Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

El objetivo general de este protocolo es demostrar la aplicabilidad general del analizador FRET en condiciones óptimas mediante la cuantificación del contenido de azúcar de las bebidas disponibles comercialmente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la detección y el monitoreo de moléculas pequeñas, como el azúcar. La principal ventaja de esta técnica es que puede monitorear de manera eficiente una señal fresca que responde a las moléculas pequeñas sin fluorómetros costosos y de alta gama.

La demostración del procedimiento estará a cargo del Dr. Han de nuestro laboratorio. En primer lugar, prepare el plásmido biosensor fluorescente amarillo cian y amarillo específico de maltosa o sacarosa. A continuación, inocular cinco mililitros de caldo Luria con una sola colonia de DE3 E.Coli, e incubar el cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora agitadora durante 16 horas.

A continuación, coloque un milímetro del cultivo en un matraz que contenga 100 mililitros de LB. Incubar el matraz a 37 grados centígrados en una incubadora agitadora hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros sea de aproximadamente 0,5. Centrifugar el cultivo durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender rápidamente el pellet en 50 mililitros de agua destilada helada y vuelva a centrifugar durante 20 minutos.

Vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de una solución al 10 por ciento de volumen de glicerol y agua destilada helada. Agite suavemente la mezcla hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 100. En una cubeta de electroporación helada, combine la mezcla con 10 nanogramos de plásmido CMY.

Electroporate la mezcla. En la cubeta, vuelva a suspender las células en un milímetro de medio SOC y luego transfiéralas a un tubo de fondo redondo de 15 mililitros. Recupere las células agitando suavemente a 37 grados durante una hora.

Extienda las células en una placa de agar LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Incubar las células a 37 grados durante 12 horas. Usando un bucle, transfiera una sola colonia a 10 mililitros de LB que contengan 100 microgramos por mililitro de ampicilina.

Incubar la mezcla a 37 grados mientras se agita durante 12 horas para crear el cultivo de semillas. Transfiera cinco mililitros del cultivo de semillas a 500 mililitros de LB con ampicilina e incube las células a 37 grados en una incubadora agitadora. Una vez que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,5, agregue IPTG para hacer una concentración final de 0.5 milimolares.

Después de incubar el cultivo durante 24 horas, centrifugar las células durante 20 minutos. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón aglutinante. Sonicar las células en hielo durante 10 segundos y, a continuación, enfriar las células durante 10 segundos.

Repita la sonicación y el enfriamiento cinco veces más. Centrifugar el lisado durante 30 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro tubo de recolección.

Purifique el sobrenadante en una columna de afinidad NTA de níquel. Llene un concentrador de 10.000 milivatios con 20 mililitros de la muestra purificada. Centrifugar la muestra durante 10 minutos y, a continuación, volver a llenar el concentrador con solución salina tamponada con fosfato al 0,8%.

Repita este proceso con el resto de la muestra de esta manera, 20 mililitros a la vez, hasta que toda la proteína se haya concentrado y desalado. Almacene el biosensor FRET purificado a 80 grados centígrados. Prepare una solución de 0,2 micromolares de proteína biosensor CMY y 0,8% de PBS como solución de detección.

Encienda un analizador FRET de mano. Ajuste la temperatura de análisis a 53 grados centígrados. A continuación, ponga el instrumento en modo de calibración.

Llene una cubeta con 0.8%PBS como fondo. Precaliente la muestra a 53 grados centígrados en el analizador y, a continuación, configure el fondo. A continuación, llene una cubeta con solución de detección.

Coloque la cubeta en el analizador y establezca la línea de base. Sustituya la cubeta por una que contenga solución de detección y un milimolar de azúcar. Ajuste la intensidad en saturación para finalizar la calibración.

Para comenzar a preparar una muestra de bebida para el análisis del contenido de azúcar, utilizando un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, centrifugar un mililitro de la bebida. Retire el sobrenadante con una jeringa de un mililitro y filtre el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros. Combine 0,1 mililitros de filtrado y 0,9 mililitros de 0,8% de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Agite suavemente la mezcla para asegurar una dilución completa. Coloque cinco microlitros de la muestra de bebida diluida y 495 microlitros de solución de detección en una cubeta. Coloque la cubeta en el analizador y precaliente la muestra a 53 grados centígrados.

Presione el botón de ajuste para medir el contenido de azúcar de la muestra. En este método, la eficiencia de FRET se mide por la relación entre la intensidad de emisión de la proteína fluorescente amarilla y la proteína fluorescente cian en el biosensor. La temperatura de medición óptima para estos biosensores CMY está entre 50 y 55 grados centígrados, ya que la diferencia en la relación de intensidad de emisión entre una solución de control y una solución saturada de maltosa es mayor.

Se utilizó el biosensor CMY-BII para evaluar el contenido de maltosa de tres bebidas a 53 grados. Se genera una curva de dosis-respuesta a partir de la obtención de esta relación a varias concentraciones de maltosa a una temperatura dada. La relación de emisión se relaciona con la concentración de maltosa utilizando los valores obtenidos durante la calibración.

Los contenidos de maltosa medidos se muestran con los contenidos totales de azúcar informados por los fabricantes de bebidas. La bebida A contenía fuentes de maltosa como el arroz y la cebada. En consecuencia, la cantidad observada de maltosa representa aproximadamente la mitad del contenido total de azúcar notificado.

La bebida C, una bebida deportiva, tenía un contenido muy bajo de maltosa. Al intentar este procedimiento, es importante recordar operar el dispositivo y los sensores FRET entre 50 y 55 grados Celsius. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar moléculas tan pequeñas con un analizador FRET portátil hecho a medida.