Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

El objetivo general de este experimento es visualizar la transferencia de energía de una hebra de ADN modificada con tinte a otra. Este método puede ayudar en las preguntas clave en el campo de la biología molecular. Como la interferencia de ARN mediante el monitoreo del procesamiento y la integridad del siRNA en células vivas en tiempo real.

La principal ventaja de esta técnica, es la facilidad de seguimiento del alcance de la floración y el cambio de color, dando un resultado claro. Por lo tanto, se eliminan los resultados falsos positivos. Al comenzar este procedimiento, agregue los reactivos apropiados como se indica en el protocolo de texto a un matraz de fondo redondo de 20 mililitros, equipado con una barra de agitación magnética y un condensador de reflujo.

A continuación, añade cero coma cero seis mililitros de piperidina. Y calentar la mezcla de reacción a 80 grados centígrados durante cuatro horas. Después de que la reacción se haya enfriado a temperatura ambiente, recoja el precipitado resultante por filtración.

Y lavar con éter dietílico tres veces. A continuación, agregue cien mililitros de éter dietílico al sobrenadante. Y recoger el precipitado resultante por filtración.

Después de lavar tres veces con éter dietílico, combine el precipitado con el sólido aislado de la primera filtración. Usando la computadora, conectada a un sintetizador de ADN, ingrese la secuencia de ADN deseada y el método de acoplamiento. Siga las indicaciones del protocolo del fabricante.

A continuación, monta la columna que contiene el vidrio de vertido controlado, que se modifica con un micro mol de la primera cara en el sintetizador. Ahora, comience la síntesis en el sintetizador de ADN. Después del análisis de las hebras de ADN, agregue los regentes apropiados como se indica en el protocolo de texto a la muestra de ADN modificado con alquino dietizado.

Incubar la muestra a 60 grados centígrados durante un punto cinco horas. Luego, transfiera la muestra a un tubo de 10 mililitros. Después de enfriar a temperatura ambiente, agregue 150 microlitros, de una solución de sales disódicas EDTA de cero coma cero y cinco molares, y 450 microlitros de una solución de acetato de sodio de tres molares y cero a la muestra de ADN.

Después de esto, agregue 10 mililitros de etanol a la muestra. Y mantenerlo a menos 32 grados centígrados durante 16 horas. A continuación, centrifugar la muestra durante 15 minutos a mil veces G. Cuando termine, retire el sobrenadante.

Lave la bolita de ADN resultante con dos mililitros de etanol frío al 80%. A continuación, seque el pellet a presión reducida con un liofilizador. Purifique la bolita de ADN crudo con HP LC.Supervise la ejecución comprobando 260 nanómetros y 459 nanómetros para el tinte uno.

O 542 nanómetros para Dye two. Recoja las fracciones que muestran absorción en ambos canales de longitud de onda. Para mediciones de espectroscopia de absorción de cadena única, registre una medición en blanco que contenga solo 200 milimolares de cloruro de sodio y 50 milimolares de tampón de fosfato de sodio.

A continuación, transfiera la solución de ADN1 previamente preparada a una cubeta de vidrio de cuarzo de un centímetro. Registre la absorción. A continuación, determine el valor máximo de absorción de tinte.

Para mediciones de espectroscopia fluorescente de cadena simple, registre una medición en blanco que contenga solo 200 milimolares de cloruro de sodio y 50 milimolares de fosfato de sodio, utilizando la longitud de onda de excitación de Dye one. A continuación, coloque la cubeta con la solución DNA1 en el espectrómetro. Registre el espectro de florescencia.

Para realizar la medición de espectroscopia fluorescente de doble cadena, coloque la cubeta con la solución de doble cadena de ADN1 y ADN2 en el espectrómetro. A continuación, registre el espectro fluorescente utilizando la longitud de onda de excitación de Dye one. Para obtener una mejor comprensión de lo que muestran los espectros registrados, irradie las cubetas con lámparas UV de mano.

Observe el cambio en el color de la florescencia del ADN monocatenario al bicatenario. Los espectros de absorción registrados muestran los máximos a 465 nanómetros para el ADN1 monocatenario y 546 nanómetros para el ADN2 monocatenario. La doble cadena recocida de DNA1 y DNA2 muestra máximos a 469 y 567 nanómetros.

Ambos máximos de absorción muestran un desplazamiento bataorómico. Y los cambios espectroscópicos más pequeños son el resultado de interacciones excitónicas entre los tintes dentro de la arquitectura de ADN de doble hélice. Los espectros fluorescentes correspondientes exhiben un máximo de 537 nanómetros para el ADN monocatenario1.

A 607 nanómetros para ADN monocatenario2. Y a 615 nanómetros para recocido, doble cadena de ADN1 y ADN2. La bicatenaria de ADN1 y ADN2, muestra únicamente el máximo de emisión del colorante dos, aunque el colorante uno se excita selectivamente, lo que evidencia que la transferencia de energía se produce de manera eficiente del colorante uno al colorante dos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo modificar sintéticamente el ADN mediante una reacción catalítica de pareja de una hebra de ADN marcada con alquino con un lado A.