La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema práctico de análisis de ADN para un microscopio epifluorescente, con el fin de manipular moléculas individuales de ADN sobre superficies de vidrio modificadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la visualización del ADN, al examinar el propio ADN, así como proteínas que se unen al ADN y otras moléculas pequeñas.

La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de observar y analizar el ADN en movimiento con facilidad. Para comenzar, coloque láminas de vidrio sobre un soporte de PTFE y fíjelas en su lugar utilizando un trozo de cinta selladora de hilo de PTFE. Después de envolver las láminas, deje un trozo de cinta de cinco centímetros de longitud para usarlo como mango durante el procedimiento de limpieza.

En una campana extractora, mezcle 350 mililitros de ácido sulfúrico y 150 mililitros de peróxido de hidrógeno en un vaso de precipitados de un litro para preparar una solución de ataque piranha. Luego, coloque la rejilla con las laminillas en la solución. Después de dos horas, vacíe el vaso de precipitados y enjuague las laminillas abundantemente con agua desionizada.

Continúe enjuagando las cubreobjetos hasta que el pH del agua en el vaso de precipitados alcance un pH neutro. Luego, someta a ultrasonido las rejillas de cubreobjetos en un vaso de precipitados que contenga agua durante 30 minutos, para limpiar y derivatizar los sustratos de vidrio. Vacíe el agua del vaso de precipitados justo antes de la aminosilanización. Para comenzar, prepare la solución de aminosilanización agregando dos mililitros de alcoxisilano y 10 mililitros de ácido acético glacial a 200 mililitros de alcohol metílico en un recipiente limpio de polipropileno.

A continuación, coloque las laminillas limpias en la solución. Luego, introduzca las laminillas limpias en la solución preparada y agite a temperatura ambiente y 100 rpm durante 30 minutos. A continuación, someta el recipiente con las laminillas derivatizadas a sonicación durante 15 minutos a 75 vatios.

Luego, agítelos nuevamente a temperatura ambiente y 100 rpm durante al menos 30 minutos. Una vez finalizado, vacíe la solución del vaso de precipitados y enjuague las laminillas tres veces, cuidadosamente: una vez con alcohol metílico y dos veces con alcohol etílico.

Después del enjuague final, almacene las laminillas en alcohol etílico y úselas dentro de las dos semanas. Primero, prepare 10 mililitros de una solución de bicarbonato de sodio 0,1 molares y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrones. Luego, disuelva dos miligramos de carbonato de succinimidilo de biotina PEG y 80 miligramos de valerato de succinimidilo de PEG en 350 micro litros de la solución filtrada de bicarbonato de sodio.

Proteja la solución de la luz utilizando un tubo de protección contra la luz. Vortexe el tubo vigorosamente durante 10 segundos y luego, centrífuguelo a 10.000 x g durante un minuto para eliminar cualquier burbuja. A continuación, enjuague una lámina de vidrio con acetona seguido de alcohol etílico.

Una vez enjuagado, deje que el portaobjetos se seque completamente al aire. Coloque una gota de 50 microlitros de la solución de PEG sobre el portaobjetos limpio de vidrio. Baje lentamente una cubreobjetos amino silanizada sobre la gota en un ángulo ligero, de modo que no se generen burbujas de aire debajo de la cubreobjetos.

Luego, coloque los portaobjetos en una cámara nivelada, oscura y humedecida durante al menos tres horas hasta toda la noche, a temperatura ambiente. Una vez finalizado, selle la solución de PEG residual en el tubo de protección contra la luz y guárdela a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, enjuague minuciosamente los cubreobjetos PEGilados con agua desionizada y luego almacénelos en un lugar oscuro y seco hasta su uso.

Para crear la cámara de flujo, coloque tiras de cinta adhesiva de doble cara sobre un soporte de acrílico, de manera que queden alineadas perpendicularmente a los orificios de entrada y salida y no perturben ninguno de los orificios del canal. A continuación, presione la cinta con la punta de una pipeta para sellar los canales. Después, coloque un cubreobjetos PEGilado, con el lado PEGilado hacia abajo, encima de la cinta para formar las cámaras de flujo.

Para evitar que se filtre alguna solución, presione la parte superior de una cubreobjetos sobre el área donde se coloca la cinta adhesiva doble cara. Luego, agregue un pegamento epoxi de secado rápido a los bordes de las cámaras para asegurarla en su lugar. A continuación, conecte un trozo de tubo de 2.5 centímetros de largo a una jeringa hermética al gas y selle la unión con pegamento epoxi.

Luego, conecte un tubo largo y flexible al tubo que proviene de la jeringa. Y nuevamente, selle la unión con pegamento epóxico. Llene el tubo conectado a la jeringa con agua desionizada, asegurándose de que no haya burbujas de aire.

A continuación, inserte el tubo en el orificio de la cámara de flujo que está sellado con pegamento epóxico. Coloque una punta de pipeta de 200 microlitros en el otro orificio, para usarla como depósito. Establezca el caudal de una bomba de jeringa en 50 microlitros por minuto.

A continuación, haga fluir 20 microlitros de una solución de proteína avidina hacia la cámara y déjela durante 10 minutos. Luego, cargue 20 microlitros de oligodesoxinucleótidos biotinilados en una jeringa. Hágalo fluir hacia la cámara y déjelo durante 10 minutos.

Si se utiliza una transferasa terminal, omita la carga de oligodesoxinucleótidos. A continuación, cargue 20 microlitros de una solución de ADN en una jeringa, introdúzcala en la cámara a una velocidad de 10 microlitros por minuto y déjela durante 30 minutos. Tras la incubación de 30 minutos, lave la cámara de flujo con 40 microlitros de tampón TE 1X a 50 microlitros por minuto.

Una vez lavada, cargue la cámara con 40 microlitros del mismo FP-DBP a una concentración de 80 nano-molar, en 1X TE. Para observar el rango completo de elongación de las moléculas de ADN, aplique diferentes tasas de flujo según las longitudes de ADN utilizadas. Observe el ADN mediante un objetivo de 60X, utilizando un microscopio fluorescente. A continuación se muestra un video de microscopio fluorescente que muestra moléculas de ADN de bacteriófago lambda, ancladas a la superficie, siendo estiradas por el flujo tras la ligación con oligonucleótidos complementarios biotinilados.

Bajo flujo, las moléculas de ADN completamente elongadas miden 16,5 micrones de longitud. En contraste, las moléculas de ADN del bacteriófago T4 se elongan hasta una longitud de 56,4 micrones bajo flujo. Esta elongación es reversible, y el ADN puede extenderse y relajarse múltiples veces.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar FP-DBP en análisis de ADN más amplios, así como demostrar el estiramiento y la relajación del polímero de ADN.