FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

El objetivo general de este método experimental es permitir el estudio en tiempo real de la señalización intracelular mediante imágenes FRET de células incrustadas dentro de hidrogeles tridimensionales que imitan los tejidos naturales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, la farmacología y la medicina regenerativa, como el desarrollo de biomateriales óptimos y el cribado de fármacos de alto rendimiento en microtejidos 3D diseñados. La principal ventaja de esta técnica es que FRET se puede utilizar en un gran número de células en numerosos tipos de hidrogel utilizando sistemas convencionales de microscopio de campo amplio.

Después de fabricar moldes para fundición de hidrogel y suspender las células cultivadas en solución de hidrogel, de acuerdo con el protocolo de texto, en una campana de cultivo de tejidos, agregue la célula que contiene el precursor a los moldes de fundición utilizando la técnica estéril. Antes de la reticulación, centre las células suspendidas en un precursor de hidrogel para optimizar la obtención de imágenes confinando las células a un solo plano focal y minimizando la señal fuera de plano. A continuación, para reticular hidrogeles de PC, utilice una fuente de luz UVA durante un tiempo de exposición igual a 3,2 julios por centímetro cuadrado por milímetro de espesor para irradiar la célula que contiene el precursor.

Alternativamente, use una lámpara dental de mano menos costosa. Evite sobreexponer el hidrogel, ya que esto disminuirá la viabilidad celular. En cambio, los hidrogeles de reticulación física se colocan a 37 grados centígrados.

Después de la reticulación, retire el molde de fundición de hidrogel PDMS y reemplácelo con el plato PDMS preparado anteriormente. Use una espátula estéril para presionar el PDMS sobre el vidrio y adherirlo. Agregue un medio sin fenol, sin suero o un medio químicamente definido al pocillo creado en el plato de PDMS con un cubreobjetos para mantener el hidrogel sumergido.

Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Una vez que la placa de PDMS con el hidrogel se haya asegurado en la platina del microscopio y se haya aplicado aceite al objetivo, use la luz transmitida para encontrar al menos 15 células para la obtención de imágenes y verifique la transfección con imágenes de fluorescencia. En el software del microscopio, configure los ajustes de la cámara para los canales de imagen FRET eligiendo entre unas pocas celdas cerca del centro del campo de visión, y optimice la exposición y la ganancia por canal de imagen según el protocolo de texto.

Elija celdas que estén cerca del centro del hidrogel, dentro del campo de iluminación relativamente plano que no sean ni demasiado brillantes ni demasiado tenues, y con una relación FRET entre 00 y 1,0. A continuación, seleccione varios campos de visión para adquirir imágenes de al menos 15 células transfectadas. Apague la luz cuando termine para limitar la exposición.

Para configurar la velocidad de captura para la adquisición de imágenes de lapso de tiempo, introduzca la periodicidad de las capturas. Utilice una velocidad rápida para la captura de la señal de referencia, por ejemplo, cada cinco segundos por campo de visión, y una velocidad más lenta para la cinética de señalización a largo plazo posterior. Seleccione Ejecutar ahora para iniciar la adquisición de imágenes y capturar imágenes durante cinco minutos para establecer una línea de base para la respuesta de la sonda en el campo de visión designado.

Después de los cinco minutos de adquisición de la imagen, pipetee el agonista o antagonista deseado, mezcle mediante pipeteo y continúe con la obtención de imágenes. Después de realizar la calibración FRET de acuerdo con el protocolo de texto, en el software del microscopio seleccione la flecha en el icono de la región de interés del fondo y elija Dibujar región de interés del fondo elíptico. Dibuje y designe una región de interés, o ROI, por campo de visión cerca de las celdas para definir el nivel de fondo.

Asegúrese de que esté seleccionada la opción Seguir actualizando el desplazamiento de fondo y, a continuación, active la visualización de la región de fondo de interés haciendo clic en el icono Región de fondo de interés. Como alternativa, elija el icono de región de interés y establezca las propiedades de la región de interés como Usar como región de interés de fondo y Las regiones de interés son diferentes en cada multipunto. Con el icono de fondo de la región de interés, seleccione Restar fondo con la región de interés.

En la ventana emergente, en Restar región de interés de fondo, seleccione Todas las imágenes y, en Aplicar a, seleccione Todos los fotogramas. Para cada campo de visión, para definir una región de interés alrededor de la célula utilizando el canal de emisión del aceptor y una máscara binaria, utilice el menú Binario, Definir umbral y seleccione Aplicar al fotograma actual. A continuación, ajuste el umbral inferior para seleccionar las celdas.

A continuación, utilice la función Cierre binario para rellenar los huecos de la máscara binaria, si es necesario. A continuación, utilice el icono Región de interés para seleccionar Copiar binario en región de interés para guardar la máscara binaria como regiones de interés. Anexe las regiones de interés de los campos de visión posteriores al grupo existente de regiones de interés.

Elimine las regiones de interés falsas. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón en las Regiones de Interés y compruebe que sus propiedades son Usar como Región de Interés Estándar y que las Regiones de Interés son diferentes en cada Multi Punto. La región de la celda de intereses se puede dibujar a mano, pero se debe tener cuidado para eliminar los valores falsos.

El protocolo contiene procedimientos para células que están fuera del campo de iluminación plano y para microscopios que no tienen campo plano. La centrifugación de los precursores de hidrogel antes de la gelificación maximizó el número de células en un plano focal cerca del cubreobjetos. Esto minimizó el ruido de fondo y aumentó el rendimiento de las imágenes.

En este experimento FRET, para el cálculo de la relación FRET de emisión templada, o QE, solo se requirieron dos imágenes para la sonda ICUE1 binaria de cadena única, incluida la QE igual a CFP CFP para excitación y emisión, y la emisión del aceptor igual a YFP YFP para excitación y emisión. Se seleccionaron múltiples campos de visión en los que varias células residían dentro del área de iluminación homogénea como se muestra aquí. Los ROI para la corrección de fondo de las señales de canal y para el análisis de células se designaron utilizando imágenes de emisión de aceptor con umbral desde el inicio de los experimentos.

Además, como se muestra aquí, se seleccionaron células que expresaban suficiente sonda. Se calcularon las relaciones FRET de QE y emisión sensibilizada por píxel y la relación FRET promedio por celda. Se calculó el inverso de la razón SE y se normalizaron ambas razones.

Bajo la estimulación de forskolina, tanto las proporciones de Fret basadas en QE como en SE detectan el aumento de la actividad cíclica de AMP en los condrocitos. Tanto los geles reticulados físicamente como los reticulados químicamente mostraron un aumento en la relación QE FRET con el tiempo, lo que indica una mayor respuesta de señalización de AMP cíclico a la adición de forskolina. Este procedimiento se puede utilizar con otras técnicas de microscopía como FRAP, flim traste y medición de traste y anisotropía, para responder a preguntas tales como, ¿cuáles son las diferencias en la permeabilidad y la singularización celular entre los diferentes tipos de microtejidos?

Dado que la reticulación se apaga cerca del PDMS, es importante recordar que los moldes para los hidrogeles de foto-reticulación tienen un diámetro ligeramente mayor que los propios hidrogeles.