Name: Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprende a sintetizar sondas de ADN dualmente marcadas con colorantes cianina fotoestables mediante síntesis en fase sólida y química click. Este método permite visualizar la transferencia de energía y el cambio de color fluorescente durante la hibridación del ADN en tiempo real.

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El apoyo financiero de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), el Grupo de Investigación de Formación GRK 2039 (financiado por la DFG) y el KIT se agradece.

Precaución: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Varios de los productos químicos utilizados en estas síntesis son tóxicos y cancerígenos. Por favor, use todas las prácticas apropiadas de seguridad que normalmente se requieren en los laboratorios de química orgánica, tales como el uso de una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. 1. Síntesis de los colorantes Nota: Ambos colorantes pueden ser sintetizados por los mismos tipos de reacción Figura 2 muestra una visión general de estas reacciones.. <ol><li> Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io yoduro (tinte 1) <ol><li> Síntesis de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, etapa a) <ol><li> Disolver 466 mg 4-picolina y 5,91 g de 1,3-diyodopropano en 10 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml y sellar herméticamente por un tapón septum. </li><li> Calentar a 85 ° C durante 16 hr. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. </li><li> Añadir 20 ml de acetato de etilo al aceite residual y la mezcla se trata en un baño ultrasónico W 120 para 3 min. </li><li> Recoger el precipitado formado por filtración y se lava cinco veces con acetato de etilo. Se seca el producto sólido bajo vacío S / N. </li></ol></li><li> Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, etapa b) <ol><li> Disolver 900 mg de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilpiridin-1-io en 12 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml, añadir 376 mg de azida de sodio, y sellar herméticamente por un tapón septum. </li><li> Calentar a 85 ° C durante 16 hr. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. </li><li> Añadir 15 ml de diclorometano al residuo. </li><li> Filtrar y desechar el precipitado resultante. </li><li> Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un rotevaporador ary para obtener el producto como aceite de color marrón. </li></ol></li><li> Síntesis de 1-metil-1H-indol-3-carbaldehído (Figura 2A, etapa c) <ol><li> Bajo gas inerte (argón), se disuelven 1,45 g de indol-3-carbaldehído, 1,52 g de carbonato de potasio y 2,70 g de carbonato de dimetilo en 10 ml de dimetilformamida absoluta en un matraz de 50 ml equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo. </li><li> Se agita la mezcla a 130 ° C durante 19 horas. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, luego se vierte la mezcla sobre hielo. </li><li> Se extrae la capa acuosa tres veces con 150 ml de acetato de etilo. </li><li> Se combinan las capas orgánicas, se lava con agua, secar sobre sulfato de sodio y eliminar el disolvente a 50 ° C bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio. </li></ol></li><li> Acoplamiento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io yoduro (tinte 1) (Figura 2A, etapa d) <ol><li> Trabajar en atmósfera de argón y con exclusión de humedad. DISSOLve 90 mg 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io y 48 mg 1-metil-1H-indol-3-carbaldehído en 4 ml de etanol en un 20 ml matraz equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo. </li><li> Añadir 0,07 ml de piperidina y se calienta a 80 ° C durante 4 h. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Recoger el precipitado resultante por filtración y se lava tres veces con éter dietílico. </li><li> Añadir éter dietílico al sobrenadante y se recoge el precipitado resultante por filtración. Lavar tres veces con éter dietílico. </li><li> Combinar los precipitados. </li></ol></li></ol></li><li> Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-fenil-1H-indol-3-il) vinil) de yoduro de quinolin-1-io (tinte 2) <ol><li> Síntesis de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, etapa a) <ol><li> Disolver 715 mg 4-metilquinolina y 5,91 g de 1,3-diyodopropano en 10 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml y sellar herméticamente por un tapón septum. </li><li> Calora 85 ° C durante 16 hr. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. </li><li> Añadir 20 ml de acetato de etilo al resto de aceite y tratar la mezcla en un baño ultrasónico 120 W durante 3 min. </li><li> Recoger el precipitado formado por filtración y se lava cinco veces con acetato de etilo. Se seca el producto sólido bajo vacío S / N. </li></ol></li><li> Síntesis de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, la etapa b) <ol><li> Disolver 900 mg de 1- (3-yodopropil) de yoduro -4-metilquinolin-1-io en 12 ml de acetonitrilo en un vial de espacio de cabeza 20 ml, añadir 333 mg de azida de sodio, y sellar herméticamente por un tapón septum. </li><li> Calentar a 85 ° C durante 16 hr. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, a continuación, eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. </li><li> Añadir 15 ml de diclorometano al residuo. </li><li> Filtrar y desechar el precipitado resultante. </li><li> Retire el disolvente under presión reducida utilizando un evaporador rotatorio para obtener el producto como aceite de color marrón. </li></ol></li><li> Síntesis de 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído (Figura 2B, la etapa c) <ol><li> Bajo gas inerte (argón), se disuelven 1,45 g de 2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído, 0,996 g de carbonato de potasio y 1,77 g de carbonato de dimetilo en 10 ml de dimetilformamida absoluta en un matraz de 50 ml equipado con un condensador de reflujo de fondo redondo. </li><li> Se agita la mezcla a 130 ° C durante 19 horas. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente, luego se vierte la mezcla sobre hielo. </li><li> Se extrae la capa acuosa tres veces con 150 ml de acetato de etilo. </li><li> Se combinan las capas orgánicas, se lava con agua, secar sobre sulfato de sodio y eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio. </li></ol></li><li> Acoplamiento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-phe nyl-1H-indol-3-il) vinil) de yoduro de quinolin-1-io (Figura 2B, la etapa d) <ol><li> Trabajar bajo argsobre y bajo exclusión de humedad. Disolver 90 mg de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io y 59,7 mg de 1-metil-2-fenil-1H-indol-3-carbaldehído en 4 ml de etanol en un 20 ml matraz de fondo redondo equipado con condensador de reflujo. </li><li> Añadir 0,06 ml de piperidina y se calienta a 80 ° C durante 4 h. </li><li> Dejar enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Recoger el precipitado resultante por filtración y se lava con éter dietílico tres veces. </li><li> Añadir éter dietílico al sobrenadante y se recoge el precipitado resultante por filtración. Lavar tres veces con éter dietílico. </li><li> Combinar los precipitados. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Síntesis de las cadenas de ADN Nota: La síntesis de las cadenas de ADN se lleva a cabo utilizando el método de la fosforamidita en fase sólida, como se describe por M. Caruthers 11 en un sintetizador de ADN. El funcionamiento del sintetizador se prueba antes del procedimiento sintético, y los reactivos se renuevan sinecesario. <ol><li> prearrangements <ol><li> Se disuelve el disponible comercialmente 2&#39;-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (CU) en 1,2 ml de diluyente amidita (acetonitrilo seco adicional). Mueva la solución en el vial a un vial de sintetizador y el tornillo en el sintetizador. </li><li> Realizar una &quot;prueba de fugas&quot; (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) para asegurarse de que no existe una fuga de gas argón. Si la &quot;prueba de fugas&quot; falla, el tornillo en el vial con más fuerza. </li><li> Primer la solución cU rellenando el tubo que conecta a la cámara de síntesis en fase sólida. </li><li> Lave todas las líneas con acetonitrilo. </li></ol></li><li> Síntesis de cadenas de ADN <ol><li> Utilizar el ordenador conectado a entrar en el método de secuencia de ADN y de acoplamiento, siguiendo las instrucciones del protocolo del fabricante. La etapa de acoplamiento del bloque de construcción cU tarda 168 segundos con 7 pulsos (cada pulso son 16 l) en comparación con 40 segundos con 7 impulsos para una convencionalfosforamidita como bloques de construcción. </li><li> Montar la columna que contiene el CPG (vidrio de poro controlado) como fase sólida que se ha modificado con 1 mol de la primera base (síntesis de ADN se lleva a cabo a partir de 3 &#39;a 5&#39;) en el sintetizador. </li><li> Iniciar la síntesis de ADN en el sintetizador 11. </li></ol></li><li> Workup de cadenas de ADN sintetizadas <ol><li> Se secan las columnas con las cadenas de ADN sintetizadas bajo vacío S / N. </li><li> Utilice una pinza para abrir la columna y liberar la CPG en un vial de reacción. Añadir 700 l de solución de amoniaco acuoso concentrado para desproteger el oligonucleótido y liberar la hebra de ADN a partir de la GPC. </li><li> Cerrar el vial y aplicar una tapa de seguridad en el recipiente de reacción para evitar que se rompa, y se calienta a 50 ° C durante 18 hr. </li><li> Eliminar el amoníaco por centrifugación bajo presión reducida (100 mbar) a 30 ° C durante 30 min. </li><li> Comience la filtración de GPC: Recipiente de centrifugar a 11.000 xg for 3 min. Tome sobrenadante y la transfiere en un dispositivo centrífugo con un tamaño de poro de 0,45 micras. Se centrifuga a 1.000 xg durante 4 minutos. </li><li> Mientras tanto, añadir 300 l de agua doblemente destilada a la GPC, vórtice durante 20 segundos y se centrifuga a 11.000 xg durante 3 min. Transferir el sobrenadante en el dispositivo de centrífuga y centrifugar a 1000 xg durante 4 min. Repita este procedimiento de lavado dos veces. </li><li> Eliminar el agua de las soluciones acuosas combinadas por centrifugación a 0,1 mbar y 25 ° CO / N. </li></ol></li></ol> 3. Procedimiento de &quot;clic&quot; <ol><li> Añadir 50 l de agua doblemente destilada, 25 l de una solución de ascorbato de sodio (0,4 M en agua), 34 l de tris - [(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (0,1 M en DMSO / tBuOH 3: 1), 114 l de la azida (0,01 M en DMSO / tBuOH 3: 1) y 17 l de un tetrakis () de cobre (solución hexafluorofosfato de acetonitrilo I) (0,1 M en DMSO / tBuOH 3: 1) a la muestra de ADN alquino-modificado liofilizado. </li&gt; <li> Incubar la muestra a 60 ° C durante 1,5 hr. </li><li> Enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 150 l Na 2 EDTA (0,05 M en agua) y 450 l de acetato de sodio (0,3 M en agua) a la muestra de ADN y la transferencia a un tubo de 10 ml. </li><li> Añadir 10 ml de etanol (100%) y mantenerla en -32 ° C durante 16 horas. </li><li> buque Centrifugar durante 15 min a 1.000 xg y eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar DNA-pellet con 2 ml de etanol frío (80%). </li><li> pellet seco bajo presión reducida. </li></ol> 4. La purificación por HPLC Nota: Antes de la separación de las hebras de ADN se aseguran de que la HPLC está funcionando adecuadamente, lo suficientemente solvente está disponible y la columna está limpio. Enjuague columna con la concentración de partida de tampón / acetonitrilo. <ol><li> Se disuelve el crudo ADN precipitado en 250 l de agua doblemente destilada y la transferencia a un vial de HPLC. </li><li> Iniciar la HPLC de ejecución de 45 min con un gradiente de 0% de acetonitrilo a 15% de acetonitrilo para el tinte 1 y un gradi<html> ento de 0% de acetonitrilo al 17% de acetonitrilo para el tinte 2. Monitorear la carrera por el control de 260 nm (absorción de ADN) y 459 nm (colorante 1) o 542 nm (colorante 2). Reunir las fracciones que muestran la absorción en los dos canales de longitud de onda. </li><li> Compruebe las fracciones recogidas de la masa por la derecha asistida por matriz de ionización de desorción por láser (MALDI) espectrometría de masas usando una matriz que consiste en 3-hidroxipicolínico ácido (3HPA) y diammoniumhydrogencitrate. <ol><li> Preparar la matriz mediante la mezcla de 900 l de una solución saturada de 3-HPA en 1: 1 mezcla de acetonitrilo y agua con 100 l de una solución diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) en agua. </li><li> Pipetear 1-2 l de la sonda de ADN en el objetivo y dejar secar al aire. </li><li> Añadir 0,2 l de la matriz de 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate a la muestra y se mezcla hasta que cristaliza. </li><li> Realizar la espectrometría de masas MALDI. </li><li> Combinar las fracciones de HPLC que muestran los medios de la derecha. </li></ol></li></ol>_TITLE &quot;&gt; 5. Determinación de la concentración Nota: La concentración se determina midiendo la absorción a 260 nm utilizando un espectrofotómetro UV / VIS, sobre la base de los coeficientes de extinción (ε 260) de las bases de ADN y el colorante. <ol><li> Disolver el ADN en 100 - 200 l de agua doblemente destilada. </li><li> Aplicar 1 l de la solución de ADN en el UV / Vis espectrofotómetro. </li><li> Medir la absorción a 260 nm. Repetir tres veces. </li><li> Toma el valor medio para calcular la concentración de la solución. Para el cálculo de los coeficientes de extinción, utilizar ε 260 nm de las cuatro bases naturales 12 y el 260 nm ε de la UC bloque de construcción comprado (considerado como uridina natural) 12 para obtener el 260 nm ε de toda la cadena de ADN. Para colorante 1, el uso ε 260 nm = 10,200 * L * mol -1 cm -1 y 2 para el tinte, el uso ε = 260 nm 13.100 L * mol &lt;sup&gt; -1 * cm-1. Calcular la concentración de la solución siguiente ley de Lambert-Beers &#39;basado en los coeficientes de extinción y absorbancias medidas. 13 </li></ol> 6. Preparación de la muestra y Espectroscopía <ol><li> Preparación de muestras de una sola hebra <ol><li> Preparar separado 1 ml de 2,5 M soluciones de cada uno de los DNA1 modificado y DNA2 en NaCl 200 mM, NaP 50 mM, pH i = 7. </li></ol></li><li> Preparación de muestras de doble cadena <ol><li> Preparar 1 ml de una solución que contiene 2,5 M de DNA1 y 2,5 M de NaCl en DNA2 200 mM, NaP 50 mM I buffer, pH = 7 en un recipiente de reacción. </li><li> Fije la tapa con un tapón de seguridad y el calor a 90 ° C durante 10 min. A continuación, apague la calefacción y se deja enfriar a temperatura ambiente O / N. </li></ol></li><li> espectroscopia de absorción Nota: Para determinar la longitud de onda de excitación para la especificación de fluorescenciaLos espectros de absorción espectroscopia se registran. <ol><li> Capítulo único de mediciones <ol><li> Registrar una medición en blanco, solo 200 mM NaCl, 50 mM NaP I buffer, pH = 7. </li><li> Transferir la solución preparada de DNA1 en una cubeta de 1 cm de cristal de cuarzo y registrar la absorción. Corregir la medición contra los datos en blanco. Determinar el valor máximo de absorción del colorante. </li><li> Repita para DNA2. </li></ol></li></ol></li><li> La espectroscopia de fluorescencia <ol><li> Capítulo único de mediciones <ol><li> Grabar una medida en blanco que contenía NaCl 200 mM única, NaP 50 mM I buffer, pH = 7; usando la longitud de onda de excitación del tinte 1. </li><li> Transferir la solución DNA1 en una cubeta de 1 cm de cristal de cuarzo. </li><li> Registre el espectro de fluorescencia. </li></ol></li><li> Medición de doble hebra <ol><li> Transferir la solución de doble cadena en una cubeta de vidrio de cuarzo. </li&gt; <li> Registre el espectro de fluorescencia utilizando la longitud de onda de excitación del tinte 1. </li></ol></li></ol></li><li> experimentos de visualización Precaución: la protección ocular adecuada se debe usar para evitar el daño UV a los ojos! <ol><li> Para obtener una mejor comprensión de lo que los espectros registrados se muestran, irradiar las cubetas con lámparas UV de mano (Figura 5). Observe el cambio en el color de la fluorescencia de la sola con el ADN de doble cadena. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo muestra el procedimiento completo para etiquetar ADN post-sintéticamente a través de CuAAC por los tintes fluorescentes azida modificado. Esto incluye la síntesis de los colorantes y el ADN alquino-modificado, así como el procedimiento de etiquetado. La síntesis de los colorantes sigue cuatro pasos. Todos los productos pueden ser obtenidos por una precipitación bastante simple debido a su carga positiva y no se necesita cromatografía en columna consume mucho tiempo. La introdu...

La imagen molecular representa una técnica fundamental para la comprensión de los procesos biológicos dentro de las células vivas. 1-3 El desarrollo de sondas basadas en ácidos nucleicos fluorescentes para tales aplicaciones químico-biológicas se ha convertido en un campo de investigación en expansión. Estas sondas fluorescentes tienen que cumplir con algunos requisitos para convertirse en herramientas adecuadas para imágenes de células. En primer lugar, los tintes aplicados deben exhibir fluorescencia con altos rendimientos cuánticos, los cambios grandes de Stokes y, sobre todo, las altas fotoestabilidades para permitir a largo plazo de imágenes in vivo. Y en segundo lugar, deben mostrar una lectura de fluorescencia fiable. Convencional cromóforo-extintor-sistemas se basan en la lectura de un solo color fluorescencia mediante simples cambios en la intensidad de fluorescencia. 4 Este enfoque conlleva el riesgo de resultados positivos falsos o negativos falsos debido a la autofluorescencia de los componentes intracelulares o baja relación señal-ruido debido a enfriamiento no deseado por otro comcomponentes. 4 Recientemente hemos informado sobre el concepto de &quot;semáforos&quot; de ADN que muestran lecturas de fluorescencia de dos colores mediante el uso de dos cromóforos diferentes. 5-6 El concepto se basa en la transferencia de energía (ET) a partir del colorante donante al colorante aceptor que cambia la fluorescencia Color (ver Figura 1). Esto permite una lectura más fiable y por lo tanto proporciona una poderosa herramienta para sondas de imagen fluorescentes. Etiquetado de oligonucleótidos con colorantes fluorescentes se puede lograr mediante dos enfoques diferentes. Los colorantes se pueden incorporar durante la síntesis química de ADN sobre una fase sólida mediante el uso de bloques de construcción de fosforamidita correspondientemente modificados. 7 Este método se limita a colorantes que son estables bajo condiciones de fosforamidita y desprotección estándar. Como alternativa, las metodologías de modificación post-sintéticos fueron establecidos en la química de oligonucleótidos. Aquí, demostramos la síntesis de una de nuestras nuevas fotosenergía tabla de pares de transferencia de 8,9 y el etiquetado de post-sintética de ADN mediante el uso de cobre-1,3-catalizada cicloadición entre azidas y alquinos (CuAAC). 10

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>síntesis</fuerte></td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diyodopropano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>Grado HPLC</td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td> grado <td>técnico</td></tr><tr><td>Azida de</td> <td>sodioSigma Aldrich</td><td>71290</td><td>p.a.</td></tr><tr><td>grado Diclorometano</td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>grado técnico</td></tr><tr><td>Indol-3-carboxaldehído; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>carbonato de potasio, 99+%</td><td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>dimetilcarbonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida, 99.8%, Extra seco sobre tamiz molecular</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sodio</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 99.5%</td><td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperidina, 99%</td><td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Dietiléter</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td> grado <td>técnico</td></tr><tr><td>2-fenilindol-3-carboxaldehído; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilquinolina</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>síntesis de ADN</fuerte></td></tr><tr><td>Expedite 8909 Sintetizador de ácido nucleico</td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Fosforamidita</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Fosforamidita</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>T111081</tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Fosforamidita</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Fosforamidita</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de aminita para la síntesis de ADN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo ultrapuro para la síntesis de ADN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Tapa B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Columna 1.0&nbsp; y micro; mol</td><td>Proligo Reactivos</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Columna 1.0&nbsp; y micro; mol</td><td>Proligo Reactivos</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Columna 1.0&nbsp; y micro; mol</td><td>Proligo Reactivos</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Columna 1.0&nbsp; y micro; mol</td><td>Proligo Reactivos</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>amoníaco (solución acuosa)&nbsp;</td><td></td><td>Dispositivos centrífugos Fluka Analytical</td> 318612 <td></td></tr><tr><td>nanosep 0.45&nbsp; y micro; m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benciltio)-1H-tetrazol (Activador)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2'-O-propargil desoxiuridinafosforamidita</td><td>Genes químicos</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>trabajo</concentrador ></td></tr><tr><td>vacío</td><td>fuerte Cristo</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>procedimiento de clic</fuerte> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hexafluorofosfato de cobre (I)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligando</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>sintetizado según un procedimiento de la literatura1</td></tr><tr><td colspan="4">HPLC</strong</td></tr><tr><td>>HPLC-system</td><td>Espectrómetro Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18</td><td>columna Supelcosil via Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>determinación de la concentración</td></tr><tr><td>ND 1000 Espectrofotómetro</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>preparación de muestras y espectroscopía</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorímetro Fluoromax-3</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

síntesis de adn sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable cyanine dyes

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

En este protocolo, se demuestra un método para la síntesis de 2&#39;-alquino modificado hebras ácido desoxirribonucleico (ADN) por síntesis en fase sólida automatizada usando química de fosforamidita estándar. Los oligonucleótidos se post-sintéticamente etiquetados por dos nuevos tintes de cianina fotoestables utilizando catalizada por cobre click-química. La síntesis tanto de tinte donador y el aceptor se describe y se realiza en tres pasos consecutivos. Con el ADN como la arquitectura circundante, estos dos colorantes se someten a una transferencia de energía cuando se ponen en estrecha proximidad por hibridación. Por lo tanto, la hibridación de dos cadenas de ADN de cadena sencilla se visualiza mediante un cambio de color de la fluorescencia. Este cambio de color se caracteriza por espectroscopia de fluorescencia, pero también puede ser observada directamente mediante el uso de una lámpara de ultravioleta de mano (UV). El concepto de una lectura de fluorescencia de dos colores hace que estas sondas de oligonucleótidos excelentes herramientas para imágenes moleculares especialmente cuando el pho descritose utilizan colorantes tostable. De este modo, se evita que photobleaching de las sondas de formación de imágenes, y los procesos biológicos se puede observar en tiempo real para un período de tiempo más largo.

La absorción y fluorescencia espectros del ADN de una sola y de doble cadena se registran como se muestra en la Figura 4. Los espectros de absorción registrada (Figura 4 derecha) muestran la absorción máximos λ max a 465 nm para DNA1 de cadena sencilla (colorante 1) y 546 nm para DNA2 de cadena sencilla (colorante 2). El DNA1_2 recocido (tinte y tinte 1 2) muestra máximos a 469 nm y...

Los colorantes de cianina fotoestables se unen a oligonucleótidos para monitorear la hibridación por transferencia de energía.

Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

El objetivo general de este experimento es visualizar la transferencia de energía de una hebra de ADN modificada con un colorante a otra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular, como la interferencia de ARN mediante el monitoreo en tiempo real del procesamiento y la integridad del ARNip en células vivas.La principal ventaja de esta técnica es la facilidad para monitorear la propagación de la fluorescencia y el cambio de color, lo que proporciona un resultado claro. Por lo tanto, se eliminan los resultados falsos positivos. Para comenzar este procedimiento, agregue los reactivos apropiados según se indica en el protocolo del texto a un matraz redondo de 20 mililitros, equipado con una barra de agitación magnética y un condensador de reflujo.Luego, agregue cero punto cero seis mililitros de piperidina. Y caliente la mezcla de reacción a 80 grados Celsius durante cuatro horas. Después de que la reacción se enfríe a temperatura ambiente, recoja el precipitado resultante por filtración.Y lave con éter etílico tres veces. A continuación, agregue cien mililitros de éter etílico al sobrenadante. Y recoja el precipitado resultante por filtr

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video es una demostración técnica del protocolo de hibridación para todo el genoma amplia baldosas CGH camino, que escanea todo el genoma humano utilizando sólo 25 a 100 ng de ADN que se puede aislar de una variedad de fuentes, incluyendo archivos de material fijado en formol.

Demostración de técnicas de hibridación del genoma entero matriz Genómica Comparativa

Se presenta un nuevo y poderoso de integración de la nanofotónica (QD-FRET) y microfluídica para investigar la formación de polyplexes polielectrolito, que se espera que proporcione un mejor control y síntesis de polyplexes uniforme y personalizable para a base de ácido nucleico futuras terapias.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

Un método cuantitativo para el análisis de sincronización cromosoma replicación se describe. El método utiliza la incorporación de BrdU en combinación con...

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

El video muestra un método para evaluar las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunitarias utilizando nanopartículas de oro ancladas en polietilenglicol y sondas de tensión de horquilla de ADN. Las interacciones de los linfocitos T CD8 positivos desencadenan el despliegue de la sonda, emitiendo fluorescencia, mientras que las hebras de bloqueo mantienen la señal para cuantificar las fuerzas aplicadas por las células inmunitarias.

Uso de sondas de tensión basadas en ADN para evaluar las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunitarias

Se describe un protocolo robusto y versátil para el análisis de la arquitectura nuclear por FISH 3D DNA usando sondas fluorescentes marcados directamente.

Robusto PESCADO ADN 3D utilizando sondas marcadas directamente

Aquí, presentamos un método simple para realizar la hibridación in situ de ADN fluorescente (DNA ISH) para visualizar secuencias heterocromáticas repetitivas en cromosomas montados en portaobjetos. El método requiere reactivos mínimos y es versátil para su uso con sondas cortas o largas, diferentes tejidos y detección con señales basadas en fluorescencia o no fluorescencia.

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

Se describe aquí un protocolo optimizado de ensayos fluorescentes cambio de movilidad electroforética (FEMSA) utilizando purificados Sox-2 proteínas, junto con sondas fluorescentes infrarrojos marcado tinte de ADN como un estudio de caso para hacer frente a una importante cuestión biológica.

Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar tiazol naranja para la detección de ADN en experimentos de electroforesis de gel. El uso de naranja de tiazol permite eliminación de bromuro de etidio, y se logra la detección de la fluorescencia con luz azul o UV.

Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

Este protocolo describe una aplicación de hibridación in situ de fluorescencia de una sola molécula (smFISH) para medir la cinética in vivo de la síntesis y degradación del ARNm.

Sondeo de mRNA cinética en el espacio y el tiempo en Escherichia coli usando hibridación de fluorescencia de una sola molécula de dos colores

Este documento describe un protocolo detallado para usar sondas de tensión basadas en ADN para obtener imágenes de las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunes. Este enfoque puede mapear las fuerzas del receptor &gt;4.7pN en tiempo real y puede integrar fuerzas a lo largo del tiempo.

Sondas de tensión de ADN para mapear las fuerzas transitorias del receptor de piconewton por las células inmunes

Este protocolo describe el diseño de sondas de hibridación dividida que utilizan el aptámero de luz fluorescente DAP-10-42 como reportero de señal y su aplicación para la detección y diferenciación de ácidos nucleicos entre objetivos con sustituciones de un solo nucleótido.

Sonda de hibridación dividida que utiliza un aptámero de iluminación fluorescente de ADN como reportero de señal para el análisis de ácidos nucleicos específicos de la secuencia

Aprende a sintetizar sondas de ADN dualmente marcadas con colorantes cianina fotoestables mediante síntesis en fase sólida y química click. Este método permite visualizar la transferencia de energía y el cambio de color fluorescente durante la hibridación del ADN en tiempo real.

Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

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