Name: Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a investigar la metilación del ADN en cohortes de pacientes usando MBDCap-seq. Este método computacional permite identificar biomarcadores epigenéticos de forma rentable para mejorar el diagnóstico y la terapia clínica.

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El trabajo es apoyado por CPRIT Investigación Formación Premio RP140105, así como parcialmente apoyado por los Institutos Nacionales de Estados Unidos de Salud (NIH) subvenciones R01 GM114142 y por William Owens &amp; Ella Fundación de Investigación Médica.

Todos los tejidos se obtienen después de la aprobación del Comité de Revisión Institucional y cuando todos los participantes dieron su consentimiento para ambos análisis moleculares y estudios de seguimiento. Los protocolos son aprobados por el Comité de Estudios Humanos de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio. 1. unión Metil-de captura de ADN (MBDCap) <ol><li> Recogida de muestras y el aislamiento de ADN <ol><li> Recoger tumor mayor o muestras de tejido normal a partir de muestras de tejido embebidas en parafina de pacientes. </li><li> Utilice un kit comercial de mini ADN para aislar el ADN genómico de las muestras de tejido embebidas en parafina de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Utilice un kit de enriquecimiento de ADN metilado con el procedimiento descrito aquí de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol></li><li> Lavado del grano inicial Nota: Las perlas se utilizan para acoplar con proteínas MBD-biotina, que detecta la metilación del ADN en el genoma. Las cuentas se suspenden generalmenteen una solución de reserva. Utilice estos pasos para lavar este líquido. <ol><li> Volver a suspender las acciones de perlas de estreptavidina (Ver Tabla de Materiales) pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión homogénea. No mezclar los granos con el vórtex. </li><li> Por un g de ADN de entrada, ADD10 l de perlas a un tubo con 90 l de 1x bind / tampón de lavado. Rotar durante 1 min. No mezclar mediante agitación. </li><li> Se coloca el tubo (s) sobre una rejilla magnética durante 1 min. </li><li> Retire el líquido con una pipeta y descartar el líquido. </li><li> Añadir 250 l de 1x bind / tampón de lavado hasta el talón y girar durante 1 min. </li><li> Repita los pasos 1.2.3 - 1.2.5 dos veces. </li></ol></li><li> El acoplamiento de la proteína MBD-biotina a las perlas <ol><li> Para 1,2 g de ADN de entrada, añadir 7 l (3,5 g) de la proteína MBD-biotina a cada tubo. </li><li> Añadir 93 l de 1x bind / tampón de lavado a la proteína para hacer un volumen final de 100 mL. </li><li> Mezclar el grano-proteínamezcla en un mezclador giratorio a temperatura ambiente durante 1 h. </li></ol></li><li> La fragmentación de ADN (de entrada) <ol><li> Someter a ultrasonidos ADN mediante la adición de 1,2 g de ADN genómico total en 96 l de tampón TE y 24 l de 5x tampón / lavado de enlace para hacer una solución de 120 mL. Utilice 30 s de potencia ON y OFF 30 s de energía durante la sonicación, 20 - 25 veces. </li><li> Ejecutar 1 l de solución de ADN se sometió a ultrasonidos utilizando un sistema Bioanalyzer con un kit de ADN de alta sensibilidad comercial para comprobar el tamaño de los fragmentos a estar en el rango de 150 a 350 pb de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol></li><li> Se lavan las MBD-cuentas <ol><li> Se coloca el tubo que contiene MBD-cuentas sobre una rejilla magnética durante 1 min. </li><li> Retire y deseche el líquido con una pipeta sin tocar las bolas. </li><li> Volver a suspender las perlas con 250 l de 1x bind / tampón de lavado. </li><li> Mezclar las perlas en un mezclador giratorio a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Repita los pasos 1.5.1 - 1.5.4 dos veces. </li&gt; </ol></li><li> La reacción de captura de ADN fragmentado (1 g de ADN de entrada) <ol><li> Transferir la mezcla de ADN / Buffer al tubo que contiene los MBD-perlas. </li><li> Mezclar los MBD-perlas con el ADN en un mezclador giratorio durante 1 h a TA. Alternativamente, la mezcla de O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Extracción de ADN no capturado de las perlas <ol><li> Después de mezclar el ADN y MBD-perlas, colocar el tubo en la gradilla magnética durante 1 minuto para concentran todas las perlas en la pared interior del tubo. </li><li> Eliminar el líquido sobrenadante con una pipeta y guardarlo en un tubo de microcentrífuga libre de DNasa limpio como el ADN no metilado. Guarde esta muestra en hielo. </li><li> Añadir 200 l de 1x bind / tampón de lavado a las perlas para lavar los granos. </li><li> Mezclar las perlas en un mezclador giratorio para 3 min. </li><li> Se coloca el tubo en la gradilla magnética durante 1 min. </li><li> Retire el líquido con una pipeta y guardarlo en un tubo de microcentrífuga. </li><li> para la tapatura reacciones de ≤1 g de ADN de entrada, repita los pasos 1.7.3 - 1.7.6 para 2 más fracciones de lavado en total. </li></ol></li><li> Elución sola fracción <ol><li> Mezclar tampón bajo en sal con tampón de alta salinidad (1: 1) para obtener tampón de elución (NaCl 1,000 mM). </li><li> Resuspender las perlas en 200 l de tampón de elución (NaCl 1,000 mM). </li><li> Se incuban las cuentas de un mezclador rotativo durante 3 min. </li><li> Se coloca el tubo en la gradilla magnética durante 1 min. </li><li> Con el tubo en su lugar en la rejilla magnética, eliminar el líquido con una pipeta sin tocar las bolas con la punta de la pipeta, y guardarlo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml libre de DNasa limpia. Guarde esta muestra en hielo. </li><li> Repetir los pasos 1.8.1 - 1.8.4 una vez, la recogida de la segunda muestra en el mismo tubo (volumen total será de 400 l). Almacenar la muestra agrupada en hielo. </li></ol></li><li> Precipitación con etanol (limpieza ADN) <ol><li> Para cada uno, de lavado y elución fr fracción noncapturedom los pasos anteriores, añadir 1 l de glucógeno (20 mg / l, incluido en el kit), el volumen de un décimo de la muestra de acetato de sodio 3M, pH 5,2 (por ejemplo, 40 l por 400 l de muestra) y 2 volúmenes de muestra de 100% etanol (por ejemplo, 800 l por 400 l de muestra). El volumen total es de 1.241 l. </li><li> Mezclar bien e incubar a -80 ° C durante al menos 2 h. </li><li> Centrifugar el tubo durante 15 min a 11.363 xg a 4 ° C. </li><li> deseche con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento. </li><li> Añadir 500 l de etanol frío al 70%. </li><li> Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 11.363 xga 4 ° C </li><li> deseche con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento. </li><li> Repita los pasos 1.9.6 - 1.9.7 vez y eliminar cualquier sobrenadante residual que queda. </li><li> El aire seco de la pastilla de ~ 5 min. No seque completamente el sedimento. </li><li> Resuspender el sedimento de ADN en 37,5 l de agua libre de ADNasa u otrovolumen apropiado de tampón. </li><li> Coloque el ADN en hielo o almacenar el ADN a -20 ° C o por debajo hasta su uso posterior. </li><li> Compruebe que la cantidad total de ADN es más de 20 ng, (por ejemplo, utilizar el sistema de cuantificación fluorométrica, ver Tabla de Materiales). </li></ol></li></ol> 2. Secuenciación <ol><li> Usa los fragmentos de ADN recuperados del procedimiento MBDCap para la secuenciación. Para cada muestra que se secuenció, una cantidad total de 20 - Se requiere 40 ng de ADN para la preparación de la biblioteca. </li><li> Para la preparación de la biblioteca de ADN-seq utilizar un sistema de construcción de la biblioteca totalmente automatizado (Ver Tabla de Materiales) y seguir el protocolo estándar suministrado por el fabricante. Seleccione fragmentos de ADN de tamaño 200 a 400 pb para la preparación de la biblioteca. El sistema de preparación de la biblioteca de automatización permite estandarizar el procedimiento de preparación de la biblioteca y minimizar la variación entre las muestras debido a la preparación manual. </li><li> primer uso del adaptadorRS y diluir a la concentración de 100x. Por ello, utilice 10 l para cada muestra. </li><li> Después de la etapa 2.2, llevará a cabo la reacción, y cuantificar la biblioteca de ADN-ss usando un sistema de cuantificación fluorométrico (Ver Tabla de Materiales). <ol><li> Establecer procedimiento de amplificación por PCR. La elección de la mezcla de PCR principal es mejorar la eficiencia de la PCR de GC enriquecido región del genoma. En un tubo de PCR, añadir 15 l de la biblioteca de ADN-ss, 25 l de PCR Master Mix (Ver Tabla de Materiales), 2 l de PCR mezcla de cebadores (Ver Tabla de Materiales), y 8 l de H2O </li></ol></li><li> Seguir las recomendaciones PCR del fabricante de la mezcla maestra de PCR, la alteración de los tiempos de ciclo y temperaturas para diferentes materiales de partida: 98 ° C durante 45 s, los ciclos X de 98 ° C durante 15 s, 65 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s, y luego 72 ° C durante 1 min. Mantener a 4 ° C <ol><li> perfORM suficientes ciclos para terminar con un 2 - 10 nM de ADN de la librería (8 - 10 ciclos). </li></ol></li><li> Limpiar reacción de PCR con 1: relación de perlas de purificación de PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante 1 (Ver Tabla de Materiales). </li><li> Eluir con 20 - tampón de elución 30 l. </li><li> Código de barras de cada muestra y piscina 4 muestras juntas en un carril de una celda de flujo. Utilizar el protocolo estándar de 50 pb lectura única para la secuenciación (Ver Tabla de Materiales). </li></ol> 3. Análisis de Bioinformática Nota: Además de procesar los archivos FASTQ primas obtenidas de la secuenciación para llevar a cabo el control de calidad y el mapeo de las secuencias cortas de ADN (lee) en el genoma. <ol><li> El uso de Bowtie alineador de lectura corta, herramienta de mapeo del genoma en un archivo de muestra FASTQ para mapear las lecturas al genoma de referencia. Muchas herramientas de mapeo de lectura están disponibles para llevar a cabo este paso y se pueden utilizar en base a las preferencias individuales. <ol><li> Permitir hasta 2 desajustes en el whole lee, mientras que la cartografía al genoma de referencia. Reportar hasta 20 mejores alineaciones para cada lectura. Por ejemplo, utilizar pajarita -v -k 2 --el 20 --chunkmbs 200 &lt;EBWT&gt; &lt;fastqFile&gt; &lt;alignFile&gt;. </li></ol></li><li> Utilice LONUT 9 para recuperar el mapeado multiplican lee para mejorar la detección de las regiones enriquecidas. Para cada lectura, a lo sumo una alineación se recuperaría cuando está lo suficientemente cerca de cualquiera de los anteriormente llamados picos. Por ejemplo, utilice: Perl lonut.pl -g hg19 -w -p 250 99 &lt;alignFile&gt; &lt;OutputPath&gt;. LONUT llevará a cabo los siguientes pasos. <ol><li> alineaciones divididos en un asignan únicamente lee y se multiplican asignan lee. Pico de llamada asignada de forma única en la persona que llama se lee usando pico CORREA 11. La opción -w -p 250 y 99 en el comando de ejemplo son para el cinturón. </li><li> Combinar asignada de forma única lee con el recuperado lee obtenido de LONUT, y el combinado lee, en formato BED, se utilizará en el análisis adicional. Calcular el número de Combined lee para la futura normalización. </li></ol></li><li> Bin la lee. Extracto lee en la región de interés mediante secuencias de comandos Perl: Perl methyPipeline.pl &lt;sampleInfoFile&gt; &lt;refGeneFile&gt; -up &lt;longitud que se extiende aguas arriba&gt; dn &lt;longitud que se extiende aguas abajo&gt;. Para cada archivo que aparece en la cama sampleInfoFile, el script de perl realiza las tareas siguientes. Nota: Consulte el archivo de codificación complementaria para el script Perl. <ol><li> Bin lee en el tamaño de ubicación fija, por ejemplo, de 100 pb, de 24 cromosomas. </li><li> Para cada gen se especifica en refGeneFile, extraer los contenedores alrededor del sitio de inicio de transcripción (TSS), hasta la longitud que se extiende especificado por la opción -up y -dn. Por ejemplo, extraer los datos de la región que está arriba y aguas abajo de 4 kb de TSS. En bin tamaño de 100 pb, este extrajeron los datos tienen 81 contenedores, y el cubo central corresponde a la SAT. </li><li> Para el gen de la cadena antisentido, voltear la región extraída de izquierda a derecha de manera que los contenedores de aguas arriba son siempre placed a la izquierda con el script de perl. </li><li> Además dividir la región de ± 4 kb TSS en tres subregiones: A la izquierda, aguas arriba a aguas arriba de 4 kb 2 kb; Medio, aguas arriba y abajo de 2 kb; Derecha, aguas abajo de 2 kb a 4 kb. </li><li> Para cada muestra, se divide el recuento de lecturas en cada intervalo por el número total de lecturas combinadas asignada calculada en 3.3.3. La normalización eliminará la muestra específica leer las diferencias y permite comparar la lee a través de diferentes muestras. </li></ol></li><li> Ejecutar el script bash (como se indica en el archivo de script) para realizar la prueba estadística de la normalizado lecturas obtenida de la región a la izquierda, para detectar la metilación diferencial entre el grupo normal y ocurre en las regiones descritas como en la región del flanco. Nota: Consulte el archivo de codificación adicional para la escritura del golpe. Sobre la base de las regiones que están metilados diferencialmente, hay siete combinaciones: Toda la región: la metilación diferencial en toda la región de ± 4 kb TSS middlmetilación diferencial tanto en la región centro y la izquierda: eLeft metilación diferencial tanto en la región central y derecho: MiddleRight metilación diferencial tanto en la región a la izquierda y la derecha: el flanco A la izquierda: la metilación diferencial en la región izquierda solamente metilación diferencial en la región de la derecha solamente: Derecho metilación diferencial en la región media solamente: Medio </li><li> Utilice la misma escritura del golpe para visualizar la metilación diferencial en una parcela tornado. Representar gráficamente los hiper e hipo genes metilados en un panel separado, y ordenarlos en el orden de la combinación de regiones como se describe en el apartado 3.4, respectivamente. </li></ol>

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</ol>

Este protocolo se desarrolló en los laboratorios del Dr. Tim Huang y el Dr. Victor Jin de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio.

La técnica MBDCap-seq es un enfoque de enriquecimiento de afinidad 3, considerado como una alternativa rentable al investigar cohortes con un gran número de pacientes 15. El oleoducto que aquí se presenta describe un enfoque integral, desde la adquisición de la muestra para el análisis y la interpretación de los datos. Uno de los pasos más importantes es la creación de un procedimiento de amplificación por PCR para mejorar la eficiencia de la PCR de las regiones GC enriquecido en el genoma ya que es donde se produce la...

Regulación epigenética de genes a través de la metilación del ADN es uno de los mecanismos esenciales requeridos para determinar el destino de la célula por la diferenciación estable de diferentes tipos de tejidos en el cuerpo 1. La desregulación de este proceso ha sido conocido por causar varias enfermedades incluyendo el cáncer 2. Este proceso implica principalmente la adición de grupos metilo en el residuo de citosina en los dinucleótidos CpG de ADN 3. Hay algunas técnicas diferentes que actualmente se utilizan para investigar este mecanismo, cada uno con sus propias ventajas tal como se describe en muchos estudios 2-8. Aquí vamos a discutir una de estas técnicas llamadas Metil-Binding secuenciación de ADN de captura (MBDCap-ss), donde utilizamos una técnica de enriquecimiento de afinidad para identificar regiones del ADN metilado. Esta técnica se basa en la capacidad de unión metil-de la proteína MBD2 para enriquecer los fragmentos de ADN genómicos que contienen sitios CpG metilados. Utilizamos un kit de enriquecimiento de ADN metilado comercialpara el aislamiento de estas regiones metiladas. Nuestro laboratorio ha proyectado cientos de muestras de pacientes utilizando esta técnica y aquí proporcionar un protocolo optimizado integral, que se puede utilizar para investigar grandes cohortes de pacientes. Como es evidente con cualquier tecnología de secuenciación de nueva generación, MBDCap-seq también requiere un enfoque de la bioinformática específicos con el fin de cuantificar con precisión los niveles de metilación a través de las muestras. Ha habido muchos estudios recientes, en un esfuerzo para optimizar el proceso de normalización y el análisis de los datos de secuenciación de 9, 10. En este protocolo, se demuestra uno de estos métodos de aplicación de un enfoque de recuperación de lectura única - LONUT - seguido de la normalización lineal de cada muestra con el fin de permitir las comparaciones imparciales través de gran número de muestras de pacientes.

<table><tbody><tr><td>Kit de enriquecimiento de ADN Methylminer</td><td>Invitrogen ME10025</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>112-05D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Plus Dispositivo de sonicación</td><td>diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>3 M acetato de sodio, pH 5.2</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>SPRIworks Fragment Library System I</td><td>Beckman Coulter</td><td>A50100</td><td>Sistema de construcción de bibliotecas totalmente automatizado</td></tr><tr><td>Adaptador Primers</td><td>Bioo Scientific</td><td>514104</td><td>PCR mezcla de cebadores</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Sistema de cuantificación fluorométrica</td></tr><tr><td>Mezcla maestra de PCR</td><td>KAPA scientific</td><td>KK2621</td><td>Mezcla maestra de PCR</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>PCR Perlas de purificación</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de secuenciación HiSeq 2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

secuenciación de captura de adn de unión a metil-para tejidos del paciente

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

La metilación es una de las modificaciones epigenéticas esenciales en el ADN, que es responsable de la regulación precisa de los genes necesarios para el desarrollo estable y la diferenciación de diferentes tipos de tejidos. La desregulación de este proceso es a menudo el sello de diversas enfermedades como el cáncer. Aquí, se describe una de las técnicas de secuenciación recientes, Metil-Binding secuenciación de captura de ADN (MBDCap-seq), que se utiliza para cuantificar la metilación en diversos tejidos normales y de enfermedad para grandes cohortes de pacientes. Se describe un protocolo detallado de este enfoque enriquecimiento por afinidad junto con una tubería de bioinformática para lograr la cuantificación óptima. Esta técnica se ha utilizado para secuenciar cientos de pacientes a través de diversos tipos de cáncer como parte de la metiloma proyecto 1000 (Sistema de metiloma Cáncer).

Hemos utilizado MBDCap-seq para estudiar alteraciones de metilación del ADN en un gran número de pacientes de diversos tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama 12, endometrial 13, de la próstata 14, y los cánceres de hígado, entre otros. Aquí se demuestra alguna información del cáncer de mama estudio publicado recientemente 12. En este caso, se utilizó todo el enfoque de secuenciación del genoma para identificar las islas CpG que están metilados diferencialmente en el tumor con respecto a la norm...

Aquí se presenta un protocolo para investigar la metilación del ADN del genoma de ancho en estudios de cribado de pacientes clínicos a gran escala utilizando la secuenciación Metil-unión de captura de ADN (SEC-MBDCap o MBD-ss) la tecnología y el análisis de tuberías bioinformática posteriores.

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

El objetivo general de esta técnica es investigar sistemáticamente el paisaje de metilación del ADN a nivel del genoma completo en grandes cohortes de pacientes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, especialmente en relación con las regiones del paisaje de metilación del ADN que se desregulan en los pacientes. La principal ventaja de esta técnica es que se puede analizar un gran número de pacientes de manera rentable.Esta tecnología puede tener implicaciones positivas en la terapia y el diagnóstico del paciente porque podemos investigar biomarcadores existentes y también identificar nuevos biomarcadores. Aunque este método puede proporcionar información sobre un grupo de pacientes, también puede aplicarse a otros sistemas, como la metilación del ADN en células derivadas de líneas celulares cultivadas a partir de muestras de ratón. Junto con el Dr. Ya-Ting Hsu, esta prueba será demostrada por el Sr. Joseph Liu, un técnico en nuestro laboratorio.La parte de secuenciación será demostrada por la Sra. Dawn Garcia, quien es técnica en nuestro laboratorio central de secuenciación. Después de aislar el ADN genómico de tejido tumoral o normal s

methyl-binding-dna-capture-sequencing-for-patient-tissues

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este video muestra el protocolo para la inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP). MeDIP es un procedimiento de dos días que selectivamente extrae fragmentos de ADN metilado de una muestra de ADN genómico utilizando anticuerpos con especificidad para el 5-metilcitosina (anti-5 MC).

Inmunoprecipitación de ADN metilado

El estándar de oro para el análisis de metilación del ADN es la secuencia del genoma de ADN de bisulfito de convertir. Este método tiene la ventaja de la mayor sensibilidad de la citosina en comparación con el 5-metilcitosina (5-MEC) de bisulfito de desaminación en condiciones ácidas. Citosinas no metiladas se puede distinguir de citosinas metiladas después de la amplificación por PCR del DNA genómico de destino.

La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

Un flujo de trabajo simplificado para estudiar la metilación del ADN y los cambios de expresión génica a principios del estrés de la vida se muestra. A partir de la separación materna de los ratones recién nacidos y el aislamiento de los tejidos cerebrales discretas, que representan un protocolo para aislar al mismo tiempo el ADN y el ARN de golpes de tejido cerebral para la secuenciación de bisulfito y posterior análisis de RT-PCR.

Análisis Optimizado de la metilación del ADN y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro

Se describe un proceso de etiquetado en dos etapas utilizando β-glucosiltransferasa (β-GT) para transferir una azida-glucosa al 5-HMC, seguido de química para transferir un enlazador de biotina para el enriquecimiento fácil y densidad independiente. Este método de marcaje eficaz y específico permite el enriquecimiento de 5-HMC con fondo extremadamente bajo y de alto rendimiento de mapeo epigenómico a través de secuenciación de próxima generación.

Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

Este video muestra el procedimiento de modificación del ADN genómico con bisulfito a partir de muestras de cáncer gastrointestinal. La técnica es beneficiosa para investigar la relación entre los patrones de metilación de los genes y establecer su contribución a la carcinogénesis.

Conversión de bisulfito del ADN genómico: un método para estudiar la metilación del ADN en muestras de ADN genómico de tejido de cáncer gastrointestinal

Secuenciación de bisulfito de representación reducida mejorada es un método para la preparación de bibliotecas de secuenciación para el análisis de metilación del ADN basado en la digestión de enzimas de restricción combinada con la conversión de bisulfito de citosina. Este protocolo requiere 50 ng de material de partida y produce datos de resolución de pares de bases en regiones genómicas ricas en GC.

Enhanced reducido Representación bisulfito secuenciación para la Evaluación de la metilación del ADN en la Resolución Base Par

La secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS) es un método para cuantificar la metilación de citosina en regiones genómicas específicas de interés. Este método utiliza la conversión de bisulfito emparejada con la amplificación por PCR de las regiones objetivo antes de la secuenciación de próxima generación para producir una cuantificación absoluta de la metilación del ADN a un nivel específico de base.

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

Este trabajo describe un optimizado metil-CpG vinculante dominio de secuenciación de protocolo y una tubería computacional para identificar diferencial metilado CpG-ricos en regiones crónicas linfocítica leucemia (CLL) pacientes.

Análisis de metilación de ADN completo usando un método de captura de dominio de unión a metil-CpG en pacientes con leucemia linfocítica crónica

Aquí, describimos un procedimiento para el análisis del genoma de la metilación del ADN en cánceres gastrointestinales. El procedimiento es relevante para los estudios que investigan las relaciones entre los patrones de metilación de los genes y los factores que contribuyen a la carcinogénesis en los cánceres gastrointestinales.

Análisis del genoma en general de la metilación del ADN en el cáncer gastrointestinal

El presente estudio describe el flujo de trabajo para gestionar los datos de metilación del ADN obtenidos por las tecnologías de microarrays. El protocolo muestra pasos desde la preparación de la muestra hasta el análisis de datos. Todos los procedimientos se describen en detalle, y el video muestra los pasos significativos.

Preparación de muestras para el análisis bioinformático de la metilación del ADN: estrategia de asociación para la obesidad y estudios de rasgos relacionados

Aquí, presentamos un protocolo para la selección in vitro de represores transcripcionales (ETR) diseñados con una alta eficiencia de silenciamiento estable, estable y a largo plazo y una baja actividad fuera del objetivo en todo el genoma. Este flujo de trabajo permite reducir un repertorio inicial y complejo de ETR candidatos a una lista corta, adecuada para una evaluación posterior en entornos terapéuticamente relevantes.

In vitro Selección de represores transcripcionales diseñados para el silenciamiento epigenético dirigido

Aprende a investigar la metilación del ADN en cohortes de pacientes usando MBDCap-seq. Este método computacional permite identificar biomarcadores epigenéticos de forma rentable para mejorar el diagnóstico y la terapia clínica.

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

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