Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

El objetivo general de este protocolo es demostrar la aplicabilidad general del analizador FRET en condiciones óptimas mediante la cuantificación del contenido de azúcar en bebidas disponibles comercialmente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de detección y monitoreo de moléculas pequeñas, como el azúcar. La principal ventaja de esta técnica es que puede monitorear eficientemente una señal fresca en respuesta a moléculas pequeñas sin necesidad de fluorímetros costosos y de alta gama.

El procedimiento será demostrado por el Dr. Han de nuestro laboratorio. Primero, prepare el plásmido del biosensor fluorescente cian y amarillo específico para maltosa o sacarosa. Luego, inocule cinco mililitros de caldo Luria con una colonia individual de E. Coli DE3 e incube el cultivo a 37 grados Celsius en un incubador con agitación durante 16 horas.

A continuación, coloque un mililitro del cultivo en un matraz que contenga 100 mililitros de LB. Incube el matraz a 37 grados Celsius en un incubador con agitación hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros sea aproximadamente 0,5. Centrifugue el cultivo durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Resuspenda rápidamente el precipitado en 50 mililitros de agua destilada fría con hielo y centrifugue nuevamente durante 20 minutos.

Re-suspender el precipitado en 50 microlitros de una solución al 10 por ciento en volumen de glicerol y agua destilada fría con hielo. Agitar suavemente la mezcla hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 100. En una cubeta de electroforesis fría con hielo, combinar la mezcla con 10 nanogramos del plásmido CMY.

Electroporar la mezcla. En la cubeta, resuspender las células en un mililitro de medio SOC y luego transferirlas a un tubo redondo de 15 mililitros. Recuperar las células agitando suavemente a 37 grados durante una hora.

Siembre las células en una placa de agar LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Incube las células a 37 grados durante 12 horas. Usando un asa, transfiera una colonia individual a 10 mililitros de LB que contenga 100 microgramos por mililitro de ampicilina.

Incube la mezcla a 37 grados bajo agitación durante 12 horas para crear el cultivo semilla. Transfiera cinco mililitros del cultivo semilla a 500 mililitros de LB con ampicilina e incube las células a 37 grados en un incubador con agitación. Una vez que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,5, agregue IPTG para obtener una concentración final de 0,5 milimolar.

Después de incubar el cultivo durante 24 horas, centrifugue las células durante 20 minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el sedimento en cinco mililitros de tampón de unión. Somete las células a sonicación en hielo durante 10 segundos y luego enfríe las células durante 10 segundos.

Repita la sonicación y enfriamiento cinco veces más. Centrifugue el lisado durante 30 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro tubo de recolección.

Purifique el sobrenadante en una columna de afinidad por níquel NTA. Llene un concentrador de 10 000 milivatios con 20 mililitros de la muestra purificada. Centrifugue la muestra durante 10 minutos y luego rellene el concentrador con solución salina tamponada con fosfato al 0,8 %.

Repita este proceso con el resto de la muestra de esta manera, 20 mililitros a la vez, hasta que toda la proteína haya sido concentrada y desalada. Almacene el biosensor FRET purificado a 80 grados Celsius. Prepare una solución de 0,2 micromolar de la proteína del biosensor CMY y 0,8 % PBS como solución de detección.

Encienda un analizador portátil de FRET. Establezca la temperatura de análisis en 53 grados Celsius. Luego configure el instrumento en modo de calibración.

Llene una cubeta con PBS al 0,8 % como fondo. Precaliente la muestra a 53 grados Celsius en el analizador y luego ajuste el fondo. A continuación, llene una cubeta con la solución de detección.

Coloque la cubeta en el analizador y establezca la línea base. Sustituya la cubeta por otra que contenga la solución de detección y azúcar a una concentración de un milimolar. Ajuste la intensidad en saturación para finalizar la calibración.

Para comenzar la preparación de una muestra de bebida para el análisis de contenido de azúcar, utilizando un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros, centrifugue un mililitro de la bebida. Retire el sobrenadante con una jeringa de un mililitro y filtre el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros. Combine 0,1 mililitros de filtrado y 0,9 mililitros de PBS al 0,8 % en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.

Vortexee suavemente la mezcla para asegurar una dilución completa. Coloque cinco microlitros de la muestra de bebida diluida y 495 microlitros de la solución de detección en una cubeta. Coloque la cubeta en el analizador y precaliente la muestra a 53 grados Celsius.

Pulse el botón de configuración para medir el contenido de azúcar de la muestra. En este método, la eficiencia de FRET se mide mediante la relación de la intensidad de emisión de la proteína fluorescente amarilla respecto a la proteína fluorescente cian en el biosensor. La temperatura óptima de medición para estos biosensores CMY está entre 50 y 55 grados Celsius, ya que la diferencia en la relación de intensidad de emisión entre una solución control y una solución saturada de maltosa es máxima.

El biosensor CMY-BII se utilizó para evaluar el contenido de maltosa en tres bebidas a 53 grados. Se genera una curva de respuesta a la dosis obteniendo esta relación a diversas concentraciones de maltosa a una temperatura determinada. La relación de emisión se relaciona con la concentración de maltosa utilizando los valores obtenidos durante la calibración.

Los contenidos de maltosa medidos se muestran junto con los contenidos totales de azúcares reportados por los fabricantes de bebidas. La bebida A contenía fuentes de maltosa como arroz y cebada. En consecuencia, la cantidad observada de maltosa representa aproximadamente la mitad del contenido total de azúcares reportado.

Bebida C, una bebida deportiva, tenía un contenido muy bajo de maltosa. Al realizar este procedimiento, es importante recordar operar el dispositivo y los sensores FRET entre 50 y 55 grados Celsius. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar moléculas tan pequeñas con un analizador FRET portátil hecho a medida.