Name: Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular Drosophila Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a registrar respuestas eléctricas intracelulares en fotorreceptores e interneuronas visuales de Drosophila mediante microelectrodos afilados. Esta técnica permite obtener registros de alta calidad con mínimo daño celular para estudiar el procesamiento de información visual en insectos.

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Los autores agradecen a Mick Swann, Chris Askham y Martin Gautrey por sus importantes contribuciones en el diseño y construcción de muchos componentes eléctricos y mecánicos de los equipos. La investigación actual de MJ cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC Grant: BB/M009564/1), el Fondo de Investigación Abierta del Laboratorio Estatal Clave de Neurociencia Cognitiva y Aprendizaje (China), la Subvención de Expertos Extranjeros de Alto Nivel (China), la Beca de la Fundación Jane y Aatos Erkko (Finlandia) y la beca Leverhulme Trust (RPG-2012-567).

Los autores no tienen nada que revelar

Hemos presentado los pasos clave básicos de cómo usar microelectrodos convencionales afilados para registrar respuestas intracelulares de fotorreceptores R1-R6 y LMC en ojos de mosca intactos. Este método se ha optimizado, junto con herramientas de hardware y software a medida, durante los últimos 18 años para proporcionar grabaciones de alta calidad y larga duración para responder a una amplia gama de preguntas experimentales. Al invertir tiempo y recursos para construir configuraciones experimentales robustas y precisas, y para producir microelectrodos con propiedades eléctricas favorables, las grabaciones de alta calidad pueden convertirse en la norma en cualquier laboratorio que trabaje en neurofisiología visual de Drosophila . Si bien los sistemas de grabación y estimulación de luz bien diseñados son importantes para la ejecución rápida de diferentes paradigmas experimentales, hay tres pasos de procedimiento que son aún más críticos para lograr grabaciones exitosas: (i) hacer la preparación de la mosca con un daño ocular mínimo, (ii) tirar de microelectrodos con las propiedades eléctricas correctas y (iii) introducir el electrodo de grabación en el ojo sin romper su punta. En última instancia, para registrar datos significativos, el investigador debe comprender la base física de la electrofisiología y cómo fabricar microelectrodos adecuados para los tipos de células objetivo.
Por lo tanto, las limitaciones de esta técnica vienen marcadas principalmente por la paciencia, la experiencia y la capacidad técnica del investigador. Debido a que esta técnica puede llevar mucho tiempo dominarla para las células pequeñas de Drosophila , es aconsejable que los electrofisiólogos en formación practiquen primero con ojos de insectos más grandes, como la mosca36 o la langosta35, utilizando el mismo equipo. Una vez que la realización de grabaciones intracelulares de alta calidad desde los fotorreceptores e interneuronas más grandes se convierte en rutina, es hora de pasar al ojo de Drosophila . Otra limitación de la técnica se refiere a la identificación celular. Las células de Drosophila penetradas se pueden cargar electroforéticamente con colorantes, incluido el amarillo de Lucifer o la neurobiotina. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de la punta de los microelectrodos, la electroforesis funciona de manera menos eficiente que con electrodos de menor resistencia, como los electrodos de parche. Además, los microelectrodos rellenos de colorante tienen propiedades eléctricas menos favorables, lo que hace que sea mucho más difícil registrar respuestas de alta calidad con ellos de los fotorreceptores de Drosophila y las LMC.
Un problema técnico que ocurre a veces es una señal de entrada inestable o una falta total de ella. Esto a menudo se asocia con que la señal de voltaje se desvía constantemente o es más alta / más baja que el rango de grabación del amplificador. En la mayoría de las ocasiones, este comportamiento se debe a que el electrodo de registro está bloqueado (o su punta es demasiado fina, con una resistencia o capacitancia intramuros demasiado alta, para realizar correctamente cambios rápidos de señal). Aunque se puede intentar desbloquear la punta zumbando la capacitancia del electrodo, lo que a veces funciona, a menudo la situación se resuelve mejor simplemente cambiando el electrodo de registro. Esto puede requerir ajustes de parámetros en el instrumento extractor de microelectrodos para reducir la resistencia de la punta de los nuevos electrodos. La punta del electrodo también puede bloquearse en las preparaciones, para las cuales tomó demasiado tiempo cubrir el orificio corneal con vaselina. El contacto prolongado con el aire puede secar el tejido de la retina recién expuesto, convirtiendo su capa superficial en una sustancia similar al pegamento. Si este es el caso, el investigador generalmente ve una mancha roja de tejido atascada en el electrodo de registro al sacarlo del ojo. La única solución aquí es hacer una nueva preparación. La vaselina puede proporcionar muchos beneficios para los registros electrofisiológicos: (i) previene la coagulación de la hemolinfa que podría romper la punta del electrodo; (ii) recubre la punta del electrodo reduciendo su capacitancia intramural, lo que reduce la constante de tiempo del electrodo y, por lo tanto, tiene el potencial de mejorar la resolución temporal de las señales neuronales registradas40,41; (iii) mantiene limpia la punta del electrodo, facilitando las penetraciones; y después de la penetración, (iv) incluso puede ayudar a sellar la punta del electrodo a la membrana celular42. 
La señal puede ser inestable o perderse cuando el cable de cloruro de plata del portaelectrodos se rompe o se descloriza; en cuyo caso simplemente reemplace o reclorice el cable viejo. La señal faltante también puede deberse a que uno (o ambos) de los portaelectrodos no está conectado de forma segura a sus conectores. Sin embargo, es extremadamente inusual que un equipo no funcione correctamente. Si la señal es indetectable y se han agotado todas las demás posibilidades, pruebe que cada parte del aparato de grabación, incluidos el cabezal y el amplificador, los filtros de paso bajo y los convertidores AD/DA, estén conectados correctamente y funcionen normalmente. Una forma de lograr esto es reemplazar cada instrumento por otro de una plataforma que se sabe que funciona normalmente. Alternativamente, use un generador de señales para verificar el rendimiento de los componentes electrónicos uno por uno.
Pero quizás el problema técnico más común al que se enfrenta el electrofisiólogo es el de registrar el ruido. En términos generales, el ruido de registro es la actividad eléctrica observada distinta de la respuesta neuronal directa a un estímulo dado. Debido a que la preparación de la mosca, cuando se hace correctamente, es muy estable, el ruido observado (más allá de la variable natural de las respuestas) con mayor frecuencia resulta de bucles de tierra en el equipo de grabación, o se capta de dispositivos eléctricos cercanos. Dicho ruido es típicamente un zumbido de red de 50/60 Hz y sus armónicos; pero a veces compuesto de formas de onda más complejas. Para averiguar el origen del ruido, retire el soporte de preparación de moscas de la configuración, conecte los electrodos de grabación y referencia a través de una gota de Ringer de mosca (o colóquelos en un pequeño baño de solución de Ringer; consulte el paso 1.2.6) y grabe la señal en modo CC o puente. Si se observa ruido en la señal grabada, esto probablemente significa que el ruido es externo a la preparación de la mosca.
Otra buena prueba para identificar el origen del ruido es reemplazar los portaelectrodos con un modelo de celda eléctrica conectado al amplificador. En una configuración idealmente configurada y conectada a tierra, la señal grabada ahora debería estar prácticamente libre de ruido, mostrando solo ruido de bits estocástico del convertidor AD (¡en el mejor de los casos ni siquiera eso!). Si el ruido aún está presente, vuelva a verificar que todo el equipo de la plataforma esté correctamente conectado a tierra. Un enfoque conveniente para detectar bucles de tierra es: (i) desconectar todos los cables de conexión a tierra de todas las partes dentro de la plataforma; ii) asegurarse de que, después de hacer esto, cada parte esté realmente aislada del suelo, por medio de un ohmímetro; (iii) conecte las partes, una por una, a la tierra central directamente, no a través de ninguna otra parte de la plataforma. Intente también cambiar las configuraciones del equipo. Por ejemplo, a veces alejar la computadora y el monitor de la plataforma puede reducir el ruido; Sin embargo, en otras ocasiones, mover la computadora dentro del bastidor del equipo reduce el ruido. También vale la pena desenchufar el equipo cercano para ver si se reduce el ruido o proteger los componentes adicionales. Además, intente desenchufar o reemplazar diferentes componentes del equipo de grabación, especialmente los cables BNC (que pueden tener conexiones a tierra defectuosas). Si solo se observa ruido de bits cuando se usa el modelo de celda, la fuente de ruido inicial son los electrodos o la preparación de la mosca en sí. Por ejemplo, podría ser que el electrodo de referencia esté tocando inadvertidamente un nervio motor o fibras musculares activas dentro de la cápsula de la cabeza (o perturbando los músculos de vuelo en el tórax, si se coloca allí). Por lo general, es más sencillo preparar una nueva mosca para la grabación, teniendo cuidado de minimizar el daño a la mosca. Pero si el ruido persiste y es de banda ancha, es probable que los electrodos no sean óptimos para los experimentos; demasiado agudo / fino (por lo tanto, demasiado ruidoso) o simplemente incorrecto para el propósito; Incluso hemos visto electrodos de cuarzo que actúan como antenas, ¡captando débiles señales de transmisión! Aunque la iteración de la configuración de los parámetros del instrumento extractor para generar los microelectrodos correctos para grabaciones consistentes de alta calidad de tipos de celdas específicos puede requerir mucho esfuerzo, vale la pena. Una vez que los electrodos de grabación están bien adaptados para los experimentos, pueden proporcionar grabaciones duraderas de excelente calidad.
Las técnicas de registro de microelectrodos afilados se pueden aplicar de manera similar para estudiar el procesamiento de información neuronal en multitud de preparaciones, incluidas diferentes capas de procesamiento en los ojos y el cerebro de los insectos43,44. Debido a que las puntas de los microelectrodos se pueden hacer muy finas, generalmente dañan las células estudiadas menos que la mayoría de las aplicaciones de pinzas de parche. Es importante destacar que los modernos amplificadores de microelectrodos de muestreo y retención permiten un buen control de las propiedades eléctricas de las puntas40,45-47. Por lo tanto, cuando se aplica correctamente, esta técnica puede proporcionar datos confiables de preparaciones in vivo3,5,7-10,44 o in vitro48 con una alta relación señal-ruido a una resolución inferior a un milisegundo. Tal precisión sería imposible con las técnicas de imagen óptica actuales, que son más ruidosas y lentas. Además, el método se puede utilizar para caracterizar las propiedades de la membrana eléctrica de las celdas pequeñas tanto en configuraciones de pinza de corriente como de voltaje5,29,33,36,40-42,49, proporcionando datos valiosos para los enfoques de modelado biofísico y empírico7,8,11,33,49-54 que vinculan los experimentos con la teoría.

La mosca de la fruta del ojo (Drosophila melanogaster) compuesto es un buen sistema modelo para investigar la organización funcional de los fotorreceptores y las interneuronas matrices para el muestreo y procesamiento de imagen neuronal, y para la visión de los animales. El sistema cuenta con el diagrama de cableado más completa 1,2 y es amigable para las manipulaciones genéticas y supervisión de la actividad neuronal precisa (de alta relación señal-ruido y el tiempo de resolución) 3-10. El ojo de Drosophila es modular, que contiene ~ 750 estructuras de lentes con tapón aparentemente regulares llamados ommatidia, que en conjunto proporcionan un campo de visión de la panorámica que cubre casi todas las direcciones alrededor de su cabeza volar. Información primaria del ojo unidades de muestreo son sus fotorreceptores rhabdomeric 7,8,11. Cada ommatidium contiene ocho células fotorreceptoras (R1-R8), que comparten la misma lente faceta pero están alineados con siete direcciones diferentes. Mientras que los fotorreceptores exteriores R1-R6 are más sensible a la luz azul-verde, sensibilidades espectrales de las células internas R7 y R8, que están por encima de la otra y apuntan a la misma dirección, exhiben tres subtipos distintivos: pálido, amarillo y área del borde dorsal (DRA) 12- 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> Figura 1. Organización funcional del ojo de Drosophila. (A) Los dos primeros ganglios de la óptica, la retina y la lámina, se resaltan en gris en el interior del ojo de la mosca. Fotorreceptores de la retina R1-R6 y lámina grandes células monopolares (LMC: L1-L3) son de fácil acceso en vivo a las grabaciones de microelectrodos convencionales fuerte. El electrodo esquemática destaca la ruta normal a grabar de R1-R6 en la retina. Uno de los caminos para grabar desde LMC en la lámina es cambiar de forma paralela al electrodo de la izquierda. (B) Lamina es una matriz de órgano retinotopicallyzados cartuchos, cada uno de los cuales está lleno de neuronas que procesa la información a partir de una pequeña área específica en el espacio visual. Debido a la superposición neural, seis fotorreceptores de diferentes ommatidia vecinos envían sus axones (R1-R6) a la misma cartucho de lámina, formando sinapsis de salida histaminérgicos a L1-L3 y una célula amacrine (Am). (C) La difusión de la información neural entre terminales de los axones R1-R6 y las interneuronas visuales (incluyendo L4, L5, Lawf, C2, C3 y T1), en el interior de un cartucho de lámina es complejo. (D) R1-R6 fotorreceptor axones reciben evaluaciones sinápticas de las células monopolar L2 y L4. (B) y (C) modificado de Rivera-alba et al 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> El ojo de Drosophila es del tipo neuronal superposición 16. Esto significa tsombrero de las señales neurales de ocho fotorreceptores pertenecientes a siete ommatidia vecina, que se ven en el mismo punto en el espacio, se agrupan juntos en un cartucho neural en los próximos dos neuropils: la lámina y la médula. Mientras que los seis fotorreceptores exteriores del proyecto R1-R6 sus terminales de los axones neuronales en columnas a la lámina (Figura 1), las células R7 y R8 pasar por alto esta capa y hacen contactos sinápticos con su columna de médula 17-19 correspondiente. Estos cableados exactas producen el sustrato neural para el mapeo retinotopic de la mosca de la visión temprano, después de lo cual cada lámina (Figuras 1A-C) y la columna médula (cartucho) representa un único punto en el espacio. Las entradas directas de fotorreceptores R1-R6 son recibidas por las células monopolares grandes (LMC: L1, L2 y L3) y la célula amacrinas (AM) en la lámina 1,2,20. De estos, L1 y L2 son las células más grandes, que median en las principales vías de información (Figura 1D), WHIch responden a dentro y fuera de los bordes en movimiento, y por lo tanto constituyen la base de cálculo del detector de movimiento 21,22. Experimentos sobre el comportamiento sugiere que, en contraste intermedia, las dos vías facilitan la percepción del movimiento de direcciones opuestas: back-to-front en L1 y de adelante hacia atrás en células L2 23,24. Conectividad implica, además, que las neuronas L4 pueden jugar un papel crítico en la comunicación lateral entre los cartuchos vecinos 25,26. sinapsis recíprocas se encontraron entre las células L2 y L4, situados en la misma y dos cartuchos adyacentes. Aguas abajo, cada célula L2 y sus tres células L4 asociados proyectan sus axones a un objetivo común, la neurona Tm2 en la médula, donde se cree que las aportaciones de los cartuchos de vecinos para ser integrado para el procesamiento de movimiento de delante a atrás 27. Aunque las neuronas L1 reciben el aporte de personas del mismo cartucho de L2 a través de las dos uniones comunicantes y las sinapsis, que no están conectados directamente a los cartuchos de lámina L4s y por lo tanto adyacentes. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; evaluaciones Synaptic para fotorreceptor axones R1-R6 son proporcionados únicamente por las neuronas pertenecientes a los circuitos / L4 L2 pero no la vía de 1,2 L1 (Figura 1D). Mientras que las conexiones del mismo cartucho son selectivamente de L2 a R1 y R2 y de L4 a R5, todos los fotorreceptores R1-R6 reciben retroalimentación sináptica de L4 de uno o ambos cartuchos de vecinos. Además, existen fuertes conexiones sinápticas de AM a R1, R2, R4 y R5, y células gliales también están conectados sinápticamente a la red y por lo tanto pueden participar en el procesamiento de imágenes neural 6. Por último, axonal gap-uniones, que une la vecina R1-R6 y R6 y R7 entre / R8 fotorreceptores en la lámina, contribuyen a la representación de la información asimétrica y el procesamiento de cada cartucho 14,20,28. Grabaciones de tensión intracelulares de fotorreceptores individuales y las interneuronas visuales en casi intacto Drosophila proporcionan una alta r-señal-ruidoación de datos con una resolución sub-milisegundo 3,5,7-10,29, que es necesaria para dar sentido a los cálculos neuronales rápidas entre las neuronas conectadas. Este nivel de precisión no es posible mediante técnicas de imagen ópticos actuales, que son significativamente más ruidoso y por lo general operan a las 10 - una resolución de 100 ms. Por otra parte, debido a que los electrodos tienen puntas muy pequeñas y afiladas, el método no está restringido a los cuerpos de las células, pero puede proporcionar grabaciones directas de las estructuras nerviosas activas pequeñas; tales como árboles dendríticas los LMC &#39;o axones fotorreceptoras, las cuales no se puede acceder por consejos mucho más grandes de los electrodos de patch-clamp. Es importante destacar que el método también es estructuralmente menos invasivo y perjudicial que la mayoría de las aplicaciones de patch-clamp, y así afecta a menos de muestreo medio y la información intracelular de las células estudiadas. Por lo tanto, las técnicas de microelectrodos afilados convencionales han contribuido, y siguen contribuyendo, descubrimientos fundamentales y la visión original en Infor neuronalprocesamiento de la escala en el momento adecuado; mejorar nuestra comprensión mecanicista de la visión 3-10. En este artículo se explica cómo en registros intracelulares in vivo de Drosophila fotorreceptores y LMC R1-R6 se llevan a cabo en el laboratorio Juusola. Este protocolo describe cómo construir una plataforma de electrofisiología adecuado, preparar la marcha, y realizar las grabaciones. Se presenta algunos datos representativos, y algunos problemas comunes y las posibles soluciones se discuten que se pueden encontrar cuando se utiliza este método.

<table><tbody><tr><td>Microscopio estereoscópico con zoom para la preparación de moscas</td><td>Olympus</td><td>SZX12 DFPLFL1.6x PF oculares: WHN30x-H/22</td><td>Capaz de un aumento de ~150X con una larga distancia de trabajo; soporte de montaje de mesa de acero pesado a medida</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico en la configuración intracelular</td><td>&middot; &nbsp; Olympus</td><td>Olympus SZX7; oculares: WHN30x-H/22</td><td>Se necesitan oculares 30X para ver bien los reflejos de la punta del electrodo cuando se introduce a través del pequeño orificio corneal en el ojo</td></tr><tr><td>Microscopio Nikon</td><td>Nikon SMZ645; oculares: C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa antivibración</td><td>Melles Griot</td><td>Con orificios métricos M6 en la placa</td> <td>de pruebasNuestros equipos a medida tienen un gran agujero perforado a través de la gruesa placa de pruebas que deja entrar el poste de la plataforma de preparación de moscas (alberga un disipador de calor de cobre con electrónica) desde abajo</td></tr><tr><td>Micromanipuladores Newport</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>Narishige NMN-21</td><td>En nuestras configuraciones intracelulares, se utilizan diferentes sistemas de micromanipuladores para introducir los electrodos de registro de Shap en el ojo de la mosca. Todos los manipuladores enumerados están proporcionando con éxito grabaciones estables y duraderas de los fotorreceptores de Drosophila y las LMC.</td></tr><tr><td>Huxley Bertram</td><td>Huxley eje xyz con control</td><td></td><td></td>manual fino</tr><tr><td>Sensapex</td><td>Sensapex triple eje</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M&auml; rzh&auml; M</td><td>&auml del usuario; rzh&auml; usuario DC-3K con paso piezoeléctrico de eje x adicional y controlador</td><td></td><td></td>MS 314</tr><tr><td>Soportes magnéticos</td><td>Cualquier base magnética con interruptor de encendido/apagado servirá</td><td></td><td>Por ejemplo, para manejar cables dentro de la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Portaelectrodos Aparato</td><td>Harvard</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de plata</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>0,3 - 0,5 mm de diámetro; necesita ser clorado para los portaelectrodos</td></tr><tr><td>Fuente de luz de fibra óptica</td><td>Muchos diferentes, incluidos</td> los haces de fibra óptica de Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tecnología</td><td></td><td>ultrafina Para entregar el estímulo de luz LED al sistema de brazo cardán. Utilizamos guías de luz líquida y de cuarzo (que van desde UV hasta IR)</td></tr><tr><td>Thorn Labs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly Cathing Tube</td><td></td><td>P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Paquete de 100 Piezas</td><td>Corte la parte inferior cónica del tubo de centrífuga de plástico de 50 ml y pegue una punta de pipeta de 1 ml en él.</td></tr><tr><td>Sistema de adquisición digital</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de microelectrodo de pinza de corriente/voltaje de un solo electrodo</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>¡Rendimiento excepcional!</td></tr><tr><td>Estándar de etapa de cabeza</td><td>(+/- 150 nA)</td>Para fuentes de luz y controladores LED <td>npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td></td><td>OptoLED de 2 canales (Cairn Research Ltd., Reino Unido)</td><td></td><td>Muchos de nuestros sistemas de estímulo son construidos internamente&nbsp;</td></tr>Software <tr><td>de adquisición y análisis diseñado y construido</td><td></td><td></td><td></td>por uno mismo</tr><tr><td></td><td>Muchas empresas para elegir</td><td></td><td>Biosyst; Sistema basado en Matlab escrito a medida para el trabajo experimental y teórico en el laboratorio de Juusola</td></tr><tr><td>Computadora personal o Mac</td><td></td><td></td><td>Asegúrese de que la PC o Mac sea compatible con el sistema de adquisición de datos y el software</td></tr><tr><td>Sistema de brazo cardán&nbsp;</td><td>Diseñado y construido</td><td></td> a sí mismo <td>Proporciona un posicionamiento preciso x, y, z de los estímulos luminosos Sistema de</td></tr><tr><td>control de temperatura Peltier&nbsp;</td>Jaula de Faraday de <td>diseño y construcción</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>propia Blindaje</td><td></td><td>electromagnético contra el ruido</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato filamentado</td><td>Diámetro exterior: 1 mm</td><td></td>Diámetro interior: 0,5 - 0,7 mm Capilares de vidrio de cuarzo filamentado Diámetro exterior: 1 mm Diámetro interior: 0,5 -<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td> Extractor de pipetas de 0,7 mm <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Modelo P-2000 láser Tirador de micropipetas aplanadas/marrones</td><td>Para electrodos de referencia de borosilicato, utilice el programa preestablecido #11 (electrodos de parche): Calor = 350; Filamento = 4; Velocidad 36; Retraso = 200).1.2.1). Para los electrodos de registro de borosilicato, use el programa preestablecido # 12 (esto generalmente extrae buenos objetos punzantes convencionales &nbsp; para registros de fotorreceptores): Calor = 355; Filamento = 4; Velocidad 50; Retraso = 225; Tirón = 150. En el caso de las grabaciones de LMC, que requieren electrodos con puntas más finas, es necesario ajustar estos valores. Para la extracción de capilares de cuarzo, el manual P-2000 sugiere programas para microelectrodos de punta fina. Estos programas' Los parámetros preestablecidos sirven como puntos de partida útiles para modificaciones sistemáticas con el fin de generar electrodos con buen éxito de penetración y bajo ruido de grabación.</td></tr><tr><td>Solución de timbre extracelular para el electrodo</td><td>de referencia Productos químicos de Fisher Scientific</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sacarosa</td><td>Consulte la receta en la sección de protocolo</td></tr><tr><td>Solución de KCl de 3 M para llenar el microelectrodo de registro filamentado</td><td>Sales de Fisher Scientific 10010310</td><td>, KCl</td><td></td></tr><tr><td>Vaselin</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>VaselinaHojas de afeitar de acero no inoxidable Portacuchillas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>/rompedor Fine</td><td>Science Tools By Dumont</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>Blu-tack</td><td>Bostik</td><td></td><td>Alternativamente, use arcilla para moldear</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools By Dumont</td><td>11252-00</td><td>#5SF (puntas súper finas)</td></tr></tbody></table>

método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; drosophila</em&gt; los fotorreceptores y interneuronas a la luz estímulos<em&gt; en vivo</em

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Las respuestas de voltaje de los fotorreceptores de insectos y las interneuronas visuales se pueden registrar con precisión con microelectrodos afilados convencionales. El método descrito aquí permite al investigador medir respuestas intracelulares duraderas (de minutos a horas) de alta calidad de fotorreceptores R1-R6 de Drosophila individuales y células monopolares grandes (LMC) a estímulos luminosos. Debido a que el sistema de grabación tiene poco ruido, se puede utilizar para estudiar la variabilidad entre las células individuales en el ojo de la mosca y cómo sus salidas reflejan las propiedades físicas del entorno visual. Describimos todos los pasos clave para realizar esta técnica. Se describen los pasos básicos para construir una configuración electrofisiológica adecuada para el registro, como el diseño y la selección del equipo experimental. También explicamos cómo prepararse para la grabación mediante la creación de electrodos de registro (nítidos) y de referencia (romos) adecuados. Se dan detalles sobre cómo fijar una mosca intacta en un soporte para moscas hecho a medida, preparar una pequeña ventana en su ojo e insertar un electrodo de registro a través de este orificio con un daño mínimo. Explicamos cómo localizar el centro del campo receptivo de una célula, adaptar la oscuridad o la luz a la célula estudiada y registrar sus respuestas de voltaje a los estímulos dinámicos de luz. Finalmente, describimos los criterios para registros normales estables, mostramos las respuestas de voltaje características de alta calidad de las células individuales a diferentes estímulos luminosos y definimos brevemente cómo cuantificar su rendimiento de señalización. Muchos aspectos del método son técnicamente desafiantes y requieren práctica y paciencia para dominarlos. Pero una vez aprendido y optimizado para los objetivos experimentales del investigador, otorga excelentes datos neurofisiológicos in vivo.

El método de grabación de microelectrodos agudo, tal como fue adaptada aquí por el ojo de Drosophila, se puede utilizar para cuantificar de manera fiable el muestreo y el procesamiento neuronal de información en las células de la retina y la lámina, y la comunicación entre ellos 4,5,7,8,10,33. Al usarlo para estudiar la codificación en diferentes poblaciones de tipo salvaje, mutantes o cepas de moscas de la ingeniería genética, el método ha demostrado su valor; no sólo en la cuantificación de los efectos de una mutación, la temperatura, la dieta o de expresión seleccionado 3,4,6,9,10,14,30,34, sino también en la revelación de razones mecanicistas para alterados comportamientos visuales 14,34. El método también es fácilmente aplicable a otras preparaciones de insectos 35,36, potenciando los estudios de visión neuroethological. A continuación, mostramos algunos ejemplos de sus aplicaciones exitosas. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> Figura 7. VoltajeRespuestas de una mosca de la fruta R1-R6 fotorreceptor a un pulso de luz a los 20 y 25 ° C. Debido a las penetraciones de microelectrodos afilados son a menudo muy estable, es posible registrar las respuestas de tensión de la misma fotorreceptor R1-R6 a un estímulo de luz dada en diferentes temperaturas ambiente por el calentamiento o enfriamiento de la mosca. En nuestros montajes, la mosca titular se coloca en un sistema de control de temperatura de cerca de bucle basado elemento Peltier. Esto nos permite cambiar la temperatura de la cabeza de la marcha en cuestión de segundos. Una temperatura más alta acelera las respuestas de tensión y de forma característica reduce el potencial de reposo de los fotorreceptores R1-R6 (como se indica por las flechas rojas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Estudiar el efecto de la temperatura sobre la salida de fotorreceptores <p class="jove_content" fo:kEEP-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Con un buen diseño y un sistema de grabación de vibración aislada, el método puede ser usado para medir el efecto de la temperatura en la salida de los nervios de una célula individual por el calentamiento o enfriamiento de la mosca. El ejemplo que muestra las respuestas de voltaje a un brillante pulso de 10 ms de largo, registrados en el mismo fotorreceptor R1-R6 a los 20 y 25 ° C (Figura 7). Cuantificada antes de 4,9, el calentamiento reduce el potencial de reposo de un fotorreceptor en la oscuridad, y acelera sus respuestas tensión. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> Figura 8. Rendimiento de Señalización de una mosca de la fruta R1-R6 fotorreceptor mejora con la intensidad de la luz (A) de salida de fotorreceptores se atenúen (abajo) y brillante. (Encima; 10.000 veces una luz más brillante) repiten series temporales intensidad de la luz naturalista registrado por la misma microelectrodoen la misma célula a 20 o C. Las respuestas al estímulo luminoso son más grandes, ya que integran más muestras, respuestas elementales (protuberancias) a fotones individuales 4,5,7,8. (B) 20 respuestas de voltaje consecutivos de un segundo de larga se superponen. Se tomaron las respuestas individuales (gris claro) después de que las tendencias adaptativas (flecha en A) había retrocedido (recuadro de puntos en A). Los medios de respuesta correspondientes (las señales) son las huellas más oscuros. La diferencia entre la señal y las respuestas individuales es el ruido. (C) Las células de rendimiento de señalización se cuantificó por las grabaciones de &#39;relaciones de señal a ruido (SNR) mediante los métodos estándar 4,5,7,8. Salida de los fotorreceptores tiene alrededor de 64 Hz más amplia gama de señalización fiable en la estimulación luminosa ( &#39;≥1 brillante, hasta 84 Hz que en el dim (SNR SNR)&#39; Dim ≥1, hasta 20 Hz), con signal-a-ruido mejora en gran medida; de SNR Dim MAX = 87 a SNR brillante MAX = 1,868. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> El estudio de adaptación y codificación neuronal repetitiva por estimulación La invasividad del método, haciendo relativamente poco daño en las estructuras de la retina y la lámina, lo hace ideal para el estudio del rendimiento de señalización de las células individuales a diferentes estímulos de luz en su estado fisiológico natural cerca in vivo. La figura 8 muestra las respuestas de tensión de un R1- R6 fotorreceptor a un estímulo serie oscuro y brillante repetida naturalista tiempo intensidad de la luz, a 20 ° C, mientras que la figura 9 </strong&gt; muestra las respuestas de otro fotorreceptor R1-R6 y un LMC a un estímulo naturalista diferente a 25 ° C. Las grabaciones pre y postsinápticos se realizaron por separado a partir de dos diferentes moscas porque registros intracelulares simultáneos de dos microelectrodos afilados de la misma mosca, una en la retina y el otro en la lámina, son demasiado difíciles de ser viable 30. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> Figura 9. Respuestas de tensión de una mosca de la fruta R1-R6 fotorreceptores y LMC a las repetidas naturalista estimulación a 25 ° C (A) R1-R6 (gris) y LMC (negro) salidas registradas por diferentes microelectrodos de diferentes moscas. (B) 20 pre-luz totalmente adaptada consecutiva (arriba) y las respuestas postsinápticas (a continuación) para el mismo patrón de estímulo naturalista con las respuestas individuales, se muestra en gris claro unad los correspondientes medios de respuesta (las señales) como las huellas oscuras. La diferencia entre la señal y las respuestas individuales es el ruido. (C) Las células de rendimiento de señalización se cuantificó por las grabaciones de &#39;relaciones de señal a ruido (SNR). LMC tiene salida de aproximadamente 10 Hz más amplia gama de señalización fiable (SNR &#39;LMC ≥1, hasta 104 Hz) de salida R1-R6 (SNR&#39; R ≥1, hasta 94 Hz). Ambas relaciones señal-ruido son altos (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752), y como el ruido de la grabación fue baja, sus diferencias reflejan diferencias de codificación reales entre las células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Después del inicio del estímulo, las grabaciones típicaLy muestre la adaptación rápida tendencias que se desaparecen en gran parte dentro de 5-6 seg. A partir de entonces, las células producen respuestas muy consistentes a cada 1 seg presentación larga de estímulo (cada recuadro de puntos encierra 20 de estos). La repetibilidad de las respuestas se hace evidente cuando estos se superponen (Figura 8B y en la Figura 9B). Las respuestas individuales son las huellas grises delgadas, y su significan el grueso trazo más oscuro. La respuesta media se toma como la señal neural, mientras que el ruido neural es la diferencia entre la media y cada 4,5,9,37,38 respuesta individual. Las respectivas relaciones de señal a ruido en el dominio de frecuencia (Figura 8C y la Figura 9C) se obtuvieron por Fourier-transformación de los fragmentos de datos de señal y ruido en espectros de potencia, y dividiendo el espectro de potencia media de la señal con el correspondiente espectro de potencia de ruido media 4, 5,9,37,38. Característicamente, las máximas relaciones señal a ruido of las salidas neuronales registrados a la estimulación naturalista son altas (100 - 1000), y en las preparaciones más estables con ruido de grabación muy baja puede alcanzar valores &gt;&gt; 1000 (por ejemplo, la Figura 8C.). Nótese también que el calentamiento se expande el ancho de banda de las células de señalización fiable 4 (SNR &#39;brillante ≥ 1); por ejemplo, la diferencia relativa entre los dos R1-R6S en las figuras 8 y 9, respectivamente, es de 10 Hz (84 a 20 ° C y 94 Hz a 25 o C). Uno puede estimar más velocidad de transferencia de información a partir de su relación señal-ruido de cada célula mediante el uso de la ecuación de Shannon 32, o mediante el cálculo de la diferencia entre la entropía y la entropía de ruido tasas de las respuestas &#39;a través del método de extrapolación de triple 39. Más detalles acerca de los análisis teóricos de la información, así como su uso y limitacioness específicamente con este método se dan en las publicaciones anteriores 7,8,39. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> Figura 10. Respuestas de tensión de una mosca del asesino R1-R6 fotorreceptores y LMC a las repetidas naturalista estimulación a 19 ° C (A) R1-R6 (gris) y LMC (negro) resultados registrados por el mismo microelectrodo de la misma mosca; postsináptico primera y más tarde presináptica, como el electrodo se avanzó en el ojo. (B) 20 pre consecutiva (arriba) y postsinápticos (abajo) respuesta (trazas de color gris claro) para el mismo patrón de estímulo naturalista fueron capturados después de la adaptación inicial (recuadro de puntos en A). Sus medios son las señales (los trazos más oscuros en la parte superior), mientras que sus respectivas diferencias con respecto a las respuestas individuales dan el ruido. (C) El correspondiente SignaRatios-l-ruido (SNR) se calcularon como en las figuras 8C y 9C. LMC tiene salida sobre un rango más amplio de 100 Hz de señalización fiable (SNR &#39;LMC MAX ≥1, hasta 234 Hz) de salida R1-R6 (SNR&#39; R MAX ≥1, hasta 134 Hz). Ambas relaciones señal-ruido son altos (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627), y como la misma microelectrodo se utilizó en las grabaciones, sus diferencias reflejan diferencias reales en las salidas neurales pre- y postsinápticos. Estos resultados implican que el sistema de grabación tenía bajo nivel de ruido, y su influencia en los análisis fue marginal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Estudios Vision Neuroethological </p&gt; El método también se puede utilizar para registrar las respuestas pre y postsinápticos de tensión de los ojos compuestos de diferentes especies de insectos 7,8,35,36 (Figura 10), lo que permite estudios comparativos neuroethological de procesamiento de la información visual. Para el sistema de grabación presentada, la única adaptación requerida es de preparación de los nuevos titulares, cada uno con una abertura de dimensiones adecuadas para las especies estudiadas. Estas grabaciones son ejemplares de un asesino de mosca hembra (Coenosia attenuata). Ellos muestran respuestas de tensión intracelulares de un fotorreceptor R1-R6 y LMC a la estimulación repetitiva luz idéntica, tal como se utiliza para los homólogos de Drosophila en la Figura 9, pero a 19 o C. En este caso, tanto los datos pre y postsinápticos se registraron de la misma mosca; uno después del otro, con el mismo electrodo de registro (lleno de 3 M KCl) primero avanzando a través de la lámina lateral antes de entraring la retina frontal. En comparación con los datos de Drosophila a 25 ° C, los datos Coenosia - incluso a la temperatura más fría - muestra las respuestas con dinámicas más rápidas; ampliar la gama de señalización fiable (relación señal a ruido &gt;&gt; 1) sobre un rango de frecuencias más amplio. Tales adaptaciones funcionales en la codificación neuronal de estímulos naturalistas están en consonancia con el estilo de vida depredador Coenosia &#39;s 36, que requieren alta precisión la información espacio-temporal para lograr comportamientos de caza aéreas rápidas.

Los microelectrodos afilados permiten una caracterización electrofisiológica precisa de la salida de fotorreceptores e interneuronas visuales en Drosophila viva. Aquí mostramos cómo usar este método para registrar respuestas de voltaje de alta calidad de células individuales a la estimulación de luz controlada. Este método es ideal para estudiar el procesamiento de la información neuronal en ojos compuestos de insectos.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

El objetivo general de este procedimiento es registrar las respuestas eléctricas intracelulares de los fotorreceptores y las interneuronas visuales de Drosophila a los estímulos de luz controlados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurocodificación, como cómo un estímulo luminoso lo codificará en una de sus respuestas, o cómo su información visual y sus fotorreceptores e interneuronas se extraen de los estímulos luminosos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona grabaciones duraderas y de alta calidad del estudio con poco daño al medio intracelular y al muestreo de información.La característica de demostración de que esto puede afectar es crítica, ya que sus diversos pasos son difíciles de aprender a realizar correctamente sin verlos. Extraiga un microelectrodo de referencia de borosilicato filamentado o de un tubo de vidrio de cuarzo utilizando un extractor de pipeta estándar. Trate de lograr una reducción corta y gradual.Los ajustes exactos varían de un instrumento a otro. El tamaño de los poros en la punta no es crucial porque se romperá para los experimentos. A continuación, extraiga un electrodo de registro del mismo tubo de vidrio e intente conseguir un cono gradual fino de 10 a 15 milímetros de largo.En un microscopio óptico, monte el electrodo en un lado de vidrio con adhesivo múltiple y use un objetivo de aire de 40x para inspeccionar su punta. Un buen electrodo se estrecha suavemente hasta una punta invisiblemente pequeña, alrededor de la cual se pueden ver patrones de interferencia paralelos continuos más oscuros y más claros. Justo antes del experimento, rellene el electrodo de referencia con timbres de moscas, utilizando una jeringa de cinco mililitros conectada a un filtro de partículas, con una punta de plástico fina.Para experimentos con fotorreceptores, cargue el electrodo de registro con cloruro de potasio 3 molares hasta que se forme una gota en su extremo grande. Esto minimizará el ruido de la unión de líquido durante la grabación. Para trabajar con LMC histaminérgicos, llene los electrodos de registro con acetato de potasio de 3 molares y cloruro de potasio de 0,5 milimolares para minimizar el efecto sobre la batería de cloruro de la celda.Comience cargando un frasco de mosca fresca con moscas de cinco a 10 días de edad. Las moscas más jóvenes son más frágiles, pero se pueden registrar a partir de ellas. Seleccione la primera mosca para electrofisiología.Las hembras grandes son las más fáciles de trabajar. Cuando estén en el tubo de captura, aproveche su tendencia inherente a subir hacia arriba en la punta de la pipeta y tapar la punta más pequeña. A continuación, conecte una jeringa de 100 mililitros con una manguera de plástico flexible a la punta de la pipeta, que se agranda para dejar pasar una Drosophila y conecte el otro extremo a una punta de pipeta grande conectada al soporte para moscas.A continuación, exprima un pequeño volumen de aire de la jeringa para expulsar la mosca en el portamoscas. Mire a través del microscopio estereoscópico y administre suavemente más aire hasta que la cabeza de la mosca sobresalga del extremo cónico del soporte para moscas. Asegúrate de que la mosca esté firmemente atrapada por su tórax.Luego asegure la mosca con cera de abejas. Use la temperatura más baja del calentador de cera para derretir limpiamente la cera, que parecerá transparente. Si está demasiado caliente, la cera se quemará.Inmoviliza la cabeza de la mosca aplicando un poco de cera de abeja en la probóscide y el rabillo del ojo derecho, evitando la córnea. Fije estos dos puntos al soporte para moscas. Termine este paso rápidamente para evitar quemar la mosca.A continuación, ponte las gafas y fabrica un microcuchillo. Sujete una hoja de afeitar que no sea de acero inoxidable con dos soportes de hoja de agarre plano y rompa una pequeña tira de su borde afilado. Lo ideal es producir un borde afilado como una navaja que se asemeje a una aguja.Ahora, con cuidado y con gran atención a los detalles, use el microcuchillo para abrir algunos omatidios del ojo izquierdo de la mosca, como a cuatro o cinco omatidios de la cutícula dorsal justo por encima del ecuador del ojo. Esto proporcionará el paso para el microelectrodo de registro. Esto es bastante desafiante, requiere un cuchillo bien hecho y debe aprenderse con la práctica.A continuación, retire suavemente el pequeño trozo de córnea de la abertura, exponiendo la retina que se encuentra debajo. Ahora, usando el pelo fino del aplicador de vaselina, cubra rápidamente el agujero con una pequeña gota de vaselina. La gelatina tiene la ventaja añadida de reducir la capacitancia intramural de la pipeta.Evite manchar el ojo, ya que esto nubla la óptica. Cuando opere el amplificador de microelectrodos, siempre esté conectado a tierra tocando la superficie metálica de la jaula de Faraday o la mesa antivibración para evitar cargas estáticas. Asegure la mosca montada al poste de la plataforma de preparación de moscas.Gire el soporte de la mosca de modo que el ojo izquierdo de la mosca esté directamente frente al investigador. A continuación, utilice un pequeño micromanipulador para insertar suavemente el electrodo de referencia romo a través de los ocelos de la mosca en la cápsula de la cabeza. Asegúrate de que la mosca aún parezca sana y mueva sus antenas.La preparación debe ser excelente para merecer la grabación. A continuación, introduzca el microelectrodo de registro afilado en el ojo izquierdo a través de la abertura recubierta de gelatina. A medida que ingresa al tejido, la ubicación de la punta del electrodo debe ser evidente por su patrón de reflectancia.La frágil punta del electrodo debe guiarse perfectamente o se romperá, lo cual es muy desafiante. Dependiendo del tipo de celda desde el que se grabe, la cabeza de la mosca debe estar orientada de manera ligeramente diferente. Con los electrodos en su lugar, encienda el amplificador de microelectrodos.A continuación, apague la fuente de luz fría, desconéctela de la red eléctrica y conéctela a la conexión a tierra central para minimizar el ruido eléctrico inducido por el bucle de tierra. A continuación, ajuste las guías de luz de cuello de cisne para que el sistema de brazo Carden se pueda mover libremente alrededor de la mosca. A continuación, apague las luces de la habitación para poner la preparación de moscas en una oscuridad relativa.Ahora mida la resistencia del electrodo registrador en el ojo. Debe estar entre 100 y 260 megaohmios. A veces, la punta está bloqueada y se puede borrar utilizando las funciones de zumbido capacitivo y pulso de corriente del amplificador.Si eso no ayuda, use un electrodo nuevo. A continuación, ajuste el amplificador a una pinza amperimétrica o puente y ponga a cero el voltaje entre los electrodos. Después de que la mosca se haya oscurecido durante unos minutos, introduzca la punta del electrodo de registro en el ojo en pasos de 0,1 a una micra utilizando un escalón piezoeléctrico o mediante una rotación suave de la perilla de resolución fina.En cada paso, estimule el ojo con un destello de luz de uno a 10 milisegundos. Cada destello de luz causará una breve caída en el voltaje o el ERG. Cuando la punta del electrodo entra en la lámina, cerrándose en las LMC, el ERG se invierte.A continuación, proceda a tomar las medidas. Debido a que no es invasivo, el rendimiento de la señal de las células individuales se puede estudiar en su estado casi natural. La respuesta de voltaje de un fotorreceptor R1-R6 a la luz tenue y brillante se midió a 20 grados Celsius.A continuación, se comparó un fotorreceptor R1-R6 con un LMC a 25 grados centígrados. Cada uno se midió en una mosca diferente, ya que los registros intracelulares con dos microelectrodos afilados en la misma mosca son demasiado difíciles para ser viables. La repetibilidad de las respuestas se hace evidente cuando se superponen los datos.Las relaciones señal/ruido en el dominio de la frecuencia se obtuvieron transformando durante cuatro años los fragmentos de datos de señal y ruido en espectro de potencia y, a continuación, dividiendo el espectro de potencia de la señal media por el espectro de potencia de ruido medio correspondiente. El resultado puede ser extremadamente sensible a las señales en las mejores preparaciones. La técnica se puede utilizar para registrar muchas especies.Las moscas Coenocia recibieron la misma estimulación de luz naturalista y repetitiva a 19 grados centígrados. Los datos se tomaron pre y postsinápticamente de la misma mosca mediante el avance del electrodo registrador. La dinámica más rápida del registro es consistente con la naturaleza depredadora de esta especie.Una vez masterizada, esta técnica permite grabaciones siempre largas y de alta calidad si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante darse cuenta, quiero decir, es como aprender a tocar el piano. Cuanto más practiques, mejores resultados obtendrás.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las intervenciones farmacológicas, para responder a preguntas adicionales, como el papel de los neuromoduladores en la formación de las respuestas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiofísica exploraran cómo optimizar la información, la captura y la transferencia de luz, además de las reacciones bioquímicas cáusticas en la maquinaria de fototransducción y en las siguientes ciencias biológicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar a la Drosophila para experimentos intracelulares y cómo despertar las respuestas neuronales de sus fotorreceptores e interneuronas.

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Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

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