Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones

El objetivo general de este protocolo es demostrar la purificación, la marcaje con espín dirigido a un sitio específico y la reconstitución de un canal iónico ligando-activado pentamérico para estudios mediante resonancia paramagnética electrónica. Estudiar la dinámica de las proteínas de membrana en un entorno fisiológicamente relevante es fundamental para comprender completamente el funcionamiento de esta proteína de transporte en membrana. Y debido a estas necesidades, considero que la técnica de marcaje con espín dirigido a un sitio específico y la resonancia paramagnética electrónica son especialmente adecuadas.

La principal ventaja de esta técnica es que no está limitada por el tamaño de la proteína. Por lo tanto, el marcaje con espín dirigido a un sitio y la espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica (EPR) serían la técnica de elección si desea estudiar la dinámica de proteínas grandes o proteínas reconstituidas en membranas. Introduzca mutaciones únicas de cisteína en el gen GLIC mediante mutagénesis dirigida a un sitio.

Prepare un cultivo nocturno del mutante de cisteína de GLIC según se describe en el protocolo del texto. A continuación, agregue 100 mililitros de tampón estéril de fosfato de potasio al medio de caldo excelente (terrific broth) autoclavado. Luego, agregue glucosa estéril, kanamicina y 10 mililitros del cultivo nocturno.

Incubar a 37 grados Celsius en un agitador a 250 rpm. Añadir 50 mililitros de glicerol y continuar agitando el cultivo hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance entre 1,0 y 1,2. Después de inducir las células con IPTG 200 micromolar, restablecer la agitación a 250 rpm e incubar adicionalmente durante aproximadamente 16 horas a 18 grados Celsius.

Recolecte las células en botellas de centrífuga de un litro mediante centrifugación a 8500 × g, a cuatro grados Celsius, durante 15 minutos. Decante el sobrenadante y pese la botella con el botón celular según se describe en el protocolo escrito. Re suspenda el botón bacteriano en 150 mililitros de tampón A frío con hielo por cada litro de cultivo.

Homogenice las células haciéndolas pasar a través de un ruptor celular en una cámara fría a cuatro grados Celsius. Repita el proceso tres veces para lograr la lisis de la mayor parte de las bacterias. Centrifugue las células a 14.000 ×g durante 15 minutos.

Luego, aspire el sobrenadante y transfiéralo a un tubo cónico limpio. Después de centrifugar el sobrenadante a 168.000 ×g durante una hora, deseche cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento de membrana. Recupere el sedimento de membrana proveniente de un litro de cultivo y resuspenda en Buffer A, suplementado con glicerol al 10%, hasta un volumen final de 50 mililitros.

Añada 0,5 gramos de DDM a la suspensión de membranas y agite suavemente durante dos horas a cuatro grados Celsius. Después de la solubilización de las membranas, elimine los restos celulares del lisado mediante centrifugación a 168.000 × g durante una hora. Mientras tanto, prepare la resina de amilosa.

Transfiera tres mililitros de resina utilizando una pipeta a una columna de cromatografía vacía de polipropileno. Lave la resina pasando 10 volúmenes de lecho de agua tres veces, y luego 10 volúmenes de lecho del tampón A, que contiene DDM 0,5 milimolar. Después de la centrifugación, retire suavemente el sobrenadante utilizando una pipeta y transfiéralo a un tubo cónico limpio de 50 mililitros.

Para la unión por lotes, agregue la resina de amilosa previamente equilibrada al tubo cónico. Una la proteína extraída a la resina de amilosa agitando la mezcla mediante nutación durante dos horas a cuatro grados Celsius. A continuación, pase toda la suspensión a través de una columna de cromatografía y recoja el flujo de salida.

Diluya la proteína GLIC con 10 mililitros de tampón A que contiene 40 milimolar de maltosa, además de 0,5 milimolar de DDM y 0,5 milimolar de TCEP. El TCEP evita la oxidación de las cadenas laterales de cisteína. Recoja todo el eluido.

Concentre la proteína eluida utilizando un concentrador centrífugo hasta alcanzar entre cuatro y seis miligramos por mililitro. Añada la proteasa HRV 3C e incube durante la noche a cuatro grados Celsius. Para realizar la marcación específica con espín, primero añada un exceso molar diez veces mayor de la etiqueta de espín MTSL a la muestra digerida por proteasa, obteniendo una relación molar de 1:10 entre el monómero de GLIC y MTSL.

Después de una incubación de una hora, agregue más etiqueta espinial en una proporción molar cinco veces excedente e incube durante otra hora. Pase la muestra a través de una columna de cromatografía líquida de exclusión por tamaño rápida de proteínas, o FPLC, previamente equilibrada con tampón A y DDM 0,5 milimolar para separar la etiqueta MBP escindida y la etiqueta espinial libre en exceso de los pentámeros de GLIC. Concentre la solución proteica utilizando un concentrador centrífugo hasta una concentración final de aproximadamente ocho a diez miligramos por mililitro y colóquela en hielo.

La muestra ya está lista para la reconstitución. Para preparar los liposomas, enjuague un matraz redondo limpio de 25 mililitros con cinco mililitros de cloroformo y seque el matraz con una corriente de gas nitrógeno en la campana extractora. Luego, transfiera 10 miligramos de asolecina al matraz y seque los lípidos bajo una corriente continua de gas nitrógeno.

Cuando el cloroformo haya evaporado, coloque el matraz en vacío durante una hora para asegurar el secado completo. Luego, agregue un mililitro de tampón de reconstitución A al lípido seco y vortexe el matraz vigorosamente para suspender el pellet de lípidos. Para preparar vesículas unilamelares pequeñas, sonicar la suspensión de lípidos en un baño ultrasónico frío hasta que la solución de vesículas se vuelva más o menos traslúcida y no se observen grumos.

A esta mezcla, añada DDM hasta una concentración final de cuatro milimolares e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para reconstituir la proteína, agregue la proteína purificada a la mezcla de lípidos. Después de incubar la muestra a cuatro grados Celsius durante una hora con rotación suave, diluya la muestra hasta 15 mililitros con tampón A. Elimine el detergente residual en la suspensión utilizando perlas de poliestireno con poros hidrofóbicos que atrapan el detergente.

Añada 80 miligramos de perlas limpias e incube la suspensión de liposomas durante la noche en un agitador rotatorio a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, transfiera el liposoma a un tubo de ultracentrífuga de 25 mililitros utilizando un filtro en columna para eliminar las perlas y diluya adicionalmente la muestra hasta 25 mililitros. Después de centrifugar las muestras a 168.000 ×g durante dos horas, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento usando 100 microlitros de tampón B. Para realizar espectroscopía EPR de onda continua, primero transfiera la suspensión de liposomas a un tubo de 200 microlitros y peletee las muestras utilizando una centrífuga.

Después de desechar el sobrenadante, la muestra está lista para las mediciones de RPE. Retire la mayor cantidad posible de tampón de la muestra de liposomas. Para realizar el intercambio de tampón, transfiera 20 microlitros del sedimento de liposomas a un tubo microcéntrifuga utilizando una pipeta.

Añada 180 microlitros del tampón D e incube a 42 grados Celsius durante cinco minutos. Centrifugue la muestra, retire el sobrenadante utilizando una pipeta y repita el proceso tres veces para asegurar un intercambio completo del tampón. Las capilares de plástico permeables al gas son adecuadas para mediciones de formas de líneas espectrales y accesibilidad del disolvente.

Toque la capilaridad sobre el proteoliposoma sedimentado para aspirar la muestra hacia el interior y selle el extremo con cera ósea. Aquí se muestra la caracterización bioquímica de mutantes de GLIC marcados con espín mediante el cromatograma de filtración en gel de GLIC marcado con espín tras la escisión proteolítica de la etiqueta MBP. Los picos corresponden al pentámero de GLIC y al MBP libre.

El gel de electroforesis SDS-PAGE muestra la proteína de fusión monomérica GLIC-MBP sin digerir antes de la filtración en gel, así como las fracciones de MBP y GLIC obtenidas mediante filtración en gel. Se realizó un ensayo basado en FRET para monitorear el estado de agregación de GLIC reconstituida en diversos lípidos de membrana. Las mediciones de FRET se realizaron en muestras después de la reconstitución nocturna y tras varios ciclos de congelación-descongelación de las muestras.

En un parche de tipo inside-out extraído de vesículas de asolectina reconstituidas, GLIC se activa mediante saltos de pH utilizando un intercambiador rápido de solución. Se observa que los canales se activan en aproximadamente 10 milisegundos y se desensibilizan con una constante de tiempo de uno a tres segundos. Se observan reorganizaciones estructurales durante la activación del canal.

Aquí, los espectros de resonancia paramagnética electrónica de onda continua para una posición en la hélice M2 que reviste el poro muestran cambios en la amplitud y alteraciones en las formas en respuesta a variaciones del pH. La espectroscopía de RPE es un enfoque estructural insuperable para medir los cambios conformacionales de las proteínas de membrana en su entorno nativo, y proporciona una visión de los detalles moleculares de la dinámica proteica que quedan ocultos en las estructuras de alta resolución obtenidas por cristalografía de rayos X o microscopía crioelectrónica. Al trabajar con esta técnica, es importante tener presente que las mutaciones con frecuencia conducen a una baja estabilidad oligomérica y deficiente de la proteína.

Por lo tanto, es posible que necesite desarrollar una estrategia para abordar estos problemas. Combinar estos hallazgos de los estudios de RPE con mediciones funcionales puede proporcionarnos una imagen más completa para estudiar la relación entre estructura y función, y los avances tecnológicos futuros tienen como objetivo utilizar este enfoque poderoso para estudiar canales humanos más complejos en condiciones lipídicas más sofisticadas.