Name: Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprende a generar células dendríticas tolerogénicas y maduras a partir de monocitos mediante separación magnética y cultivo con citocinas. Este protocolo permite estudiar perfiles metabólicos y marcadores de maduración para investigación inmunológica y desarrollo de vacunas.

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<ol><li>Jolles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paul+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paul Langerhans.</a> J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li>
<li>Steinman, R. M., Swanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocytic+activity+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The endocytic activity of dendritic cells.</a> J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).</li>
<li>Hemmi, H., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+and+the+function+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">TLR signalling and the function of dendritic cells.</a> Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).</li>
<li>Mueller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+maintaining+peripheral+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms maintaining peripheral tolerance.</a> Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+phagocytosed+cellular+fragments+on+the+major+histocompatibility+complex+class+II+products+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells.</a> J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).</li>
<li>Paavonen, J., Lehtinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+human+papillomavirus+and+other+sexually+transmitted+agents+in+the+etiology+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer.</a> Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).</li>
<li>Ohtani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+target+of+rapamycin+and+glycogen+synthase+kinase+3+differentially+regulate+lipopolysaccharide-induced+interleukin-12+production+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells.</a> Blood. 112 (3), 635-643 (2008).</li>
<li>Wilde, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+renal+biopsies+of+patients+with+ANCA-associated+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).</li>
<li>Al-Hello, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enterovirus+strain+isolated+from+diabetic+child+belongs+to+a+genetic+subcluster+of+echovirus+11%2C+but+is+also+neutralised+with+monotypic+antisera+to+coxsackievirus+A9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9.</a> J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).</li>
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<li>Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+blood+CD11c%28%2B%29+dendritic+cells+and+monocyte-derived+dendritic+cells+differ+in+their+ability+to+stimulate+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes.</a> Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).</li>
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<li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes%3A+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).</li>
<li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+double+gradient+centrifugation+and+their+differentiation+to+macrophages+in+teflon-coated+cell+culture+bags%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags.</a> J Vis Exp. (91), (2014).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+human+granulocyte+and+monocyte+isolation+procedures+on+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies.</a> Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Faresjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+useful+guide+for+analysis+of+immune+markers+by+fluorochrome+%28Luminex%29+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique.</a> Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).</li>
<li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Defawe, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+qualification+of+a+multiplex+bead+array+to+assess+cytokine+and+chemokine+production+by+vaccine-specific+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells.</a> J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+self-healing+Langerhans+cell+histiocytosis+with+pulmonary+involvement%3A+spontaneous+regression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Assoc+Thai%22%5BJournal%5D)">Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression.</a> J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).</li>
<li>Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dendritic+cells+from+human+bone+marrow+mononuclear+cells%3A+advantages+for+clinical+application+in+comparison+to+peripheral+blood+monocyte+derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells.</a> Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).</li>
<li>Felzmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+enrichment+from+leukapharesis+products+for+the+generation+of+DCs+by+plastic+adherence%2C+or+by+positive+or+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection.</a> Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).</li>
<li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+%28Elutra%29+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).</li>
<li>Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+soluble+antigen+by+cultured+human+dendritic+cells+is+maintained+by+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+plus+interleukin+4+and+downregulated+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).</li>
<li>Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Langerhans+cell+histiocytosis+of+the+lacrimal+gland+in+an+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult.</a> Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).</li>
<li>Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaper+dermatitis%3A+a+review+and+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Diaper dermatitis: a review and update.</a> Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).</li>
<li>Gebhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cutaneous+Rosai-Dorfman+disease+refractory+to+imatinib+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy.</a> Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).</li>
<li>Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neural+tyrosine+hydroxylase%2C+via+modulation+of+endocrine+pancreatic+precursors%2C+is+required+for+normal+development+of+beta+cells+in+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas.</a> Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).</li>
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<li>Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-resistant+swelling+of+the+upper+eyelid+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologe%22%5BJournal%5D)">Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood.</a> Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).</li>
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En este trabajo se describe un método para generar a partir de monocitos inmaduras, moDCs moDCs tolerogénicas y moDCs maduros. Los pasos importantes en este protocolo se discuten en detalle en los siguientes párrafos. Es importante tener en cuenta que la sangre periférica humana se utiliza como material de partida en este protocolo y precauciones universales para el manejo de la sangre humana se debe practicar. Aunque es técnicamente factible para derivar DCs de la médula ósea en los seres humanos 24, la diferenciación in vitro de DC células que se encuentran en la sangre periférica se prefiere debido a la disponibilidad de la sangre periférica en comparación con la médula ósea. Entre las células que se encuentran en la sangre periférica, las células y los monocitos CD34 + madre hematopoyéticas se utilizan comúnmente para la generación in vitro de las DC. CD34 hematopoyéticas + las células madre son cultivadas con GM-CSF y TNF-α para derivar subconjuntos CD1a + y CD14 +, que entonces se diferencian además en Langerhanscomo las células y las células dendríticas. Por el contrario, los monocitos se cultivan en GM-CSF e IL-4 para generar moDCs inmaduros. Varios protocolos se utilizan para el enriquecimiento de los monocitos de sangre periférica; por ejemplo, por adherencia a placas de plástico, elutriación y kits de aislamiento 25, 26 Las ventajas del protocolo de adhesión son el mínimo daño a las células y relativamente rentable sin embargo célula pureza podría verse comprometida.; y un paso adicional se requiere para separar las células para experimentos adicionales. Elutriación es una técnica que separa las células en función de su tamaño y densidad. Las ventajas de elutriación son la viabilidad celular y los monocitos se pueden utilizar fácilmente para experimentos adicionales; sin embargo, esta técnica está limitada por la disponibilidad de un elutriador y la incapacidad para separar las diferentes poblaciones de células (células T y monocitos) con parámetros de sedimentación similares. Comercialmente disponibles kits de aislamiento utilizan microperlas magnéticas para seleccionar ya sea positiva oseleccionar negativamente a la población de monocitos. Algunos protocolos están sesgadas hacia el aislamiento de monocitos mediante la selección negativa, como los monocitos aislados permanecen &quot;sin tocar&quot; (que no esté obligado por marcas o microperlas). En este protocolo, perlas de CD14 se usaron para los monocitos humanos seleccione positivos de PBMCs. CD14 carece de un dominio citoplásmico y unión del anticuerpo a CD14 no desencadena la transducción de señales. Por otra parte, las microperlas se separará de los monocitos después del cultivo y, por tanto, no obstaculiza el proceso de diferenciación. Además, CD14 se expresa fuertemente en la mayoría de los monocitos y débilmente en los neutrófilos y algunas células dendríticas mieloides, por lo tanto, este método de los resultados de aislamiento en una mayor pureza de células que los otros métodos 17. monocitos de sangre pueden ser diferenciadas en DCs o los macrófagos y el destino de los monocitos depende en gran medida sobre el medio ambiente de citoquinas. En este trabajo, moDCs se generan mediante la adición de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) Y la interleucina 4 (IL-4) a los monocitos de sangre periférica humana. Se requiere GM-CSF para la supervivencia de monocitos y la IL-4 ejerce una actividad inhibidora sobre la diferenciación de los macrófagos; y la adición combinatoria de GM-SCSF y IL-4 a los monocitos dió un mayor porcentaje de moDCs inmaduras en comparación con citoquinas individuales 27. Hay otros protocolos que generan moDCs mediante la adición de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interferón alfa (IFN-α) y la interleucina 13 (IL-13) para monocitos de sangre periférica 28, 29, 30. La combinación de GM-CSF e IL-4 se ha optimizado en la década de 1990 y ahora un protocolo aceptado que genera CD inmaduras de plástico diferenciadas en moDCs inmunogénicos o tolerogénicas y polarizadas en Th1, Th2 o Th17 moDCs promotoras. moDCs inmaduros se diferencian en moDCs tolerogénicos por la adición de vitamina D3 y dexametasona. Hay varios protocolos para generar los DC tolerogénicos por ejemplo, a través deel factor nuclear kappa B (NF-kB) la inhibición, la activación de β-catenina, vitamina D3, dexametasona y rapamicina 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Aunque tanto la vitamina D3 y dexametasona sola se han reportado para inducir un efecto tolerogénico en países en desarrollo, la combinación de vitamina D3 y dexametasona resultado en una mayor supresión de la alloproliferation que cuando se utilizan los fármacos individuales. Por lo tanto, el protocolo existente para la generación de DCs tolerogénico se modificó para una combinación de vitamina D3 y dexametasona. Este método está siendo aceptado como un modelo para los países en desarrollo tolerogénicas humanos con una utilidad terapéutica. También es importante tener en cuenta que la vitamina D3 reconstituido y dexametasona tienen una vida útil corta. En este protocolo, se añadió lipopolisacáridos (LPS) como inductor de la maduración de DC. moDCs inmaduros también pueden ser inducidas a la maduración usando cóctel pro-inflamatoria:(TNF-α), interleucina 1 beta (IL-1β), interleucina 6 (IL-6) y la prostaglandina E2) o citocinas pro-inflamatorias (TNF-alfa y el interferón gamma (IFN-Γ)). Cóctel Pro-inflamatorio genera moDCs maduros con funciones de alto co-estimuladoras y migratorias pero producen niveles relativamente bajos de IL-12 38. TNF-α o IFN-Γ por sí sola no es capaz de inducir un fenotipo dendríticas estable 39. LPS estimula Toll-like receptor 4 (TLR4), media la activación de NF-kB y activadas por mitógenos proteínas quinasas (MAPKs) para inducir la maduración de DC. DC maduración inducida por LPS muestra una sobre regulación de marcadores de maduración DC (CD83, CD86, HLA-DR) y también dio lugar a la producción de IL-12p70. Además, este paso puede ser modificado adicionalmente para emparejar LPS con agonistas de TLR3 para producir CD maduras para vacunas contra el cáncer clínicos. En este papel, los DC tolerogénicos se muestran para ser resistente a la maduración en el tratamiento LPS. Estos semi-maduros, como los países en desarrollo no son inmunogénicas y no lo hacen releaSE citoquinas pro-inflamatorias 40. Las limitaciones de este protocolo se encuentran en el proceso de diferenciación. El proceso de toma 8 días desde el día 0 al día 7 que plantea una dificultad que ser adaptado en los análisis de alto rendimiento. Una modificación en el protocolo se requiere para acortar el proceso de diferenciación aún producir un gran número de países en desarrollo viables en los diferentes estados. En segundo lugar, los países en desarrollo se generan mediante la adición de citoquinas en este protocolo y estas citoquinas no corroboran la población CC por un largo período de tiempo. Por otra parte, las citoquinas se utilizan en concentraciones mucho más altas que en vivo y podría resultar en el desarrollo parcial de las vías que no son fisiológicamente idénticos a los DC in vivo. Por ejemplo, en cultivos in vitro de precursores de DC se ha demostrado que responder a GM-CSF, que no es una citoquina esencial para la diferenciación normal de DC in vivo 41. Sin embargo, la estimulación de citoquinas puede ser un método útil para genevaluar un gran número de DC in vitro para la experimentación. La posibilidad de someter estas células generadas a partir de este protocolo para otros análisis, tales como la tinción de inmunofluorescencia, citometría de flujo, alo estudios de reacciones metabólicas y estudios aumenta la utilidad de este método. Estos países en desarrollo in vitro sirven como un buen modelo para mejorar el conocimiento del desarrollo de la CC, la maduración y la presentación de antígenos, que es previamente difícil de hacer con los números raros de los DC in vivo. Capacidad de los países en desarrollo &#39;para regular la inmunidad inmunológica frente a la tolerancia que los hace candidatos atractivos en la terapéutica contra el cáncer y enfermedades autoinmunes 42, 43, 44, 45. DCs inmunogénicas generados en este protocolo se puede utilizar para mejorar la eficacia de la vacunación contra las enfermedades infecciosas y tumores; mientras que los DC tolerogénicos pueden usarse para controlar las respuestas de células T no deseada y evitar rechazos después del trasplante. el intrincadoequilibrio entre la inmunidad y la tolerancia depende enormemente sobre el estado de diferenciación de DC. DC diferenciación celular es un programa coordinado que se rige por múltiples vías de señalización y destino metabólico. Los diferentes estados de diferenciación de DC difieren en las necesidades bioenergéticos y la biosíntesis; por ejemplo, las DC activadas requieren adaptaciones metabólicas más energéticas importantes para la supervivencia y la migración en comparación con los países en desarrollo en el estado de reposo. Es importante tener en cuenta que la vitamina D3, dexametasona y rapamicina son conocidos por su capacidad para inducir los DC tolerogénicos, se han descrito para influir en el metabolismo de DC. En este trabajo, el metabolismo energético de moDCs de diferentes estados de diferenciación se caracterizaron utilizando analizadores de flujo extracelulares y moDCs tolerogénicas exhibió la más alta maduración inducida por LPS plasticidad metabólica y la disminución de esta plasticidad. Metabolismo anabólico apoya maduración países en desarrollo, mientras que las influencias del metabolismo catabólico tolerogénico DC funciona 46. las CDgenerados a partir de este protocolo se puede utilizar para evaluar si la alteración del estado metabólico de los países en desarrollo son la clave para la modificación de la inmunidad y la tolerancia en la terapéutica. En conclusión, hemos presentado un protocolo para la generación de inmaduros, tolerogénico y moDCs maduros fundamental para el estudio de las funciones inmunorreguladoras PED.

DC fue descrita por primera vez por Paul Langerhans (células de Langerhans) a finales del siglo XIX, como la que hace referencia Jolles 1 y caracterizado por Ralph Steinman y Cohn Zanvil en 1973 que los reconoce como células presentadoras de antígenos profesionales 2. DCs se encuentran en la sangre periférica y en la mayoría de los tejidos del cuerpo, especialmente abundante en los tejidos que están expuestos al ambiente externo tales como la piel (presente como células de Langerhans) y en las paredes de la nariz, los pulmones, el estómago y los intestinos que permiten que se encuentran con antígenos extrínsecos. Inmaduros países en desarrollo tienen la capacidad endocítica pero relativamente baja capacidad de estimular células T 3. Inmaduros países en desarrollo expresan diferentes receptores de reconocimiento de patrones (RRP) que los patrones de captura asociados a patógenos moleculares (PAMPs) o patrones moleculares asociados a daños (apaga) 4. La activación de las señales de peligro en coche hacia la maduración de las CD inmunogénicas mientras auto-moléculas dan lugar a células T unresponsiveness y la apoptosis 5. DCs inmunogénicas se caracterizan por la regulación positiva de moléculas de MHC y moléculas de superficie coestimuladoras y su capacidad de las células T vírgenes 6,7. Inmaduros países en desarrollo también puede ser madurado hacia un estado Treg-inducir o tolerogénico en respuesta a la vitamina D3 metabolito 1a, 25 (O) 2 D 3 y ciertos agentes inmunosupresores como la interleucina-10 (IL-10), dexametasona y rapamicina 8-9. DCs tolerogénico se caracterizan por su expresión de los motivos de inhibición basado en tirosina inmunoreceptor (ITIM) que contienen receptores de la superficie y ligandos. La transducción de señales de ITIMs que contienen miembros de la familia ILT, ILT3 y ILT4 en los DC tolerogénicos inhibir alloproliferation y conducir Foxp3 + Treg expansión 10,11. Estas propiedades únicas de los DC tolerogénicos conducen a su profunda potencia in vivo, es decir, la capacidad de inducir tolerancia a los injertos alogénicos durable trasplantados y SupprESS el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Tolerogénico DCs se puede ver, por tanto, como un subtipo de DCs maduras polarizada que funcionan de la inhibición de la activación inmune. Actualmente, hay dos subconjuntos generales de las células dendríticas en la sangre periférica humana: DCs plasmacitoides y CD mieloides 12. DCs circulantes son constituyente rara a menos del 2% de los leucocitos en la sangre humana, y esto supone una dificultad para el aislamiento de un número apropiado de los DC para estudiar sus funciones inmunorreguladoras. Para superar este problema, los monocitos diferenciados DCs se utilizan como un modelo in vitro para el estudio de la función de células dendríticas. Estos países en desarrollo in vitro tienen receptores y funciones similares con respecto a los DC in vivo. Comparación detallada de los DC in vivo, y en los países en desarrollo derivadas de monocitos in vitro (generada moDCs) son investigados por otros laboratorios 13, 14, 15. También se informa de que los moDCs y CD1c + DC fueron equivalentes a presentadora de antígeno y la inducción de la función de las células T 15. En este trabajo se describe un método para generar moDCs inmaduras a partir de monocitos de sangre periférica y luego diferenciándolos a CD inmunogénicas y tolerogénicas. Estas células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs) se caracterizan por sus marcadores de superficie, perfil de citocinas, funciones inmunorreguladoras y estados metabólicos. células dendríticas inmunogénicas y tolerogénicas producen diferentes citoquinas que dan lugar a la expansión de cualquiera de las células T alogénicas o células T reguladoras. En este trabajo, el perfil de citoquinas se realiza con los sistemas que utilizan la tecnología de multiplexación. El medio de crecimiento de las células se incuban con perlas codificadas por colores anticuerpo inmovilizado y leer en un analizador compacto. estados metabólicos de los países en desarrollo se analizan utilizando analizadores de flujo extracelulares que miden la tasa de consumo de oxígeno, un indicador de la respiración celular, y la tasa de acidificación extracelular que refleja glicolíticaflujo en células dendríticas. La medición de estas tasas de bioenergética proporciona un medio para realizar un seguimiento de los cambios en el metabolismo celular que son vitales en el desarrollo de células dendríticas y la función.

<table><tbody><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Aislamiento PBMC</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Becton, Dickinson</td><td>302832</td><td>Aislamiento PBMC</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Aislamiento PBMC</td></tr><tr><td>15 ml tubo halcón</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>Aislamiento PBMC</td></tr><tr><td>50 ml tubo halcón</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Aislamiento PBMC</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PBMC aislamiento</td></tr><tr><td>0.2 y micro; m filter</td><td>Sartorius stedim biotech</td><td>17597</td> Kit MACs <td>de aislamiento PBMC</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-201</td><td>Enriquecimiento de monocitos</td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-102</td><td>Enriquecimiento de monocitos</td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo celular</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td></td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070103</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Fosfato solución salina tamponada</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11140-040</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15575</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-868</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-924</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Vitamina D3</td><td>Sigma</td><td>D1530</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D2915</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>l2755</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>azul de tripán</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>HLADR&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>CD80 BD conjugada con PE</td><td>Biosciences</td><td>557227</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>CD83 conjugada con PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>556855</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>CD86 conjugada con PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>CD11c conjugado con APC BD</td><td>Biosciences</td><td>340544</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>CD14 conjugada con PE&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-242</td><td>Citometría</td></tr> de <tr><td>BDCA3 conjugada con PE&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-090-514</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>ILT3 conjugada con APC&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-5139-73</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>Isotipo coincidente PerCP- conjugado Mab</td><td>BioLegend</td><td>400250</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>Isotipo coincidente PE- conjugado Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-835</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>Isotipo coincidente APC- conjugado Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-836</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>BD LSR II Citómetro de flujo</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD LSR II&nbsp;</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>citofix/citoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>CD25 BD conjugada con APC/</td><td>CY7 pharmingen</td><td></td><td>557753 Citometría</td></tr><tr><td>PE/CY7-conjugada CD4</td><td>Biolegend 300512</td><td></td><td>Citometría</td></tr><tr><td>CD3 conjugada con perCP</td><td>Biolegend</td><td>300428</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de enriquecimiento de células T CD4+ humanas</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td>Estudio de aloreacción</td></tr><tr><td>Imán EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td>Estudio de alorreacción</td></tr><tr><td>Cell Trace Kit de proliferación celular CFSE</td><td>Sondas moleculares</td><td>C34554</td><td>Estudio de alorreacción</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Estudio de aloreacción</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-conjugado FoxP3</td><td>BD Biosciences</td><td>560889</td><td></td></tr><tr><td>Milliplex MAP Humano Citoquina/Quimiocina panel de perlas magnéticas</td><td>Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K Análisis de</td><td>citoquinas</td></tr><tr><td>5 ml Tubo de poliestireno</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>Análisis de citoquinas</td></tr><tr><td>Luminex Sheath Fluid&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SHEATHFLUID</td><td>Análisis de citoquinas</td></tr> Sistema <tr><td>FLEXMAP 3D con software xPONENT</td><td>Luminex Corporation</td><td>FLEXMAP 3D</td><td>Análisis de citoquinas</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Cell Signalling</td><td>9082</td><td>Actividad mitocondrial</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>Actividad mitocondrial</td></tr><tr><td>XF Medio de ensayo (OCR)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102352-000</td><td>Adaptación metabólica</td></tr><tr><td>Glucosa&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>Adaptación metabólica</td></tr><tr><td>XF Base Medium (ECAR)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Adaptación metabólica</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Adaptación metabólica</td></tr><tr><td>Calibrant</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000&nbsp;</td><td>Adaptación metabólica</td></tr><tr><td>Kit de estrés XF Cell Mito Caballo de mar</td><td>Bioscience</td><td>103015-100</td><td>Adaptación metabólica</td></tr><tr><td>XF Kit de estrés de glucólisis</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103020-100</td><td>Adaptación metabólica</td></tr><tr><td>Caballito de mar&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td>Adaptación metabólica</td></tr></tbody></table>

generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

resultados de la respuesta inmune de una compleja interacción entre el sistema inmune innato antígeno no específico y el sistema inmune adaptativo antígeno específico. El sistema inmune es un equilibrio constante en el mantenimiento de la tolerancia a la auto-moléculas y reaccionar rápidamente a los patógenos. Las células dendríticas (DC) son potentes células presentadoras de antígenos profesionales que enlazan el sistema inmune innato al sistema inmune adaptativo y equilibrar la respuesta adaptativa entre lo propio y no propio. Dependiendo de las señales de maduración, las células dendríticas inmaduras se pueden estimular selectivamente a diferenciarse en DCs inmunogénicos o tolerogénicas. células dendríticas inmunogénicas proporcionan señales de proliferación de células T específicas de antígeno para la expansión clonal; mientras que las células dendríticas tolerogénicas regulan la tolerancia por la eliminación de células T específica de antígeno o la expansión clonal de las células T reguladoras. Debido a esta propiedad única, las células dendríticas son muy codiciados como agentes terapéuticos para el cáncer y dise autoinmuneASES. Las células dendríticas se pueden cargar con antígenos específicos in vitro y se inyectan en el cuerpo humano para montar una respuesta inmune específica tanto inmunogénica y tolerogénico. Este trabajo presenta un medio para generar in vitro a partir de monocitos, células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (moDCs), tolerogénico y moDCs maduros que difieren en la expresión de marcadores de superficie, la función y fenotipos metabólicos.

La purificación de monocitos y la diferenciación de las células dendríticas Los monocitos se purificaron a partir de PBMC por centrifugación de densidad de la sangre periférica (Figura 1A), seguido de CD14 + selección positiva de separación magnética (Figura 1B) y se cultivaron en medio completo en presencia de GM-CSF e IL-4 para obtener células dendríticas inmaduras ( Figura 2A). La adición de vitamina D3 y post dexametasona GM-CSF e IL-4 dio como resultado la diferenciación de moDCs inmaduras en moDCs tolerogénicas (Figura 2B). Se añadió LPS para inducir la maduración de moDCs inmaduros para madurar moDCs (Figura 2C) y moDCs tolerogénicas fueron estimuladas con LPS para verificar la resistencia a la maduración (Figura 2D). Las muestras de sangre utilizadas en este trabajo fueron obtenidos de donantes sanos con previa informadasconsentimiento. Caracterización moDC Caracterización de superficie marcador por Citometría de Flujo El análisis de marcadores de superficie DC demostró que moDCs maduros expresan los más altos niveles de marcadores de maduración HLA-DR, CD83 y CD86 en comparación con moDCs tolerogénicas tratados con LPS, moDCs tolerogénicas y moDCs inmaduras (Figura 3). Estos resultados demostraron que moDCs tolerogénicas eran resistentes a la maduración, en comparación con moDCs inmaduras después de la estimulación LPS. Además, LPS-tratada moDCs tolerogénicas y moDCs tolerogénicas muestra aumento de la expresión de CD14, BDCA3 (CD141) y la transcripción de tipo inmunoglobulina (ILT) 3 en comparación con moDCs inmaduros y maduros. Los moDCs tolerogénicas que generamos aquí es consistente con informes anteriores 23. Caracterización funcional de moDCs moDCs inducidas para la maduración se vuelven inmunogénicas y liberan citoquinas que promueven la proliferación de células T CD4 +. Se evaluó la inmunogenicidad de los diferentes subtipos moDC mediante la medición de la proliferación de células T co-cultivadas. MoDCs tolerogénico eran poco inmunogénico en comparación con moDCs maduros, como se muestra por la baja alloproliferation de las células T CD4 + (Figura 4A). MoDCs tolerogénico se caracterizan por su baja IFN-Γ, bajo la IL-12p40, y la producción de citoquinas alta IL-10 en alloreaction co-cultivos con células T CD4 + (Figura 4B). Por otra parte, aloespecıfica aumentando el número de moDCs tolerogénicas en co-cultivos de moDCs maduras inducida por las células T CD4 + aumentaron la frecuencia de alta Foxp3 + células T reguladoras CD25 (Figura 4C). <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Análisis de la actividad mitocondrial Rojo CMXRos se utiliza para reflejar la actividad mitocondrial para analizar los niveles de potencial de membrana mitocondrial en moDCs. Se han observado moDCs tolerogénico a tener una mayor actividad mitocondrial en comparación con los otros subtipos moDC diferenciadas (Figura 5A). A continuación, la tasa de consumo de oxígeno mitocondrial (OCR) se evalúa para los diferentes subtipos moDC usando un Bioanalyzer. OCR mediciones permiten penetraciones de alta resolución en el perfil metabólico, proporcionando información, incluyendo pero no limitado a la respiración basal, la capacidad respiratoria de recambio, de fugas de protones y la respiración mitocondrial no. La medición de OCR proporciona un medio para evaluar la capacidad de las células para responder al estrés. Las células se metabólicamente perturbadas por la adición de tres compuestos diferentes en sucesión. La primera inyección es Oligomycin (ATP acoplador) que inhibe el complejo V de la cadena de transporte de electrones (ETC), la inhibición de la síntesis de ATP. Este paso distingue el porcentaje de oxígeno consumido para la síntesis de ATP y el porcentaje de oxígeno consumido para superar fuga de protones a través de la membrana mitocondrial interna. La segunda inyección es FCCP (ETC acelerador) que interrumpe la síntesis de ATP mediante el transporte de iones de hidrógeno a través de la membrana mitocondrial en lugar de a través del canal de protones de V. Complex El colapso del potencial de membrana mitocondrial conduce a un rápido consumo de energía y oxígeno, sin la generación de ATP. tratamiento FCCP se puede utilizar para calcular la capacidad respiratoria de recambio de las células. Mantenimiento de la capacidad respiratoria repuesto en condiciones de estrés es fundamental para la supervivencia celular. Esta capacidad se determina por varios factores, incluyendo la disponibilidad de sustrato y la capacidad funcional de las enzimas implicadas en el ETC. La tercera inyección es una combinación de rotenona, un Complex I inhibidor, y antimicina A, un inhibidor de Complejo III. Esta combinación se apaga la respiración mitocondrial y OCR se observa a disminuir como resultado de la alteración de la función mitocondrial (Figura 5C). MoDCs tolerogénico muestran niveles basales de OCR más altas que moDCs maduros (Figura 5D). Además, tolerogénico, LPS-tolerogénico, y moDCs inmaduros mostró un aumento de la capacidad respiratoria repuesto en comparación con moDCs maduros (Figura 5E). Caracterización metabólica de moDCs Dado que el ácido láctico y los protones son liberados de las células durante la glucólisis, analizamos la actividad glucolítica de moDCs mediante la realización de un análisis en tiempo real de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) (Figura 6B). En presencia de glucosa, la tasa glucolítica de todos moDCs aumentó en comparación con la etapa basal, conmoDCs maduros que presentan una mayor tasa glucolítica que moDCs inmaduros (Figura 6D). Tolerogénico y moDCs inmaduros exhiben mayor glucólisis máxima (inducida por oligomicina en presencia de glucosa) en comparación con moDCs tratados con LPS (Figura 6B). La capacidad glucolítica de moDCs tolerogénicas e inmaduros fue mayor que moDCs maduros (Figura 6E). En contraste con su alta tasa glucolítica, reserva glicolítica fue la más baja en moDCs maduros (Figura 6F). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" /> Figura 1:. Purificación de monocitos de sangre periférica (A) 25 ml de sangre es en capas cuidadosamente sobre 15 ml de Ficoll por 50 ml tubo antes de la centrifugación. PBMCs se concentran en una capa debajo de plasma después de la centrifugación de densidad. (B) PBMCs se incubaron con microperlas que son conj<html> ugated a anticuerpos monoclonales CD14 humanos (isotipo: IgG2a de ratón). y luego se cargó en una columna que se coloca en el campo magnético de un separador para aislar los monocitos CD14 + <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" /> Figura 2: Caracterización morfológica de moDCs. (A) se añaden 200 ng / ml de GM-CSF e IL-4 a + monocitos CD14 purificadas en el Día 0, 4 y 6 para generar moDCs inmaduros; y (B) una etapa adicional de la estimulación con 100 nM de vitamina D3 y 10 nM de dexametasona en el Día 5 genera moDCs tolerogénicas. MoDCs inmaduros y moDCs tolerogénicas son estimuladas con LPS 1 mg / ml en el día 6 de generar (C) y madurar moDCs moDCs (D) LPS-tolerogénicas.TTP: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" /> Figura 3:. Superficie marcador Caracterización por citometría de flujo Los niveles de expresión de marcadores de superficie HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 y LT3 en tolerogénico (verde), LPS-tolerogénicas (negro), no maduro (rojo), madura (azul) moDCs. controles de isotipo se muestran en gris. histograma individual para cada tipo de célula se representa con el recuento de células del eje Y frente al log del eje X de la intensidad del fluoróforo y superpuesta. Todos los histogramas son representativos de cuatro experimentos independientes. Esta cifra ha sido modificado a partir de J Immunol 194 (11), 5174 a 5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 de junio de 2015). Reproducido y publicado con autorización de derechos de autor. Derechos de autor 2015. La Asociación Americana deLos inmunólogos, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" /> Figura 4: Caracterización funcional de moDCs. (A) La cuantificación de la frecuencia alloproliferation de las células T CD4 + inducidos por la co-cultivo con un número creciente de tolerogénico (TOL; verde), LPS-tolerogénico (L-TOL; negro), inmadura (IMM; rojo) y maduros (MAT ; azul) moDCs. Los datos se agruparon de cuatro experimentos independientes; media + SEM diferencias estadísticas entre todos moDCs frente moDCs maduros fueron analizados por ANOVA de dos vías con Dunnett comparación múltiple post-test. (B) Análisis de citoquinas de IFN-Γ (panel izquierdo), IL-12p40 (panel central) y Il- 10 (panel de la derechal) en los sobrenadantes de alloreactions entre CD4 + T-células co-cultivadas con un número creciente de cualquiera tolerogénico (verde), no maduro (rojo) o azules) moDCs maduros (. Se combinaron los datos de seis experimentos independientes; media ± SEM alloproliferation de células T (C) CD4 + y regulador de expansión de las células T inducida por el co-cultivo con moDCs maduras en presencia de números de moDCs tolerogénicas creciente. Izquierda del eje Y, la frecuencia de la proliferación de células T CD4 +. Derecho del eje Y, la frecuencia de CD25 alta Foxp3 + células cerradas en las células T proliferativa CD4 +. Los datos se agruparon a partir de tres experimentos independientes; media ± SEM diferencias estadísticas entre la presencia o la ausencia de moDCs tolerogénicas fueron analizados por ANOVA de una vía con Dunnett comparación múltiple post-test. (D) alloproliferation de células T CD4 + (izquierda) y la frecuencia de las células CD25highFoxP3 + (Derecha) inducida por la cooperación cultivo con moDCs tolerogénicasen presencia de números de moDCs maduros en aumento. Los datos se agruparon de dos a tres experimentos independientes; media ± SEM diferencias estadísticas entre la presencia o la ausencia de moDCs maduros fueron analizados por ANOVA de dos vías con la comparación múltiple de Dunnett post-test. Esta cifra ha sido modificado a partir de J Immunol 194 (11), 5174 a 5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 de junio de 2015). Reproducido y publicado con derechos de autor permiso. Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" /> Figura 5: Análisis de la Actividad mitocondrial de moDCs. (A) Los niveles de potencial de membrana mitocondrial (Red CMXRos) en moDCs se obtuvieron por fAnálisis de citometría de baja. Se combinaron los datos de cuatro experimentos independientes. Media ± SEM (B) Representación esquemática de una respiración mitocondrial en tiempo real. análisis OCR a partir de la respiración basal y después de la adición de oligomicina (inhibición V complejo), FCCP (inducción máxima de la respiración), y rotenona / antimicina mezcla (cadena de transporte de electrones inhibición [ETC]). El SRC mitocondrial (basal máxima resta de respiración máxima) se deriva de la curva de OCR. (C) estudio cinético Representante de las mitocondrias OCR (pmol / min) en tolerogénico (TOL, verde), LPS-tolerogénico (L-TOL, negro) , inmadura (IMM, rojo) y maduros (MAT, azul) moDCs mediante la adición secuencial de oligomicina (Olig), FCCP, y la rotenona / antimicina (Rot-AA). (D) OCR cuantificación de respiración basal de moDCs y ( E) las piezas de la capacidad respiratoria de moDCs. Los datos se agruparon a partir de cinco experimentos independientes. Media ± SEM. Esta cifra ha sido modificado a partir de J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 de junio de 2015). Reproducido y publicado con derechos de autor permiso. Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" /> Figura 6: Caracterización metabólica de moDCs. (A) Representación esquemática de la glucólisis en tiempo real. análisis ECAR comienza desde ECAR basal, en el que las células se incubaron en medio libre de glucosa seguido de la adición de glucosa (inducción glucólisis), oligomicina (que induce la glucólisis celular máxima y la inhibición complejo V), y, finalmente, 2-desoxi-D- glucosa(Inhibición glucólisis). Tasa glucolítica (inducción de la glucólisis restarse para ECAR basal), capacidad glucolítica (glucólisis máxima sustraída de ECAR basal), y reserva glucolítica (glucólisis máxima resta para la inducción de la glucólisis) se derivan de la curva de ECAR. (B) estudio cinético Representante de la glucólisis dependiente ECAR (mPH / min) en tolerogénico (TOL, verde), LPS-tolerogénico (L-TOL, negro), inmadura (IMM, rojo), y maduro (MAT, azul) moDCs mediante la adición secuencial de glucosa (gluc), oligomicina (Olig), y 2-DG. Bares (C) muestran niveles basales ECAR (D) tasa glucolítica (e) de capacidad glucolítica, y (f) reserva glucolítica de moDCs. Los datos se agruparon a partir de tres experimentos independientes; significa 6 SEM. Las diferencias estadísticas fueron analizados por ANOVA de una vía con un post-test de comparación múltiple de Tukey. Esta cifra ha sido modificado a partir de J Immunol 194 (11), 5174 a 5186, doi: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 de junio de 2015). Reproducido y publicado con derechos de autor permiso. Derechos de autor 2015. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Las células dendríticas inmaduras pueden diferenciarse selectivamente en células dendríticas tolerogénicas o maduras para regular el equilibrio entre inmunidad y tolerancia. Este trabajo presenta un medio para generar a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (moDCs), in vitro tolerogénicas y moDCs maduras que difieren en fenotipos metabólicos.

Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

El objetivo general de este protocolo es generar células dendríticas tolerogénicas y maduras a partir de monocitos para la experimentación o el desarrollo de vacunas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología al proporcionar un modelo para estudiar el desarrollo, la maduración y la presentación de antígenos de las células dendríticas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la generación de un gran número de células dendríticas in vitro para la experimentación.Comience el enriquecimiento de monocitos mezclando 20 microlitros de células mononucleales de sangre periférica previamente preparadas, o suspensión de células PBMC con 20 microlitros de azul de tripán, para contar el número de células vivas utilizando un citómetro. A continuación, centrifuga la suspensión de la célula. Aspire el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el pellet celular a una concentración de 80 microlitros de tampón de tinción para 10 a la séptima celda.Agregue 20 microlitros de micro perlas CD-4 por cada 10 a la séptima celda. Mezclar bien e incubar las células durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Lave las células con un mililitro de tampón de tinción por cada 10 a la séptima célula y centrifugue las células.Aspire el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el pellet de celda. Obtenga una columna mediana por un máximo de dos veces 10 hasta la octava celda total, y coloque la columna en el campo magnético del separador. A continuación, enjuague la columna con 500 microlitros de tampón de tinción.Pipetee la suspensión celular en la columna y recoja las células sin etiquetar que pasan a través de la columna en un tubo de 15 mililitros. Reemplace un nuevo tubo de 15 mililitros debajo de la columna y lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón de tinción. Asegúrese de que el depósito de la columna esté vacío antes de agregar un nuevo tampón de tinción entre lavados.Retire la columna del separador y colóquela en un tubo nuevo de 15 mililitros. Pipetee un mililitro de tampón de tinción en la columna e inmediatamente enjuague las células marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna. A continuación, repita los pasos de separación magnética utilizando la fracción ilustrada en una nueva columna para aumentar la pureza de las células CD14 plus.Siembre cuatro juegos de CD14 más monocitos en una concentración de cero coma tres a cero coma cinco veces 10 al sexto por mililitro de medio de cultivo celular de IL-4 en placas de seis pocillos. Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados con cinco por ciento de CO2. En el cuarto día, retire 850 microlitros de medio del cultivo y centrifuga.Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en un mililitro de medio de cultivo celular. Vuelva a agregar la mezcla de células al cultivo. En el quinto día, agregue un microlitro de caldo de vitamina D3 y un microlitro de caldo de dexametazona por un litro de medio a dos de los conjuntos, para generar moDC tolerogénicos.En el sexto día, agregue 200 nanogramos por mililitro de GMCSF y 200 nanogramos por mililitro de IL-4 a todos los conjuntos. Agregue un microgramo por mililitro de LPS a uno de los conjuntos tratados solo con GMCSF e IL-4 para generar moDC maduros. Agregue un microgramo por mililitro de LPS a un conjunto de moDC tolerogénicos para generar MODC tolerogénicos de LPS.Finalmente, en el séptimo día, coseche los diferentes tipos de moDC enjuagando la placa de cultivo con PVS EDTA. Las moDCs inmaduras se generaron mediante la adición de GMCSF e IL-4 a CD-14 purificado más monocitos en los días cero, cuatro y seis. La adición de vitamina D3 y dexametazona después de la GMCF e IL-4 dio lugar a la diferenciación de las moDC inmaduras en moDC tolerogénicas.Se añadió LPS para inducir la maduración de los moDC inmaduros a los moDC maduros. Y los moDCs tolerogénicos fueron estimulados con LPS para verificar la resistencia a la maduración. Un análisis de los marcadores de superficie de DC reveló que los moDC maduros expresan los niveles más altos de marcadores de maduración HLA-DR, CD80, CD83 y CD86.Por el contrario, las moDC tolerogénicas mostraron una mayor expresión de CD14, BDCA3 y transcripciones similares a inmunoglobulinas en comparación con las moDC inmaduras y maduras. Utilizando CMXRos rojos para reflejar la actividad mitocondrial, se observó que los moDC tolerogénicos tenían una mayor actividad mitocondrial en comparación con los otros subtipos diferenciados de moDC. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran las características metabólicas de las células dendríticas para el desarrollo de vacunas e inmunoterapia.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el procedimiento para la diferenciación de células dendríticas mieloides de la médula ósea de ratón. El aislamiento de la tibia y el fémur de ratón, y el procesamiento de la médula ósea se demuestran. Imágenes que demuestran la morfología celular, antes y después de la diferenciación, y figuras que representan el fenotipo celular y la IL-12 después de la maduración de la producción con CpG se muestran.

Cultura de células dendríticas mieloides a partir de precursores de médula ósea

La presentación de antígenos en los órganos linfoides secundarios por las células dendríticas es fundamental para el inicio de la célula T mediada por la respuesta inmune adaptativa. Aquí se demuestra la cultura de la médula ósea procedentes de células dendríticas murinas, la activación, y el etiquetado de dos fotones de imágenes.

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Este video muestra la generación de células dendríticas inmaduras, maduras y tolerogénicas, o CD, a partir de monocitos humanos. La incubación de monocitos con factores de crecimiento y citocinas conduce a la producción de CD inmaduras. En respuesta a las moléculas inmunorreguladoras, las CD inmaduras se diferencian en CDs tolerogénicas y maduras.

Generación de células dendríticas inmaduras, maduras y tolerogénicas a partir de monocitos

Este video muestra un método de conversión de células dendríticas (CD) en CD tolerogénicas (TolDC) utilizando un agente farmacológico inmunomodulador. Esta conversión se confirma mediante la evaluación de la función de TolDC a través de su efecto inmunosupresor sobre las células T CD4+.

Efecto de un agente farmacológico inmunomodulador en la interacción entre células dendríticas y linfocitos T CD4+

El método más comúnmente utilizado para la generación de un gran número de células dendríticas autólogas (DC) para su uso en inmunoterapia tumoral se describe. El método utiliza la IL-4 y GM-CSF para diferenciar países en desarrollo a partir de monocitos. Las CD inmaduras son estimuladas para maduro y luego se cargan con antígenos antes de que se inyectan de nuevo en el paciente.

Preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia

Las células de médula ósea cultivadas con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) generan un cultivo heterogéneo que contiene macrófagos y células dendríticas (CD). Este método destaca el uso de la unión de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar los macrófagos de los DC en el cultivo de GM-CSF. Los macrófagos de este cultivo tienen muchas similitudes con los macrófagos alveolares.

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.

Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

Aquí proporcionamos un protocolo para el cribado de posibles factores de transcripción implicados en el desarrollo de células dendríticas (DC) mediante la transducción lentiviral de shRNA para obtener líneas celulares de derribo estables para la diferenciación in vitro de DC.

Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediados por ARN de horquilla corta en una línea de células madre y progenitoras hematopoyéticas in vitro

Se presenta un protocolo único y completo para generar células dendríticas derivadas de monocitos humanos desialiladas (mo-DC) a partir de células mononucleares aisladas de sangre periférica (PBMC) utilizando un tratamiento con siaridasa. Además, se describen métodos para evaluar la caracterización fenotípica y funcional de las mo-DC y evaluar cómo el tratamiento con sialidasa mejora el nivel de maduración de las mo-DC.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos con diferentes fenotipos sialilados

Describimos un procedimiento para evaluar la capacidad de los agentes farmacológicos para generar células dendríticas tolerogénicas a partir de células dendríticas derivadas de monocitos naïve in vitro y validar su potencia mediante la generación de células T reguladoras autólogas.

Un método simple y eficiente para probar agentes inmunomoduladores para la generación de células dendríticas tolerogénicas a partir de monocitos CD14+ humanos

Aprende a generar células dendríticas tolerogénicas y maduras a partir de monocitos mediante separación magnética y cultivo con citocinas. Este protocolo permite estudiar perfiles metabólicos y marcadores de maduración para investigación inmunológica y desarrollo de vacunas.

Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

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