Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular Drosophila Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos En Vivo

El objetivo general de este procedimiento es registrar las respuestas eléctricas intracelulares de los fotorreceptores y las interneuronas visuales de Drosophila a los estímulos de luz controlados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurocodificación, como cómo un estímulo luminoso lo codificará en una de sus respuestas, o cómo su información visual y sus fotorreceptores e interneuronas se extraen de los estímulos luminosos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona grabaciones duraderas y de alta calidad del estudio con poco daño al medio intracelular y al muestreo de información.

La característica de demostración de que esto puede afectar es crítica, ya que sus diversos pasos son difíciles de aprender a realizar correctamente sin verlos. Extraiga un microelectrodo de referencia de borosilicato filamentado o de un tubo de vidrio de cuarzo utilizando un extractor de pipeta estándar. Trate de lograr una reducción corta y gradual.

Los ajustes exactos varían de un instrumento a otro. El tamaño de los poros en la punta no es crucial porque se romperá para los experimentos. A continuación, extraiga un electrodo de registro del mismo tubo de vidrio e intente conseguir un cono gradual fino de 10 a 15 milímetros de largo.

En un microscopio óptico, monte el electrodo en un lado de vidrio con adhesivo múltiple y use un objetivo de aire de 40x para inspeccionar su punta. Un buen electrodo se estrecha suavemente hasta una punta invisiblemente pequeña, alrededor de la cual se pueden ver patrones de interferencia paralelos continuos más oscuros y más claros. Justo antes del experimento, rellene el electrodo de referencia con timbres de moscas, utilizando una jeringa de cinco mililitros conectada a un filtro de partículas, con una punta de plástico fina.

Para experimentos con fotorreceptores, cargue el electrodo de registro con cloruro de potasio 3 molares hasta que se forme una gota en su extremo grande. Esto minimizará el ruido de la unión de líquido durante la grabación. Para trabajar con LMC histaminérgicos, llene los electrodos de registro con acetato de potasio de 3 molares y cloruro de potasio de 0,5 milimolares para minimizar el efecto sobre la batería de cloruro de la celda.

Comience cargando un frasco de mosca fresca con moscas de cinco a 10 días de edad. Las moscas más jóvenes son más frágiles, pero se pueden registrar a partir de ellas. Seleccione la primera mosca para electrofisiología.

Las hembras grandes son las más fáciles de trabajar. Cuando estén en el tubo de captura, aproveche su tendencia inherente a subir hacia arriba en la punta de la pipeta y tapar la punta más pequeña. A continuación, conecte una jeringa de 100 mililitros con una manguera de plástico flexible a la punta de la pipeta, que se agranda para dejar pasar una Drosophila y conecte el otro extremo a una punta de pipeta grande conectada al soporte para moscas.

A continuación, exprima un pequeño volumen de aire de la jeringa para expulsar la mosca en el portamoscas. Mire a través del microscopio estereoscópico y administre suavemente más aire hasta que la cabeza de la mosca sobresalga del extremo cónico del soporte para moscas. Asegúrate de que la mosca esté firmemente atrapada por su tórax.

Luego asegure la mosca con cera de abejas. Use la temperatura más baja del calentador de cera para derretir limpiamente la cera, que parecerá transparente. Si está demasiado caliente, la cera se quemará.

Inmoviliza la cabeza de la mosca aplicando un poco de cera de abeja en la probóscide y el rabillo del ojo derecho, evitando la córnea. Fije estos dos puntos al soporte para moscas. Termine este paso rápidamente para evitar quemar la mosca.

A continuación, ponte las gafas y fabrica un microcuchillo. Sujete una hoja de afeitar que no sea de acero inoxidable con dos soportes de hoja de agarre plano y rompa una pequeña tira de su borde afilado. Lo ideal es producir un borde afilado como una navaja que se asemeje a una aguja.

Ahora, con cuidado y con gran atención a los detalles, use el microcuchillo para abrir algunos omatidios del ojo izquierdo de la mosca, como a cuatro o cinco omatidios de la cutícula dorsal justo por encima del ecuador del ojo. Esto proporcionará el paso para el microelectrodo de registro. Esto es bastante desafiante, requiere un cuchillo bien hecho y debe aprenderse con la práctica.

A continuación, retire suavemente el pequeño trozo de córnea de la abertura, exponiendo la retina que se encuentra debajo. Ahora, usando el pelo fino del aplicador de vaselina, cubra rápidamente el agujero con una pequeña gota de vaselina. La gelatina tiene la ventaja añadida de reducir la capacitancia intramural de la pipeta.

Evite manchar el ojo, ya que esto nubla la óptica. Cuando opere el amplificador de microelectrodos, siempre esté conectado a tierra tocando la superficie metálica de la jaula de Faraday o la mesa antivibración para evitar cargas estáticas. Asegure la mosca montada al poste de la plataforma de preparación de moscas.

Gire el soporte de la mosca de modo que el ojo izquierdo de la mosca esté directamente frente al investigador. A continuación, utilice un pequeño micromanipulador para insertar suavemente el electrodo de referencia romo a través de los ocelos de la mosca en la cápsula de la cabeza. Asegúrate de que la mosca aún parezca sana y mueva sus antenas.

La preparación debe ser excelente para merecer la grabación. A continuación, introduzca el microelectrodo de registro afilado en el ojo izquierdo a través de la abertura recubierta de gelatina. A medida que ingresa al tejido, la ubicación de la punta del electrodo debe ser evidente por su patrón de reflectancia.

La frágil punta del electrodo debe guiarse perfectamente o se romperá, lo cual es muy desafiante. Dependiendo del tipo de celda desde el que se grabe, la cabeza de la mosca debe estar orientada de manera ligeramente diferente. Con los electrodos en su lugar, encienda el amplificador de microelectrodos.

A continuación, apague la fuente de luz fría, desconéctela de la red eléctrica y conéctela a la conexión a tierra central para minimizar el ruido eléctrico inducido por el bucle de tierra. A continuación, ajuste las guías de luz de cuello de cisne para que el sistema de brazo Carden se pueda mover libremente alrededor de la mosca. A continuación, apague las luces de la habitación para poner la preparación de moscas en una oscuridad relativa.

Ahora mida la resistencia del electrodo registrador en el ojo. Debe estar entre 100 y 260 megaohmios. A veces, la punta está bloqueada y se puede borrar utilizando las funciones de zumbido capacitivo y pulso de corriente del amplificador.

Si eso no ayuda, use un electrodo nuevo. A continuación, ajuste el amplificador a una pinza amperimétrica o puente y ponga a cero el voltaje entre los electrodos. Después de que la mosca se haya oscurecido durante unos minutos, introduzca la punta del electrodo de registro en el ojo en pasos de 0,1 a una micra utilizando un escalón piezoeléctrico o mediante una rotación suave de la perilla de resolución fina.

En cada paso, estimule el ojo con un destello de luz de uno a 10 milisegundos. Cada destello de luz causará una breve caída en el voltaje o el ERG. Cuando la punta del electrodo entra en la lámina, cerrándose en las LMC, el ERG se invierte.

A continuación, proceda a tomar las medidas. Debido a que no es invasivo, el rendimiento de la señal de las células individuales se puede estudiar en su estado casi natural. La respuesta de voltaje de un fotorreceptor R1-R6 a la luz tenue y brillante se midió a 20 grados Celsius.

A continuación, se comparó un fotorreceptor R1-R6 con un LMC a 25 grados centígrados. Cada uno se midió en una mosca diferente, ya que los registros intracelulares con dos microelectrodos afilados en la misma mosca son demasiado difíciles para ser viables. La repetibilidad de las respuestas se hace evidente cuando se superponen los datos.

Las relaciones señal/ruido en el dominio de la frecuencia se obtuvieron transformando durante cuatro años los fragmentos de datos de señal y ruido en espectro de potencia y, a continuación, dividiendo el espectro de potencia de la señal media por el espectro de potencia de ruido medio correspondiente. El resultado puede ser extremadamente sensible a las señales en las mejores preparaciones. La técnica se puede utilizar para registrar muchas especies.

Las moscas Coenocia recibieron la misma estimulación de luz naturalista y repetitiva a 19 grados centígrados. Los datos se tomaron pre y postsinápticamente de la misma mosca mediante el avance del electrodo registrador. La dinámica más rápida del registro es consistente con la naturaleza depredadora de esta especie.

Una vez masterizada, esta técnica permite grabaciones siempre largas y de alta calidad si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante darse cuenta, quiero decir, es como aprender a tocar el piano. Cuanto más practiques, mejores resultados obtendrás.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las intervenciones farmacológicas, para responder a preguntas adicionales, como el papel de los neuromoduladores en la formación de las respuestas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiofísica exploraran cómo optimizar la información, la captura y la transferencia de luz, además de las reacciones bioquímicas cáusticas en la maquinaria de fototransducción y en las siguientes ciencias biológicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar a la Drosophila para experimentos intracelulares y cómo despertar las respuestas neuronales de sus fotorreceptores e interneuronas.