Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

El objetivo general de este experimento es visualizar la transferencia de energía de una hebra de ADN modificada con un colorante a otra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular, como la interferencia de ARN mediante el monitoreo en tiempo real del procesamiento y la integridad del ARNip en células vivas.

La principal ventaja de esta técnica es la facilidad para monitorear la propagación de la fluorescencia y el cambio de color, lo que proporciona un resultado claro. Por lo tanto, se eliminan los resultados falsos positivos. Para comenzar este procedimiento, agregue los reactivos apropiados según se indica en el protocolo del texto a un matraz redondo de 20 mililitros, equipado con una barra de agitación magnética y un condensador de reflujo.

Luego, agregue cero punto cero seis mililitros de piperidina. Y caliente la mezcla de reacción a 80 grados Celsius durante cuatro horas. Después de que la reacción se enfríe a temperatura ambiente, recoja el precipitado resultante por filtración.

Y lave con éter etílico tres veces. A continuación, agregue cien mililitros de éter etílico al sobrenadante. Y recoja el precipitado resultante por filtración.

Después de lavar tres veces con éter dietílico, combine el precipitado con el sólido aislado de la primera filtración. Mediante la computadora conectada a un sintetizador de ADN, ingrese la secuencia de ADN deseada y el método de acoplamiento. Siga las indicaciones del protocolo del fabricante.

A continuación, coloque la columna que contiene el vidrio de vertido controlado, es decir, modificado con un micromol del primer extremo, en el sintetizador. Ahora, inicie la síntesis en el sintetizador de ADN. Tras el procesamiento de las cadenas de ADN, agregue los reactivos apropiados según se indica en el protocolo del texto al alquino dietilado, muestra de ADN modificada.

Incubar la muestra a 60 grados Celsius durante una hora y media. Luego, transferir la muestra a un tubo de 10 mililitros. Después de enfriar a temperatura ambiente, añadir 150 microlitros de una solución 0,05 molar de sal disódica de EDTA y 450 microlitros de una solución 0,3 molar de acetato de sodio a la muestra de ADN.

A continuación, agregue 10 mililitros de etanol a la muestra y manténgala a menos 32 grados celsius durante 16 horas. Luego, centrifugue la muestra durante 15 minutos a mil veces G. Una vez finalizado, retire el sobrenadante.

Lave el pellet de ADN resultante con dos mililitros de etanol frío al 80 %. Luego seque el pellet bajo presión reducida utilizando un liofilizador. Purifique el pellet de ADN crudo mediante HPLC. Supervise la corrida verificando 260 nanómetros y 459 nanómetros para el colorante uno.

O 542 nanómetros para el colorante dos. Recolecte las fracciones que muestren absorción en ambos canales de longitud de onda. Para mediciones de espectroscopía de absorción de cadena sencilla, registre una medición en blanco que contenga solo cloruro de sodio 200 milimolar y tampón de fosfato de sodio 50 milimolar.

A continuación, transfiera la solución de ADN1 previamente preparada a una cubeta de vidrio de cuarzo de un centímetro. Registre la absorción. Luego determine el valor máximo de absorción del colorante.

Para mediciones de espectroscopia fluorescente de cadena sencilla, registre una medición en blanco que contenga únicamente 200 milimolares de cloruro de sodio y 50 milimolares de fosfato de sodio, utilizando la longitud de onda de excitación del colorante uno. A continuación, coloque la cubeta con la solución de ADN1 en el espectrómetro. Registre el espectro de fluorescencia.

Para realizar la medición de espectroscopía fluorescente de doble cadena, coloque la cubeta con la solución de doble cadena de DNA1 y DNA2 en el espectrómetro. Luego registre el espectro fluorescente utilizando la longitud de onda de excitación del colorante uno. Para comprender mejor lo que muestran los espectros registrados, irradie las cubetas con lámparas UV portátiles.

Observe el cambio en el color de fluorescencia del ADN de cadena sencilla al de doble cadena. Los espectros de absorción registrados muestran máximos a 465 nanómetros para el ADN de cadena sencilla1 y a 546 nanómetros para el ADN de cadena sencilla2. La doble cadena hibridada de ADN1 y ADN2 muestra máximos a 469 y 567 nanómetros.

Ambos máximos de absorción muestran un corrimiento batocromico. Y los cambios espectroscópicos más pequeños son el resultado de interacciones excitónicas entre los colorantes dentro de la arquitectura del ADN de doble hélice. Los espectros fluorescentes correspondientes exhiben un máximo a 537 nanómetros para el ADN de cadena sencilla1.

A 607 nanómetros para el ADN de cadena sencilla2 y a 615 nanómetros para el ADN hibridado, doble cadena de ADN1 y ADN2. El ADN de doble cadena de ADN1 y ADN2 muestra únicamente el máximo de emisión del colorante dos, aunque se excita selectivamente el colorante uno, lo cual demuestra que la transferencia de energía ocurre de manera eficiente del colorante uno al colorante dos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo modificar post-sintéticamente el ADN mediante una serie de reacciones catalíticas de una cadena de ADN marcada con alquino y un lado A.