Name: Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende el etiquetado de espines dirigido por sitio y estudios de EPR en canales pentaméricos de ligandos de iones. Este protocolo permite analizar la dinámica de proteínas de membrana en entornos lipídicos fisiológicamente relevantes.

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Estamos muy agradecidos a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Chakrapani para la lectura crítica y los comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención (1R01GM108921) y la Asociación Americana del Corazón (NCRP Desarrollo Científico de Grant 12SDG12070069) y Carolina del Sur.

Los autores no tienen nada que revelar.

espectroscopia EPR ha demostrado ser un enfoque estructural sin precedentes en la cuantificación de los cambios conformacionales en proteínas de la membrana en un entorno casi nativo. Este enfoque nos permite un vistazo a los detalles moleculares de la dinámica de proteínas que están ocultas en alta resolución de estructuras de cristalografía de rayos X y la crio-microscopía electrónica. Sin embargo, es importante tener en cuenta las limitaciones técnicas de este enfoque que puede afectar a la aplicabilidad general a ot...

Durante la última década, la comprensión estructural de canales iónicos activados por ligando pentaméricas (pLGIC) ha crecido a pasos agigantados, debido a la multitud de estructuras de alta resolución de varios miembros de la familia. Los factores clave que llevaron a los avances actuales en el campo incluyen el descubrimiento de canales pLGIC procariotas, 1-3 grandes progresos en la expresión de proteínas de membrana eucariota, 4-6 y tremendos avances en los métodos de determinación de la estructura. 7 Estas estructuras proporcionan un consenso claro sobre la conservación general de la arquitectura tridimensional de pLGIC. Sin embargo, dos áreas principales que parecen zaga son la caracterización funcional de estas preparaciones de canal y la descripción mecanicista de la función de los canales. Gating cambios conformacionales son complejas y se producen sobre una distancia 60 Å a lo largo de la longitud del canal y estas transiciones son ampliamente modulados porlípidos de membrana. En particular, los lípidos negativos, colesterol y fosfolípidos han sido demostrado que modulan la función de pLGIC 8-11. Mientras que el papel preciso de estos componentes de lípidos en la función del canal sigue siendo desconocida, una comprensión molecular completa de gating requeriría el estudio de estos canales en su ambiente nativo. Girar dirigida al sitio de etiquetar (SDSL) y la resonancia paramagnética de electrones (EPR) espectroscopia son las técnicas de elección para el estudio de la dinámica de proteínas en sistemas reconstituidos. espectroscopia EPR no está limitado por el tamaño molecular (como es NMR) o la propiedad óptica de la muestra (como es la espectroscopia de fluorescencia), y de ese modo permite mediciones de construcciones de longitud completa reconstituidas en condiciones de lípidos nativos. La técnica es extremadamente sensible y tiene requisitos relativamente bajos de la muestra (en el rango pico-moles). Estos dos aspectos hacen la técnica muy adecuada para el estudio de grandes proteínas de membrana que son difíciles de expresar en más de miligramocantidades. El uso de la espectroscopia EPR en combinación con el etiquetado de giro dirigida al sitio fue desarrollado por Wayne Hubbell y sus colegas, y ha sido adaptado para el estudio de una variedad de tipos de proteínas. 12-24 de datos de EPR se han utilizado para investigar estructuras secundarias, los cambios en la proteína conformación, profundidades de inserción de membrana y proteína-proteína / interacciones proteína-ligando. El método consiste en la sustitución de cisteína en las posiciones de interés mediante mutagénesis dirigida al sitio. Para garantizar el etiquetado específico del sitio, es necesario sustituir cisteínas nativas con otro aminoácido (por ejemplo., Serina) para crear una plantilla de cisteína menos. Por el momento, el marcador de espín más popular es un MTSL específico de tiol: (1-oxi-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) methanethiosulfonate que se une a la proteína a través de un puente de enlace disulfuro. Debido a su alta especificidad, tamaño relativamente pequeño (un poco más grande que el triptófano), y flexibilidad de la región de engarce, este marcador de espín se ha demostrado que tienen una excelente reactividad incluso con una cisteína enterrado. Además, para maximizar la reactividad, la reacción de marcaje de la proteína se lleva a cabo en forma solubilizada con detergente. Después de la separación del exceso de giro libre etiqueta por cromatografía de exclusión molecular, la proteína es reconstituido en liposomas o sistemas bicapa lipídica imitando de composición definida. En general, la mutagénesis cisteína es bien tolerado en la mayoría de las partes de la proteína, y el tamaño relativamente pequeño de la escisión de la sonda provoca perturbación mínima a las estructuras secundaria y terciaria. Para asegurarse de que la modificación conserva funciones de tipo salvaje, los canales marcados y reconstituidos se pueden estudiar por medio de mediciones de patch-clamp. La proteína marcada con funcional se somete a continuación a mediciones espectroscópicas, que esencialmente proporcionan tres tipos principales de información: 12,14,15,20,22,23,25-27 dinámica spin-sonda por lineshanálisis de los simios; accesibilidad de la sonda con agentes de relajación paramagnéticas; y distribución a distancia. 27 distancias EPR se miden por dos enfoques diferentes. La primera se basa en la técnica de onda continua (CW), donde ensanchamiento espectral que surge de las interacciones dipolares entre spin-etiquetas (en el 8 - Rango de distancia a 20). Se utiliza para determinar la distancia 28,29 El segundo es un pulsada-EPR método en el que las mediciones de distancia pueden extenderse hasta 70 Å. 30-34 en doble Electron Electron Resonancia (ciervo), se analizan las oscilaciones de la amplitud de espín-eco para determinar las distancias y las distribuciones de distancia. Aquí el eco de espín se modula a la frecuencia de la interacción dipolar. Juntos, estos parámetros se utilizan para determinar la topología de proteínas, elementos estructurales secundarios, y los cambios conformacionales en proteínas.

<table><tbody><tr><td>Mutagénesis dirigida al sitio y mutaciones</td><td></td><td></td><td></td>de Cys</tr><tr><td>10x Tampón de reacción PfuUltra HF</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs Inc&lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 mM cada uno dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra ADN polimerasa</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2.5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20,000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>medios SOC</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S Kanamicina</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB medios</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep</td><td>kit QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 células competentes</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>Expresión y purificación</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de glucosa</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher Bioreactivos</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Bioreactivos</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-tio-&beta;-galactósido)</td><td>Oro Biotecnología</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-&beta;-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Resina de amilosa</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltosa</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>Polipropileno vacío Columna de cromatografía</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Etiquetado de giro dirigido al sitio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oxil-2,2,5,5-tetrametil-3-pirrolina-3-metilo) Metanetiosulfonato</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr>(<tr><td>1-acetoxi-2,2,5,5-tetrametil-&Delta; 3-pirrolina-3-metilo) metanetiosulfonato</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Reconstitución</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lípidos de asolectina</td><td>Álpidos polares Avanti Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads (perlas de poliestirina)</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Productos químicos de Fisher</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína-maleimida</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina-maleimida</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti lípidos polares Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti lípidos polares Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli extracto lipídico polar</td><td>Avanti lípidos polares Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Medición</td><td></td><td></td><td></td>EPR</tr><tr><td>TPX capilares de plástico Bruker</td><td></td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (Etilendiamina-N, ácido N'-diacético)</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

sitio dirigida etiquetado vuelta y epr estudios espectroscópicos de canales pentamérica por ligando de iones

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

La activación de canales iónicos es una orquestación impulsada por estímulos de los movimientos de las proteínas que conduce a transiciones entre estados cerrados, abiertos y desensibilizados. Fundamental para estas transiciones es la flexibilidad intrínseca de la proteína, que está críticamente modulada por la composición de lípidos de la membrana. Para comprender mejor las bases estructurales de la función del canal, es necesario estudiar la dinámica de las proteínas en un entorno de membrana fisiológica. La espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR) es una herramienta importante para caracterizar las transiciones conformacionales entre estados funcionales. En comparación con la RMN y la cristalografía de rayos X, la información obtenida de la EPR es intrínsecamente de menor resolución. Sin embargo, a diferencia de otras técnicas, en la EPR no hay un límite superior para el peso molecular de la proteína, los requisitos de muestra son significativamente menores y, lo que es más importante, la proteína no está limitada por las fuerzas de la red cristalina. Por lo tanto, la EPR es especialmente adecuada para el estudio de grandes complejos de proteínas y proteínas en sistemas reconstituidos. En este artículo, discutiremos los protocolos generales para el etiquetado de espín dirigido al sitio y la reconstitución de membranas utilizando un canal iónico pentámero activado por ligando (pLGIC) procariota dependiente de protones de Gloeobacter violaceus (GLIC) como ejemplo. Se describirá una combinación de enfoques EPR de onda continua (CW) y pulsada (resonancia electrónica de doble electrón-DEER) en estado estacionario que permitirá una caracterización cuantitativa completa de la dinámica de canales.

Caracterización bioquímica de los mutantes Glic spin-etiquetados Siguiendo el protocolo descrito anteriormente típicamente producir proteína de fusión MBP-GLIC en el intervalo de 10 a 12 mg / l de cultivo. Aunque este valor puede variar en los diferentes mutantes, en particular para las posiciones enterradas dentro de la proteína, el rendimiento puede verse comprometida de manera significativa. En estos casos,...

Este artículo describe métodos para el etiquetado de espín dirigido al sitio y la reconstitución de canales pentaméricos activados por ligandos para estudios de Resonancia Paramagnética Electrónica. Este protocolo se puede adaptar a cualquier proteína de membrana. El método de reconstitución descrito aquí también se puede utilizar para mediciones de patch-clamp de corrientes macroscópicas y de un solo canal en un sistema lipídico definido.

Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar la purificación, la marcaje con espín dirigido a un sitio específico y la reconstitución de un canal iónico ligando-activado pentamérico para estudios mediante resonancia paramagnética electrónica. Estudiar la dinámica de las proteínas de membrana en un entorno fisiológicamente relevante es fundamental para comprender completamente el funcionamiento de esta proteína de transporte en membrana. Y debido a estas necesidades, considero que la técnica de marcaje con espín dirigido a un sitio específico y la resonancia paramagnética electrónica son especialmente adecuadas.La principal ventaja de esta técnica es que no está limitada por el tamaño de la proteína. Por lo tanto, el marcaje con espín dirigido a un sitio y la espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica (EPR) serían la técnica de elección si desea estudiar la dinámica de proteínas grandes o proteínas reconstituidas en membranas. Introduzca mutaciones únicas de cisteína en el gen GLIC mediante mutagénesis dirigida a un sitio.Prepare un cultivo nocturno del mutante de cisteína de GLIC según se describe en el protocolo del texto. A continuación, agregue 100 mililitros d

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Investigación

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Química

Se describe un protocolo simple de identificar a las proteínas del cerebro que se unen a la terminal C de longitud completa de la ATP-dependientes P2X2 receptores. La extensión y aplicación sistemática de este enfoque a todos los receptores P2X se espera que conduzca a una mejor comprensión de la señalización del receptor P2X.

Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando

Vamos a describir un método que mide la cinética del transporte de iones de proteínas de membrana junto con el sitio específico de análisis de los cambios conformacionales con fluorescencia en células individuales. Esta técnica se adapta a los canales iónicos, transportadores y bombas iónicas y pueden ser utilizados para determinar las limitaciones distancia entre subunidades de la proteína.

Examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana In situ Sitio-dirigida con fluorescencia de etiquetado

Nos genéticamente-codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina en varias posiciones específicas en los GPCR y mostrar la versatilidad del grupo azido en diferentes aplicaciones. Estos incluyen una tecnología fotorreticulación dirigido a identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de un GPCR, y la modificación bioorthogonal específica de sitio de los GPCR con una etiqueta de epítopo de péptido o de la sonda fluorescente.

Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

Aquí se presenta un protocolo para experimentos FRET de alta precisión en el nivel de una sola molécula. Además, esta metodología puede usarse para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar las distancias exactas es el primer paso hacia la construcción de modelos estructurales basados ​​en experimentos FRET.

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

Este artículo describe métodos específicos para obtener cantidades bioquímicas de detergente solubilizado TRPV1 para análisis espectroscópico. Los protocolos combinados proporcionan herramientas bioquímicas y biofísicas que se pueden adaptar para facilitar los estudios estructurales y funcionales de canales del ion mamíferos en un ambiente controlado por membrana.

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Este protocolo presenta un método para medir la unión de nucleótidos de adenina a los receptores en tiempo real en un entorno celular. La unión se mide como transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre derivados de nucleótidos de trinitrofenilo y proteínas marcadas con un aminoácido fluorescente no canónico.

Medición de la unión de nucleótidos a proteínas de membrana intactas y funcionales en tiempo real

Se presenta un protocolo para la aplicación de espectroscopía de RMN de mejora de la relajación paramagnética para detectar interacciones inter e intramoleculares débiles y transitorias en proteínas intrínsecamente desordenadas.

Mejora de la relajación paramagnética para detectar y caracterizar las autoasociaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Este estudio presenta un procedimiento detallado para realizar experimentos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) en receptores acoplados a proteínas G (GPCR) utilizando el etiquetado específico del sitio a través de la incorporación de aminoácidos no naturales (UAA). El protocolo proporciona una guía paso a paso para la preparación de muestras smFRET, experimentos y análisis de datos.

Visualización de la dinámica conformacional de los receptores de membrana utilizando FRET de molécula única

Este protocolo presenta las herramientas disponibles para modelar ligandos de moléculas pequeñas en mapas crioEM de macromoléculas.

Modelado de ligandos en mapas derivados de la criomicroscopía electrónica

La electrofisiología es el estándar de oro para investigar la actividad de los canales iónicos. Sin embargo, hay muchos enfoques alternativos, incluidos los métodos ópticos. Aquí, describimos un método para monitorear la actividad de la repetición rica en leucina que contiene canales aniónicos formados por 8 canales (LRRC8) utilizando un método basado en la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre subunidades.

Monitorización de la actividad de repeticiones ricas en leucina que contiene 8 canales (LRRC8/VRAC) mediante transferencia de energía de resonancia de Förster de emisión sensibilizada (SE-FRET)

Aprende el etiquetado de espines dirigido por sitio y estudios de EPR en canales pentaméricos de ligandos de iones. Este protocolo permite analizar la dinámica de proteínas de membrana en entornos lipídicos fisiológicamente relevantes.

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