% de FBS. </li><li> Centrifugar la solución se filtró a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> decantar cuidadosamente el sobrenadante y pellet se resuspende en 1 ml de RPMI que contenía 2% de FBS. </li></ol> 3. Preparación de una suspensión de células individuales de las placas de Peyer <ol><li> Transferencia extirpó PP a una taza con 25 ml de medio de fermentación y una barra de agitación. Asegure la tapa y centrifugado a 500 rpm durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Filtrar digerido PP a través de un filtro de 40 micras de células en un tubo de 50 ml. Si cualquier grupo remaen, ellos presione a través del filtro usando el extremo plano del émbolo de una jeringa de 1 ml. </li><li> Enjuague filtro con 10 ml de RPMI que contenía 10% de FBS. </li><li> Centrifugar la solución se filtró a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> decantar cuidadosamente el sobrenadante y pellet se resuspende en 1 ml de RPMI que contenía 2% de FBS. </li></ol> 4. La tinción de pavimentación de Citometría de Flujo <ol><li> Alícuota volumen apropiado de células (por ejemplo., 200 l de LPL) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa. </li><li> Resuspender las células en 90 l de RPMI que contiene FBS al 2% y una dilución 1: 100 de anti-CD16 / 32 (bloque Fc). Incubar durante 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Añadir 10 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa. </li><li> Resuspender las células en 250 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante porinvirtiendo la placa. </li><li> (Opcional) las células se tiñen con tinte de viabilidad, si se desea, siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Resuspender las células en 100 l 1% de formalina para fijar las células. Incubar durante 1 hora en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Añadir 200 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa. </li><li> Resuspender las células en 250 l de PBS. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante por inversión de la placa. </li><li> Resuspender las células en 200 l de PBS. Analizar las células utilizando un citómetro de flujo. </li></ol>

<ol><li>Cummings, D. E., Overduin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal regulation of food intake.</a> J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).</li>
<li>Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+influences+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial influences in inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).</li>
<li>Tlaskalova-Hogenova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+%28normal+microflora%29%2C+mucosal+immunity+and+chronic+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li>
<li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+lymphocytes+and+plasma+cells+and+the+role+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut.</a> Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+yang+of+bacterial+polysaccharides%3A+lessons+learned+from+B.+fragilis+PSA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA.</a> Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+tete-a-tete+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system.</a> J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).</li>
<li>Gauguet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+of+mice+influences+resistance+to+Staphylococcus+aureus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia.</a> Infect Immun. , (2015).</li>
<li>Ochoa-Reparaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+from+the+human+commensal+Bacteroides+fragilis+protects+against+CNS+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).</li>
<li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-residing+segmented+filamentous+bacteria+drive+autoimmune+arthritis+via+T+helper+17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells.</a> Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li>
<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
<li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Se presenta un protocolo para el aislamiento y caracterización de citometría de los linfocitos del intestino delgado, incluyendo la LPL va a componer, y linfocitos en el PP de flujo. Para los interesados ​​en la evaluación de cómo los cambios en la microbiota afectan el sistema inmunológico del intestino delgado, se detallan los pasos sencillos que intervienen en la transmisión horizontal de organismos entre los ratones que albergan diferentes microorganismos involucrados. Aunque este protocolo se centra en el intestino...

La tarea principal del intestino delgado es a menudo considerada como la digestión y absorción de nutrientes 1. Si bien esta función metabólica es claramente esencial, el intestino delgado tiene un papel igualmente importante en la protección del huésped de la descarga continua de antígenos ambientales que se encuentran dentro de la luz 2. El tracto intestinal separa el mundo exterior (por ejemplo., Antígenos luminales) de el ambiente interno del huésped con una capa epitelial que es sólo una única capa de células de espesor. Como tal, el sistema inmunitario del intestino delgado tiene el formidable tarea de equilibrar su umbral para la reactividad, lo que permite antígenos extraños de la dieta y comensales microbios para entrar en la mucosa con un mínimo, en su caso, la respuesta inmune mientras que el montaje de una respuesta sólida contra la invasión de patógenos y otros antígenos &quot;perjudiciales&quot;. Las respuestas inmunitarias excesivas o inapropiadas a estos antígenos pueden conducir a la enfermedad patológica (por ejemplo., Inflammaenfermedad toria del intestino, diabetes tipo I, esclerosis múltiple) y debe evitarse 3-6. En general, se considera que el tracto gastrointestinal para representar el órgano más grande inmune en el cuerpo, que contiene más de 70% de todas las células 7 que secretan anticuerpo. El sistema inmunitario del intestino delgado se compone de 3 compartimentos principales - la lámina propia (LP), la capa intraepitelial, y parches de Peyer (PP) - que cada uno contiene un grupo distintivo de linfocitos 2. Los linfocitos LP (LPLS) son principalmente las células T TCRαβ con células ~ 20% de B; linfocitos intraepiteliales (IEL) contienen muy pocas células B con más células T que TCRγδ + células T TCRαβ; y PP, que son los órganos linfoides secundarios incrustados en la pared del intestino delgado, contienen células B ~ 80%. Aunque cada una de estas regiones anatómicas tiene funciones ligeramente distintas y bases ontológicas, que funcionará de ahmoda armonized para proteger al huésped de insultos patógenos. Por otra parte, existe un creciente reconocimiento de que la microbiota es un determinante crítico para el desarrollo del sistema inmune intestinal, con un creciente reconocimiento de la relación entre los microbios específicos afines y la ontogenia de determinados linajes celulares 8,9. Además, dado que la educación del sistema inmunitario intestinal afecta a las respuestas inmunes en sitios anatómicamente distantes (por ejemplo., La artritis, la esclerosis múltiple, neumonía), se ha hecho evidente que el desarrollo del sistema inmunitario intestinal es relevante para más procesos de la enfermedad de reconocido previamente 10 -12. Como tal, el interés en evaluar cuantitativamente el sistema inmune intestinal ha extendido más allá de las interacciones huésped-patógeno para incluir ahora la interacción huésped-comensal y la patogénesis de muchas enfermedades sistémicas así. Dada la variabilidad de los métodos actuales de laaislamiento de los linfocitos intestinales, un método que se ha optimizado para el rendimiento, la viabilidad, y la consistencia y equilibrar el tiempo requerido es cada vez más crítica. Protocolos que involucran gradientes de Percoll son el tiempo y mano de obra intensiva y potencialmente más propenso a un error humano, dando lugar a un rendimiento variable de 13 y viabilidad. En este documento, se proporciona un protocolo optimizado para el aislamiento y caracterización de linfocitos de los 3 compartimentos inmunes del intestino delgado. Además, dado el aumento de interés en alteraciones de microbios inducida en el sistema inmune de la mucosa, que incluye pasos que se pueden utilizar para permitir la transmisión horizontal de microorganismos entre los ratones para evaluar cómo estos cambios afectan cuantitativamente el sistema inmunitario intestinal.

<table><tbody><tr><td>Guantes estériles</td><td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td>jaula estéril para ratones</td><td>Innovive</td><td>MS2-AD</td><td>contiene tapa, fondo de jaula y ropa de cama alpha-dri</td></tr><tr><td>Alimentador metálico</td><td>Innovive</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>Botella de agua</td><td>Innovive</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>Tarjetero</td><td>Innovive</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>Roedor esterilizable en autoclave chow (NIH-31M)</td><td>Zeigler</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medio 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>la concentración en el protocolo se basa en un nivel de actividad de 1,878 U/mg</td></tr><tr><td>de colagenasa, tipo II&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>la concentración en el protocolo se basa en un nivel de actividad de 245 U/mg</td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de alimentación (18 G, 2" de longitud)</td><td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí Desechable (15 hojas)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curva</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Pinza recta</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>Vasos multiusos, 120 ml</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>Barra agitadora</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>Plato agitador multiposición, 9 posiciones</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Cónico de acero inoxidable colador, 3 pulgadas &nbsp;</td><td>RSVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Tubo</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m Filtro de celdas</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro de células</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo cónico</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Jeringa</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos, fondo redondo</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD16/32 (bloque Fc)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>(Opcional) Colorante de viabilidad fijable eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>10% de formalina, tamponado neutro</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento y la citometría de flujo caracterización de murino small intestinal linfocitos

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Los intestinos - que contienen el mayor número de células inmunes de cualquier órgano en el cuerpo - están constantemente expuestos a antígenos extraños, tanto microbiana y la dieta. Dada la comprensión creciente de que estos antígenos luminales ayudan a dar forma a la respuesta inmune y que la educación de las células inmunes en el intestino es crítica para un número de enfermedades sistémicas, se ha aumentado el interés en la caracterización del sistema inmunitario intestinal. Sin embargo, muchos protocolos publicados son arduo y que consume tiempo. Presentamos aquí un protocolo simplificado para el aislamiento de linfocitos de la propria del intestino delgado lámina, capa intraepitelial, y las placas de Peyer que es rápido, reproducible, y no requiere gradientes de Percoll laboriosas. Aunque el protocolo se centra en el intestino delgado, también es adecuado para el análisis de los dos puntos. Por otra parte, se destacan algunos aspectos que pueden necesitar una optimización adicional en función del ques científica específicación. Este enfoque da como resultado el aislamiento de un gran número de linfocitos viables que posteriormente se pueden utilizar para el análisis de citometría de flujo o medios alternativos de caracterización.

Análisis citométrico de flujo suspensiones de células individuales de linfocitos pequeños intestinal debe producir una discreta población de células que tienen similares dispersión frontal y lateral características como esplenocitos (Figuras 1A y 1B). Los linfocitos pueden comenzar a morir si el tejido no se mantiene a 4 ° C durante las etapas iniciales del aislamiento, lo que resulta en la población de linfocitos que tiene una dispersión frontal inferior y ser más difíc...

Existe un creciente interés en la caracterización cuantitativa de los linfocitos intestinales debido al creciente reconocimiento de que estas células desempeñan un papel crítico en una variedad de enfermedades intestinales y sistémicas. En este protocolo, describimos cómo aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado para su posterior caracterización por citometría de flujo.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado que posteriormente puedan utilizarse para análisis mediante citometría de flujo o cualquier otro método de caracterización. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología mucosal, como la forma en que la microbiota influye en el desarrollo del sistema inmunitario intestinal. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, reproducible y no requiere gradientes de percoll laboriosos.Para comenzar este procedimiento, coloque al ratón con la cara dorsal hacia abajo y rocíe el abdomen con etanol al 70 por ciento; realice una laparotomía cortando secuencialmente la piel y luego la fascia peritoneal a lo largo de la línea media ventral desde la sínfisis púbica hasta el proceso xifoides, exponiendo así la cavidad peritoneal. A continuación, separe el intestino delgado del estómago seccionando el esfínter pilórico. Retire suavemente el intestino delgado del peritoneo y separe la grasa mesentérica.Para extraer completamente el intestino delgado, realice un segundo corte en la unión ileocólica. Coloque el intestino delgado aislado en medio RPMI a cuatro grados Celsius que contenga 10 por ciento de FBS para maximizar la viabilidad celular. Retire suavemente los fragmentos grandes de grasa utilizando pinzas curvas y tenga cuidado de no romper el tejido intestinal durante el proceso.Para eliminar el contenido intestinal, canule el extremo proximal del intestino delgado con una aguja de alimentación de calibre 18 sujeta a una jeringa y enjuague suavemente el intestino con 15 a 20 mililitros de PBS frío. Use tijeras para extirpar las placas de Peyer, que se localizan en el lado antimesentérico del intestino delgado y aparecen como una masa blanca multilobulada. Luego, colóquelas en medio RPMI frío que contenga cinco por ciento de FBS.A continuación, corte el intestino delgado en segmentos de tres a cuatro pulgadas, elimine la grasa residual enrollando cada segmento intestinal sobre una toalla de papel humedecida con RPMI y use un escalpelo romo para separar la grasa del tejido. Prestar estricta atención a la eliminación completa de la grasa mesentérica es fundamental para garantizar la viabilidad de los linfocitos, ya que incluso fragmentos mínimos de grasa pueden causar la muerte celular. Después de esto, invierta el tejido del revés insertando fórceps curvos en los segmentos intestinales y sujetando el extremo distal del tejido; luego, use un par de fórceps rectos para retirar suavemente el segmento de tejido desde el extremo proximal, logrando así que el tejido quede invertido.Coloque los segmentos de tejido en un vaso que contenga 30 mililitros de medio de extracción y una barra de agitación. Asegure la tapa sobre la tapa y agite durante 15 minutos a 37 grados Celsius. La agitación debe ser vigorosa, pero no turbulenta.Después de 15 minutos, use un colador de acero para separar los trozos de tejido del sobrenadante que contiene el epitelio, el cual debe presentarse turbio. Agite manualmente los trozos de tejido en medio RPMI para eliminar el medio de extracción residual. Luego, coloque el tejido sobre una toalla de papel seca y voltee varias veces para facilitar la eliminación del moco residual que no fue liberado por el medio de extracción.Posteriormente, coloque los fragmentos de tejido en un tubo de un punto cinco mililitros con 600 microlitros de medio de digestión. Triture el tejido hasta que los trozos ya no se adhieran a las tijeras y la solución aparezca homogénea. Este paso es fundamental para garantizar la digestión enzimática completa del tejido.Trocear el tejido hasta que los fragmentos ya no se adhieran a las tijeras y la solución parezca homogénea es fundamental para garantizar el rendimiento celular, así como la reproducibilidad de los resultados. Añadir el intestino delgado troceado a un recipiente que contenga 25 mililitros de medio de digestión y agitar durante 30 minutos a 37 grados Celsius. A la mitad del tiempo de digestión, pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica para ayudar a descomponer cualquier trozo grande de tejido.A continuación, filtre el tejido digestivo a través de un filtro celular de 100 micrómetros hacia un tubo de 15 mililitros. Enjuague el filtro con 20 mililitros de medio RPMI que contenga 10 por ciento de SFB. Posteriormente, centrifugue la solución filtrada durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.Decante con cuidado el sobrenadante y re-suspenda el precipitado en un mililitro de medio RPMI que contenga 10 por ciento de FBS. Filtre las células re-suspendidas a través de un filtro celular de 40 micrómetros hacia un tubo de 15 mililitros. Enjuague el filtro con 20 mililitros de RPMI que contenga 10 por ciento de FBS.Posteriormente, centrifugue la solución filtrada durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Decante cuidadosamente el sobrenadante y re-suspenda el precipitado en un mililitro de medio RPMI, que contenga dos por ciento de FBS. En este procedimiento, transfiera las placas de Peyer extirpadas a un vaso con 25 mililitros de medio de digestión y una barra imantada.Cierre la tapa y centrifugue durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Posteriormente, filtre los parches de Peyer digeridos a través de un filtro celular de 40 micrómetros hacia un tubo de 15 mililitros. Si quedan grumos, presiónelos a través del filtro utilizando el extremo plano del émbolo de una jeringa de un mililitro.A continuación, enjuague el colador con 10 mililitros de medio RPMI, que contenga 10 por ciento de suero bovino fetal (FBS). Centrifugue la solución filtrada durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, deseche cuidadosamente el sobrenadante y re-suspenda el precipitado en un mililitro de medio RPMI que contenga 2 por ciento de FBS.El análisis citométrico de flujo de suspensiones simples de células de linfocitos intestinales delgados debe producir una población definida de células que presenten características de dispersión directa y lateral similares a las de los esplenocitos. Los linfocitos pueden comenzar a morir si el tejido no se mantiene a cuatro grados Celsius durante las etapas iniciales del aislamiento, lo que provoca que la población de linfocitos tenga una dispersión directa más baja y sea más difícil de separar de otras células epiteliales y muertas. Además, si la grasa mesentérica no se elimina completamente del tejido intestinal delgado, se producirá una pérdida prácticamente completa de los linfocitos.Normalmente, se obtiene una viabilidad del 80 por ciento para los linfocitos de la lámina propia del intestino delgado. Una vez dominado el procedimiento, se pueden procesar cuatro ratones y tener suspensiones de células individuales listas para la tinción en menos de cuatro horas. Durante este procedimiento, es importante eliminar completamente toda la grasa mesentérica y picar bien el tejido para asegurar una digestión completa.Tras seguir este procedimiento, las suspensiones de células individuales pueden utilizarse para fines distintos a la citometría de flujo, como experimentos in vitro, análisis de expresión génica o transferencia adoptiva para caracterizar mejor la función de estas células. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en inmunología mucosal exploraran la ontogenia y las implicaciones funcionales del sistema inmunitario intestinal en ratones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar suspensiones de células individuales a partir de diferentes compartimentos intestinales del intestino delgado, limpiando la grasa mesentérica, extrayendo la capa epitelial y digiriendo el tejido con colagenasa.

isolation-flow-cytometric-characterization-murine-small-intestinal

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí, le detallamos una metodología para el aislamiento rápido de las células dendríticas de ratones intestinales (DCS) y los macrófagos. Caracterización fenotípica de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales se realiza utilizando varios colores, mientras que el flujo de análisis de citometría de enriquecimiento de bolas magnéticas seguido por la selección de células se utiliza para producir poblaciones de alta pureza para los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Este artículo describe espectral citometría, un nuevo enfoque en la citometría de flujo que utiliza las formas de los espectros de emisión para distinguir fluorocromos. Un algoritmo reemplaza compensaciones y puede tratar autofluorescencia como un parámetro independiente. Este nuevo enfoque permite el análisis adecuado de células aisladas de órganos sólidos.

Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

El objetivo de este protocolo es identificar las poblaciones de células endoteliales linfáticas dentro del hígado usando marcadores descritos. Utilizamos colagenasa IV y DNasa y un picado suave del tejido, combinado con citometría de flujo, para identificar una población diferente de células endoteliales linfáticas.

Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

Adjunto, presentamos un protocolo para preparar las células de ratón timo, páncreas drena a ganglios linfáticos y el bazo a un estudio más profundo estas células mediante citometría de flujo. Además, este protocolo se utiliza para determinar los subconjuntos de células T reguladoras mediante citometría de flujo.

Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Este es un método para aislar las células linfoides uterinas de ratones preñados y no preñados. Este método se puede utilizar para múltiples aplicaciones posteriores, como fenotipado FACS, clasificación celular, ensayos funcionales, ARN-seq y proteómica. El protocolo aquí demuestra cómo fenotipar el grupo 1 de las células linfoides innatas uterinas mediante citometría de flujo.

Aislamiento de células linfoides innatas uterinas para análisis por citometría de flujo

En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.

Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para establecer organoides murinos del intestino delgado, aislar las células linfoides innatas tipo 1 de la lámina propia del intestino delgado murino y establecer cocultivos tridimensionales (3D) entre ambos tipos de células para estudiar las interacciones bidireccionales entre las células epiteliales intestinales y las células linfoides innatas tipo 1.

Cocultivo de organoides epiteliales del intestino delgado murino con células linfoides innatas

Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

Aprende a aislar linfocitos intestinales de ratón mediante laparotomía y digestión enzimática para citometría de flujo. Este método rápido y reproducible facilita el estudio de la inmunología mucosa y el papel de la microbiota en la salud intestinal.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

Explorar más videos