Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

El objetivo general de este protocolo es generar células dendríticas tolerogénicas y maduras a partir de monocitos para la experimentación o el desarrollo de vacunas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología al proporcionar un modelo para estudiar el desarrollo, la maduración y la presentación de antígenos de las células dendríticas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la generación de un gran número de células dendríticas in vitro para la experimentación.

Comience el enriquecimiento de monocitos mezclando 20 microlitros de células mononucleales de sangre periférica previamente preparadas, o suspensión de células PBMC con 20 microlitros de azul de tripán, para contar el número de células vivas utilizando un citómetro. A continuación, centrifuga la suspensión de la célula. Aspire el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el pellet celular a una concentración de 80 microlitros de tampón de tinción para 10 a la séptima celda.

Agregue 20 microlitros de micro perlas CD-4 por cada 10 a la séptima celda. Mezclar bien e incubar las células durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Lave las células con un mililitro de tampón de tinción por cada 10 a la séptima célula y centrifugue las células.

Aspire el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el pellet de celda. Obtenga una columna mediana por un máximo de dos veces 10 hasta la octava celda total, y coloque la columna en el campo magnético del separador. A continuación, enjuague la columna con 500 microlitros de tampón de tinción.

Pipetee la suspensión celular en la columna y recoja las células sin etiquetar que pasan a través de la columna en un tubo de 15 mililitros. Reemplace un nuevo tubo de 15 mililitros debajo de la columna y lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón de tinción. Asegúrese de que el depósito de la columna esté vacío antes de agregar un nuevo tampón de tinción entre lavados.

Retire la columna del separador y colóquela en un tubo nuevo de 15 mililitros. Pipetee un mililitro de tampón de tinción en la columna e inmediatamente enjuague las células marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna. A continuación, repita los pasos de separación magnética utilizando la fracción ilustrada en una nueva columna para aumentar la pureza de las células CD14 plus.

Siembre cuatro juegos de CD14 más monocitos en una concentración de cero coma tres a cero coma cinco veces 10 al sexto por mililitro de medio de cultivo celular de IL-4 en placas de seis pocillos. Incubar las células en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados con cinco por ciento de CO2. En el cuarto día, retire 850 microlitros de medio del cultivo y centrifuga.

Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en un mililitro de medio de cultivo celular. Vuelva a agregar la mezcla de células al cultivo. En el quinto día, agregue un microlitro de caldo de vitamina D3 y un microlitro de caldo de dexametazona por un litro de medio a dos de los conjuntos, para generar moDC tolerogénicos.

En el sexto día, agregue 200 nanogramos por mililitro de GMCSF y 200 nanogramos por mililitro de IL-4 a todos los conjuntos. Agregue un microgramo por mililitro de LPS a uno de los conjuntos tratados solo con GMCSF e IL-4 para generar moDC maduros. Agregue un microgramo por mililitro de LPS a un conjunto de moDC tolerogénicos para generar MODC tolerogénicos de LPS.

Finalmente, en el séptimo día, coseche los diferentes tipos de moDC enjuagando la placa de cultivo con PVS EDTA. Las moDCs inmaduras se generaron mediante la adición de GMCSF e IL-4 a CD-14 purificado más monocitos en los días cero, cuatro y seis. La adición de vitamina D3 y dexametazona después de la GMCF e IL-4 dio lugar a la diferenciación de las moDC inmaduras en moDC tolerogénicas.

Se añadió LPS para inducir la maduración de los moDC inmaduros a los moDC maduros. Y los moDCs tolerogénicos fueron estimulados con LPS para verificar la resistencia a la maduración. Un análisis de los marcadores de superficie de DC reveló que los moDC maduros expresan los niveles más altos de marcadores de maduración HLA-DR, CD80, CD83 y CD86.

Por el contrario, las moDC tolerogénicas mostraron una mayor expresión de CD14, BDCA3 y transcripciones similares a inmunoglobulinas en comparación con las moDC inmaduras y maduras. Utilizando CMXRos rojos para reflejar la actividad mitocondrial, se observó que los moDC tolerogénicos tenían una mayor actividad mitocondrial en comparación con los otros subtipos diferenciados de moDC. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran las características metabólicas de las células dendríticas para el desarrollo de vacunas e inmunoterapia.