Prevención de Estrés Térmico efectos adversos en ratas Bacillus subtilis Strain

Describimos un protocolo para la prevención de los efectos del estrés térmico en ratas mediante un pretratamiento oral con bacterias beneficiosas. Este protocolo puede ser modificado y utilizado para diversas vías de administración y para el análisis de diferentes compuestos.

El objetivo general de este experimento es evaluar el efecto preventivo de la cepa BSB3 de B. subtilis contra las complicaciones después del estrés térmico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la prevención de los efectos adversos del estrés por calor. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para evaluar diferentes enfoques para mitigar las complicaciones del estrés térmico.

La encargada de demostrar este procedimiento será Ludmila Globa. Y Oleg Pusovyy, investigador asociado de nuestro laboratorio. Para empezar, con una sola colonia de Bacillus subtilis BSB3 que se cultivó durante la noche en una placa de agar nutriente.

Inocular diez mililitros de caldo de nutrientes en un matraz. Cultive el cultivo durante la noche a 37 grados centígrados. Prepare 500 mililitros de medio de esporulación de acuerdo con la receta que se muestra aquí.

Y autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Deje que el medio se enfríe a 50 grados centígrados antes de agregar las siguientes soluciones estériles. En un armario estéril, enfríe el medio preparado a temperatura ambiente a 40 grados centígrados durante 20 minutos.

Y vierta 25 mililitros en cada una de las 20 placas de Petri estériles. Deje que el medio se solidifique durante la noche. A continuación, extienda 0,5 mililitros del cultivo de Bacillus subtilis BSB3 durante la noche sobre la superficie de las placas del medio de esporulación.

Incubar las placas a 37 grados centígrados durante cinco días hasta el 90% de esporulación. A continuación, utilice la microscopía de alta resolución para comprobar si hay esporas de fase brillante. Para cosechar las bacterias, agregue un mililitro de PBS a las placas y use un esparcidor de células estéril para raspar las bacterias de la superficie.

Guarde la suspensión a cuatro grados centígrados hasta que la necesite. Confirme la viabilidad de las bacterias colocando 0,1 mililitros de la dilución adecuada de una suspensión bacteriana en placas de medio de esporulación e incube a 37 grados centígrados durante 18 a 24 horas. Utilice un contador de colonias para contar las colonias bacterianas y calcular el título de bacterias en la suspensión probada.

A continuación, prepare una suspensión bacteriana en PBS a una concentración final de una por diez a la octava UFC por mililitro. Después de tratar a las ratas por sonda nasogástrica oral con B. subtilis BSB3 o PBS durante dos días, luego subdividiendo los animales y tomando su temperatura, mantenga a las ratas de los grupos uno y dos a temperatura ambiente durante 25 minutos. Coloque a los animales de los grupos tres y cuatro en una cámara climática a 45 grados centígrados y 55% de humedad relativa durante 25 minutos.

Después de la medición de la temperatura rectal de cada rata nuevamente, coloque a todos los animales a temperatura ambiente durante cuatro horas. Luego, después de sacrificar a los animales, recolectar la sangre del tronco y aislar los órganos de acuerdo con el protocolo de texto, coloque cada muestra de órgano en tubos estériles previamente pesados y pese. Agregue PBS estéril a cada tubo para obtener una dilución de uno a diez pesos por volumen de la muestra, y use un homogeneizador de tejido de vidrio estéril para generar suspensiones de tejido homogéneas.

A continuación, utilice PBS estéril para hacer diluciones en serie de cada muestra. A continuación, coloque 0,1 mililitros de todas las diluciones en la superficie de MacConkeys y agar sangre al 5%. Y agar sangre brucella con Hemin y Vitamina K1. Después de incubar las placas, use un contador de colonias para contar las colonias en cada grupo de placas.

Expresa los resultados como el número de unidades formadoras de colonias, o UFC, por gramo de tejido. Después de preparar y teñir secciones del intestino delgado de acuerdo con el protocolo de texto, use un microscopio de alta resolución para medir las vellosidades intestinales y el grosor total de la pared mucosa. Analice al menos cuatro muestras de cada rata y haga al menos 20 mediciones en cada muestra.

Para llevar a cabo microscopía óptica de alta resolución de muestras de sangre, utilice la plataforma de aislamiento de vibraciones como base para el sistema de microscopio con una cámara de video y una computadora para grabar imágenes en vivo. Después de calibrar las imágenes de la prueba de acuerdo con el protocolo de texto, coloque siete microlitros de sangre recién extraída de cada rata en un portaobjetos de vidrio y agregue un cubreobjetos. A continuación, fotografíe y grabe diez fotogramas de imagen de 72 por 53,3 micrómetros cuadrados en cada muestra.

Por último, utilizando un software que proporciona imágenes ópticas de visión directa de alta resolución en tiempo real, mida la concentración de vesículas. La temperatura corporal media de los animales antes e inmediatamente después del estrés térmico fue de 36,7 más o menos 07 grados Celsius y 40,3 más o menos 0,17 grados Celsius, respectivamente. La exposición de las ratas al calor resultó en una inhibición significativa de la altura de las vellosidades y el grosor total de la mucosa.

Sin embargo, el tratamiento con la cepa BSB3 antes del estrés, protegió el intestino del efecto nocivo del calor. Para la translocación de bacterias del intestino, se analizaron los ganglios linfáticos mesentéricos, el hígado y el bazo. Como se ilustra aquí, las bacterias se aislaron a una concentración de 1,7 veces diez por las tres más o menos 4,6 veces diez por las dos UFC por gramo de tejido solo en muestras de ganglios linfáticos mesentéricos e hígado de ratas tratadas con PBS expuestas al calor.

Por otro lado, todas las muestras analizadas de animales control y estresados por calor que recibieron la cepa BSB3 fueron estériles. No se registraron cambios en los niveles de IL 1beta, IL-6, TNFalfa o citocinas gamma de interferón en ratas estresadas por calor. Sin embargo, los niveles de IL-10 y LPS estaban elevados en los animales tratados con PBS antes del tratamiento térmico.

Por lo tanto, el pretratamiento con B. subtilis BSB3 evitó el aumento de IL-10 y LPS en el suero después del tratamiento térmico. Finalmente, se encontró un aumento significativo en la concentración de vesículas libres en la sangre de las ratas que recibieron PBS antes del estrés térmico, pero no en los animales tratados con BSB3. Es importante recordar el uso de materiales pirogénicos para la recolección de sangre y la precisión para mantener los líquidos séricos a menos 20 grados centígrados que con la congelación y descongelación repetidas, y seguir un procedimiento estéril durante el análisis de la translocación bacteriana.

Seguir este procedimiento, como la administración de bacterias después del estrés por calor, se puede realizar para responder preguntas adicionales sobre las complicaciones del estrés por calor.