La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema de análisis de ADN conveniente para un microscopio epifluorescente, para manipular ADN de una sola molécula en superficies de vidrio modificadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la visualización de ADN. Al examinar el propio ADN, así como las proteínas de unión al ADN y otras moléculas pequeñas.

La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de observar y analizar el ADN en movimiento con facilidad. Para comenzar, coloque los cubreobjetos de vidrio en un bastidor de PTFE y asegúrelos en su lugar, usando un trozo de cinta de sellado de rosca de PTFE. Después de envolver los cubreobjetos, deje un trozo de cinta de cinco centímetros de largo que se utilizará para manipular el estante durante el procedimiento de limpieza.

En una campana extractora, combine 350 mililitros de ácido sulfúrico y 150 mililitros de peróxido de hidrógeno en un vaso de precipitados de vidrio de un litro para hacer una solución de grabado de pirañas. A continuación, coloque la rejilla de cubreobjetos en la solución. Después de dos horas, vacíe el vaso de precipitados y enjuague bien los cubreobjetos con agua desionizada.

Continúe enjuagando los cubreobjetos hasta que el PH del agua en el vaso de precipitados alcance un PH neutro. A continuación, sonicar los bastidores de cubreobjetos en un vaso de precipitados que contiene agua durante 30 minutos, para limpiar y derivar los sustratos de vidrio. Vacíe el agua del vaso de precipitados, justo antes de la aminosilanización. Para comenzar, prepare la solución de aminosilanización, agregando dos mililitros de alcoxisilano y 10 mililitros de ácido acético glacial a 200 mililitros de alcohol metílico en un recipiente limpio de polipropileno.

A continuación, coloque los cubreobjetos limpios en la solución. A continuación, coloque los cubreobjetos limpios en la solución preparada y agítelos a temperatura ambiente y a 100 rpm durante 30 minutos. A continuación, sonique el recipiente con los cubreobjetos derivatizados durante 15 minutos a 75 vatios.

Luego, agítelos nuevamente a temperatura ambiente y a 100 rpm durante al menos 30 minutos. Una vez terminado, vacíe la solución del vaso de precipitados y enjuague los cubreobjetos tres veces, con cuidado. Una vez con alcohol metílico y dos veces con alcohol etílico.

Después del enjuague final, guarde los cubreobjetos en alcohol etílico y utilícelos dentro de las dos semanas. Primero, haga 10 mililitros de una solución de bicarbonato de sodio de 0,1 molares y fíltrela a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras. Luego, disuelva dos miligramos de carbonato de succinimidil PEG de biotina y 80 miligramos de valerato de succinimidil PEG en 350 microlitros de la solución de bicarbonato de sodio filtrada.

Proteja la solución de la luz con un tubo de protección contra la luz. Agite el tubo vigorosamente, durante 10 segundos y luego, centrifuérrelo a 10, 000 x g durante un minuto para eliminar las burbujas. A continuación, enjuague un portaobjetos de vidrio con acetona seguido de alcohol etílico.

Una vez enjuagado, deje que el portaobjetos se seque completamente al aire. Coloque una gota de 50 microlitros de la solución de PEG en el portaobjetos de vidrio limpio. Baje lentamente un cubreobjetos aminosilanizado sobre la gota en un ligero ángulo, para no generar burbujas de aire debajo del cubreobjetos.

Luego, coloque los portaobjetos en una cámara nivelada, oscura y humidificada durante al menos tres horas o toda la noche, a temperatura ambiente. Cuando termine, selle la solución residual de PEG en el tubo de protección contra la luz y manténgala a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, enjuague bien los cubreobjetos pegilados con agua desionizada y luego guárdelos en un lugar oscuro y seco hasta que se utilicen.

Para crear la cámara de flujo, coloque tiras de cinta adhesiva de doble cara en un soporte acrílico, de modo que quede alineado perpendicularmente a los orificios de entrada y salida y no perturbe ninguno de los orificios del canal. A continuación, frote la cinta, con la punta de una pipeta, para sellar los canales. A continuación, coloque un cubreobjetos pegilado, con el lado pegilado hacia abajo, en la parte superior de la cinta para hacer cámaras de flujo.

Para evitar que la solución se derrame, presione la parte superior de un cubreobjetos sobre el área donde se coloca la cinta adhesiva de doble cara. Luego, agregue un pegamento epoxi de secado rápido a los bordes de las cámaras para asegurarlo en su lugar. A continuación, conecte un tubo de 2,5 centímetros de largo a una jeringa hermética al gas y selle la junta con pegamento epoxi.

Luego, conecte un tubo largo y flexible al tubo que sale de la jeringa. Y de nuevo, sella la junta con pegamento epoxi. Llene el tubo que está conectado a la jeringa con agua desionizada, asegurándose de que no haya burbujas de aire.

A continuación, inserte el tubo en el orificio de la cámara de flujo que está sellado con pegamento epoxi. Y coloque una punta de pipeta de 200 microlitros en el otro orificio, para usarla como depósito. Ajuste el caudal de una bomba de jeringa a 50 microlitros por minuto.

Luego, fluya 20 microlitros de una solución de proteína de avidina en la cámara y manténgala allí durante 10 minutos. A continuación, cargue 20 microlitros de nucleótidos oligo desoxinucleótidos biotinilados en una jeringa. Fúyalo dentro de la cámara y manténgalo allí durante 10 minutos.

Si se utiliza una transferasa terminal, omita la carga de nucleótidos oligo desoxi. Luego, cargue 20 microlitros de una solución de ADN en una jeringa, fluya hacia la cámara a una velocidad de 10 microlitros por minuto y manténgala allí durante 30 minutos. Después de la incubación de 30 minutos, lave la cámara de flujo con 40 microlitros de tampón 1X TE a 50 microlitros por minuto.

Una vez lavado, cargue la cámara con 40 microlitros del mismo FP-DBP a una concentración de 80 nano-molares, en el 1X TE.To vea el rango de estiramiento completo de las moléculas de ADN, aplique diferentes caudales de acuerdo con las longitudes de ADN utilizadas. Observe el ADN bajo una lente de objetivo de 60X, utilizando un microscopio fluorescente. Aquí hay un video de microscopio fluorescente que muestra moléculas de ADN lambda de bacteriófagos, atadas a la superficie, que se estiran por flujo después de la ligadura con oligonucleótidos complementarios biotinilados.

Bajo flujo, las moléculas de ADN totalmente alargadas miden 16,5 micras de longitud. Por el contrario, el bacteriófago T4 ADN momlécule, alargado a una longitud de 56,4 micras, bajo flujo. Esta elongación es reversible y el ADN puede extenderse y relajarse varias veces.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar FP-DBP en análisis de ADN más grandes, así como demostrar el estiramiento y la relajación del polímero de ADN.