FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

El objetivo general de este método experimental es permitir el estudio en tiempo real de la señalización intracelular mediante imágenes de FRET de células embebidas en hidrogeles tridimensionales que imitan los tejidos naturales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, la farmacología y la medicina regenerativa, como el desarrollo de biomateriales óptimos y la selección de fármacos de alto rendimiento en microtejidos tridimensionales diseñados. La principal ventaja de esta técnica es que el FRET puede utilizarse en un gran número de células en numerosos tipos de hidrogeles empleando sistemas convencionales de microscopía de campo amplio.

Después de fabricar moldes para la colada de hidrogeles y suspender las células cultivadas en solución de hidrogel, según el protocolo descrito, en una cabina de cultivo de tejidos, agregue el precursor que contiene células a los moldes de colada utilizando técnicas estériles. Antes de la reticulación, centrifugue las células suspendidas en el precursor de hidrogel para optimizar la imagen, confinando las células a un único plano focal y minimizando la señal fuera de este plano. A continuación, para reticular los hidrogeles de PC, utilice una fuente de luz UVA durante un tiempo de exposición equivalente a 3,2 julios por centímetro cuadrado por milímetro de espesor, para irradiar el precursor que contiene células.

Alternativamente, utilice una lámpara dental manual menos costosa. Evite la sobreexposición del hidrogel, ya que esto disminuirá la viabilidad celular. Los hidrogeles que se reticulan físicamente se colocan a 37 grados Celsius.

Después de la reticulación, retire el molde de colada de hidrogel de PDMS y reemplácelo por el recipiente de PDMS previamente preparado. Utilice una espátula estéril para presionar el PDMS sobre el vidrio y adherirlo. Añada un medio sin suero libre de fenol o un medio químicamente definido al pocillo creado en el recipiente de PDMS con una cubreobjetos para mantener el hidrogel sumergido.

Incubar la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Una vez que la placa de PDMS con el hidrogel haya sido fijada en la platina del microscopio y se haya aplicado aceite en el objetivo, utilice luz transmitida para localizar al menos 15 células para la adquisición de imágenes y verifique la transfección mediante imágenes de fluorescencia. En el software del microscopio, configure los ajustes de la cámara para los canales de imagen FRET seleccionando algunas células cercanas al centro del campo de visión, y optimice el tiempo de exposición y la ganancia para cada canal de imagen según el protocolo descrito en el texto.

Seleccione células que estén cerca del centro del hidrogel, dentro del campo de iluminación relativamente plano, que no sean ni demasiado brillantes ni demasiado tenues, y que tengan una relación FRET entre 0,0 y 1,0. Luego, seleccione múltiples campos de visión para adquirir imágenes de al menos 15 células transfectadas. Apague la luz al finalizar para limitar la exposición.

Para configurar la frecuencia de captura para la adquisición de imágenes con lapse de tiempo, ingrese la periodicidad de las capturas. Utilice una frecuencia rápida para la captura de la señal basal, por ejemplo, cada cinco segundos por campo de visión, y una frecuencia más lenta para la cinética de señalización a largo plazo posterior. Seleccione Ejecutar ahora para iniciar la adquisición de imágenes y capturar imágenes durante cinco minutos con el fin de establecer una línea de referencia para la respuesta de la sonda en el campo de visión designado.

Después de los cinco minutos de adquisición de imágenes, agregue con pipeta el agonista o antagonista deseado, mezcle mediante pipeteo y continúe con la adquisición de imágenes. Después de realizar la calibración de FRET según el protocolo descrito en el texto, en el software del microscopio seleccione la flecha en el icono de la región de interés de fondo y elija Dibujar región elíptica de interés para el fondo. Dibuje y designe una región de interés, o ROI, por campo de visión cerca de las células para definir el nivel de fondo.

Asegúrese de que esté seleccionada la opción Mantener actualización del desplazamiento de fondo, luego active la visualización de la región de interés del fondo haciendo clic en el icono Región de interés del fondo. Alternativamente, seleccione el icono de región de interés y configure las propiedades de la región de interés como Usar como región de interés de fondo, y Las regiones de interés son diferentes en cada punto múltiple. Mediante el icono de fondo de región de interés, seleccione Restar fondo utilizando la región de interés.

En la ventana emergente, bajo Restar región de interés de fondo, seleccione Cada imagen y bajo Aplicar a, seleccione Todos los fotogramas. Para cada campo de visión, para definir una región de interés alrededor de la célula utilizando el canal de emisión del aceptor y una máscara binaria, use el menú Binario, Definir umbral y seleccione Aplicar al fotograma actual. Luego, ajuste el umbral inferior para seleccionar las células.

A continuación, utilice la función Binaria Cerrar para rellenar los huecos en la máscara binaria, si es necesario. Luego, utilice el icono de Región de Interés para seleccionar Copiar Binaria a Región de Interés y guardar la máscara binaria como regiones de interés. Añada las regiones de interés de los campos de visión posteriores al grupo existente de regiones de interés.

Elimine cualquier región de interés espuria. A continuación, haga clic con el botón derecho en las regiones de interés y verifique que sus propiedades sean Usar como región de interés estándar y que las regiones de interés sean diferentes en cada punto múltiple. Las regiones de interés celulares pueden dibujarse manualmente, pero debe tenerse cuidado en eliminar los valores espurios.

El protocolo contiene procedimientos para células que se encuentran fuera del campo de iluminación plano y para microscopios que no tienen un campo plano. La centrifugación de los precursores del hidrogel antes de la gelificación maximizó el número de células en un plano focal cercano al cubreobjetos. Esto minimizó el ruido de fondo y aumentó el rendimiento del análisis de imágenes.

En este experimento de FRET, para el cálculo de la relación FRET de emisión apagada, o QE, solo se requirieron dos imágenes para la sonda ICUE1 binaria de cadena única, incluyendo QE igual a CFP CFP para excitación y emisión, y emisión del aceptor igual a YFP YFP para excitación y emisión. Se seleccionaron múltiples campos de visión en los que varias células se encontraban dentro del área de iluminación homogénea, como se muestra aquí. Las ROI para la corrección de fondo de las señales de canal y para el análisis celular se designaron utilizando imágenes de emisión del aceptor umbralizadas desde el inicio de los experimentos.

Además, como se muestra aquí, se seleccionaron las células que expresaron sonda suficiente. Se calcularon las relaciones de FRET por píxel mediante QE y emisión sensibilizada, así como la relación promedio de FRET por célula. Se calculó la inversa de la relación de emisión sensibilizada y ambas relaciones se normalizaron.

Bajo la estimulación con forskolina, tanto las relaciones FRET basadas en QE como en SE detectan el aumento de la actividad de AMP cíclico en condrocitos. Tanto los geles físicamente reticulados como los químicamente reticulados mostraron un incremento en la relación FRET de QE a lo largo del tiempo, lo que indica una mayor respuesta de señalización de AMP cíclico tras la adición de forskolina. Este procedimiento puede utilizarse junto con otras técnicas de microscopía, como FRAP, FLIM-FRET y mediciones de anisotropía, para responder preguntas como, ¿cuáles son las diferencias en la permeabilidad y la señalización celular entre distintos tipos de microtejidos?

Dado que la reticulación se detiene cerca del PDMS, es importante recordar diseñar los moldes para los hidrogeles reticulados por luz ligeramente más grandes en diámetro que los propios hidrogeles.