Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

El objetivo general de esta técnica es investigar sistemáticamente el panorama de metilación del ADN en todo el genoma en grandes cohortes de pacientes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo epigenético, especialmente con respecto a qué regiones en el panorama de la metilación del ADN se desregulan en los pacientes. La principal ventaja de esta técnica es que un gran número de pacientes pueden ser investigados de una manera rentable.

Esta tecnología puede tener implicaciones positivas en la terapia y el diagnóstico del paciente, ya que podemos investigar los biomarcadores existentes y también identificar nuevos biomarcadores. Aunque este método puede proporcionar información sobre la cohorte de pacientes, también se puede aplicar a otros sistemas, como la metilación del ADN en células derivadas de líneas celulares cultivadas a partir de muestras derivadas de ratones. Demostrando este procedimiento junto con el Dr. Ya-Ting Hsu estará el Sr. Joseph Liu, un técnico de nuestro laboratorio.

La parte de secuenciación será demostrada por la Sra. Dawn García, quien es técnica en nuestro núcleo de secuenciación. Después de aislar el ADN genómico del tumor o del tejido normal de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 1,2 microgramos de ADN genómico total a 96 microlitros de tampón TE y 24 microlitros de tampón de lavado de unión 5X para hacer una solución de 120 microlitros. Sonicar la solución de ADN durante 30 segundos, luego dejarla reposar durante 30 segundos.

Repita la sonicación un total de 20 a 25 veces. Utilice un sistema de bioanalizador con un kit comercial de ADN de alta sensibilidad de acuerdo con el protocolo del fabricante para ejecutar un microlitro de solución de ADN sonicado para comprobar el tamaño de los fragmentos. Deben estar en el rango de 150 a 350 pares de bases.

Para llevar a cabo la elución de una sola fracción, prepare el tampón de elución haciendo una solución uno a uno de tampón con bajo contenido de sal y tampón con alto contenido de sal. Utilice 200 microlitros del tampón de elución para resuspender el ADN de unión al metilo o las perlas de MBD e incubar la suspensión en un mezclador giratorio durante tres minutos. Después de la incubación, coloque el tubo en la rejilla magnética durante un minuto, luego pipetee con cuidado el líquido sin tocar la punta de la pipeta en las perlas y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga limpio y sin DNasa de 1,5 mililitros.

Guarde esta muestra en hielo. Repita la elución para la segunda muestra y recójala en el mismo tubo que la primera muestra. A cada fracción de lavado y dilución no capturada, agregue un microlitro de glucógeno, una décima parte del volumen de tres molares de acetato de sodio, pH 5.2 y dos volúmenes de muestra de etanol al 100%.

Después de mezclar bien la solución, incubar a menos 80 grados centígrados durante al menos dos horas. A continuación, centrifugar la reacción a 11,363 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet y agregue 500 microlitros de etanol frío al 70%.

Vuelva a girar el tubo antes de repetir el lavado con etanol. Seque el pellet al aire durante cinco minutos. A continuación, utilice agua sin DNasa o tampón para volver a suspenderlo.

Verifique que la cantidad total de ADN sea superior a 20 nanogramos de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, coloque el ADN en hielo o guárdelo a 20 grados centígrados bajo cero hasta su uso posterior. Para la preparación de bibliotecas de secuenciación de ADN, utilice un sistema de construcción de bibliotecas totalmente automatizado y siga el protocolo estándar proporcionado por el fabricante.

Seleccione fragmentos de ADN de 200 a 400 pares de bases de longitud para la preparación de la biblioteca. Después de preparar la biblioteca de secuenciación de ADN, elimine la reacción y utilice un sistema de cuantificación fluorométrica para cuantificar la biblioteca de secuenciación de ADN. Para configurar una reacción de amplificación de PCR, en un tubo de PCR agregue 15 microlitros de biblioteca de secuenciación de ADN, 25 microlitros de mezcla maestra de PCR, dos microlitros de mezcla de cebadores de PCR y ocho microlitros de agua.

Utilice el programa descrito en el protocolo de texto, haciendo los ajustes necesarios en función de las recomendaciones del fabricante de la mezcla de PCR. Lleva a cabo suficientes ciclos para producir de dos a 10 milimolares de ADN de biblioteca. Después de limpiar las reacciones de PCR, marque el código de barras de cada muestra y junte cuatro muestras en un carril de una celda de flujo.

Utilice el protocolo estándar de lectura única de 50 pares de bases de nuestra secuenciación. Realizar bioinformática según el protocolo de texto. El uso de MBD cap busca identificar islas CpG en diferentes regiones genómicas que se metilan diferencialmente en el tumor con respecto al tejido normal, este estudio reveló que del total de islas CpG ubicadas en los promotores de genes, el 19,5% mostró metilación diferencial en los tumores en comparación con lo normal.

Del mismo modo, el 55,2% de las islas CpG intragénicas investigadas mostraron metilación diferencial. Los promotores intragénicos mostraron un 28,1% y para los promotores de genes sin islas CpG, un 1,8% mostraron metilación diferencial. Este mapa de calor muestra claramente regiones metiladas diferencialmente en 77 tumores de mama, 10 tejidos normales de mama y 38 líneas celulares de cáncer de mama.

En esta figura, la metilación se cuantifica en dos subgrupos de cáncer de endometrio, no recurrente vs. recurrente, en dos pacientes en diferentes sitios CpG en la isla promotora CpG del gen diana identificado SFRP1. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro o cinco días si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que primero debe probar la calidad del ADN genómico que se está analizando. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales como la pirosecuenciación para responder a preguntas como, ¿cuáles son las CpG exactas en las regiones identificadas diferencialmente enriquecidas que han sido alteradas? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética exploraran la metilación del ADN en grandes cohortes de pacientes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar la metilación del ADN en todo el genoma en muestras de pacientes utilizando la técnica de secuenciación de capuchones MBD. Tenga esto en cuenta, a veces puede ser difícil detectar la alta calidad del ADN de muestras de FFP y ADN, por lo que siempre se realiza una evaluación adecuada del ADN genómico cuando realizamos el procedimiento.