Name: Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a cuantificar azúcares en bebidas usando un analizador portátil FRET con biosensores fluorescentes. Este método ofrece alta sensibilidad para monitorear maltosa sin fluorómetros costosos.

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Esta investigación fue apoyada por las subvenciones del Centro de Biología sintética inteligente del Proyecto Global Frontier (2011 a 0.031.944) y el Programa de Iniciativa de Investigación KRIBB.

1. Preparación de biosensor <ol><li> Construir el plásmido pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6, siguiendo el protocolo establecido previamente-2. </li><li> Inocular 5 ml de caldo de Luria (LB) con una única colonia de una cepa de Escherichia coli DE3 y se incuba a 37 ° C durante 16 horas con agitación. </li><li> Transferencia de 1 ml de la cultura O / N en un matraz de 500 ml que contiene 100 ml de LB y se incuba a 37 ° C en una incubadora con agitación hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD 600) alcanza 0,5 (aproximadamente 3 horas). </li><li> Recoger las células en un tubo cónico de 50 ml mediante centrifugación a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado rápidamente en cada tubo con agua 50 ml de hielo-fría destilada (DW) y se centrifuga a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado en 50 l de DW enfriado en hielo con 10% (v / v) de glicerol girando suavemente hasta que la solución (células electrocompetentes) alcanza una DO 600 </sub&gt; de 100. </li><li> Colocar la mezcla de células electrocompetentes (50 l de las células a una DO 600 de 100) y 10 ng del plásmido pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 en una cubeta de electroporación enfriada con hielo en un dispositivo de electroporación y electroporar la mezcla (18 kV / cm, 25 mF). </li><li> Rápidamente añadir medio SOC 1 ml a la cubeta y volver a suspender las células suavemente, seguido de la recuperación a 37 ° C durante 1 hora con agitación suave en un tubo de 15 ml de fondo redondo. </li><li> Difundir las células en una placa de LB que contiene 100 mg / ml de ampicilina y se incuba a 37 ° C durante 12 horas. </li><li> Aislar una sola colonia utilizando un bucle e inocular la colonia en 10 ml de LB que contiene 100 mg de ampicilina / ml a 37 ° C en un agitador durante 12 hr. </li><li> Añadir 5 ml del cultivo de siembra a 500 ml de LB que contienen 100 mg / ml de ampicilina y se incuba el cultivo en una incubadora de agitación 37 ° C. </li><li> Añadir 0,5 mM isopropílico β-D-tiogalactósido (IPTG) cuando la OD 600 alcances0,5 y se incuba el cultivo en un incubador con agitación 37 ° C durante 24 horas. </li><li> Centrifugar las células a 4500 × g durante 20 min (4 ° C) y eliminar cuidadosamente el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en tampón 5 ml de unión (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, PMSF 1 mM, EDTA 0,5 mM, y DTT 1 mM). </li><li> Sonicar las células en hielo con seis ráfagas de 10 segundos a 200-300 W, después de cada ráfaga con 10 segundos de enfriamiento. </li><li> Se centrifuga el lisado a 10.000 × g durante 30 min a 4 ° C para sedimentar los restos celulares. Transferir el sobrenadante (proteínas solubles) en un nuevo tubo de recogida. </li><li> Para lograr la purificación por afinidad de las proteínas de sensores FRET, la carga 4 ml del lisado celular aclarado sobre una columna de afinidad Ni-NTA (volumen 5 ml) y llevar a cabo un ensayo de cromatografía usando cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) 18. </li><li> Lavar la columna una vez con cinco volúmenes de columna de tampón de lavado I (tampón fosfato 50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 10 mM, pH 7,0). </li><li> Repetir la etapa de lavado con cinco volúmenes de columna de tampón de lavado II (tampón fosfato 50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,0). </li><li> Eluir la proteína sensor con cinco volúmenes de columna de tampón de elución (tampón fosfato 50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 500 mM, pH 7,0). </li><li> Para concentrar y desalar la muestra eluida, llenar concentrador (tamaño de la membrana de 10.000 MW) con hasta 20 ml de la muestra y se centrifuga durante 10 min a 3.000 x g. Vuelva a llenar concentrador con solución salina tamponada con fosfato 0,8% (PBS). Repita este paso dos veces, primero llenar el concentrador con 20 ml de muestra, y luego volver a llenar con PBS. </li><li> Recuperar el sensor de proteína concentrada y salada de-y almacenarla a -80 ° C. </li></ol> 2. Medición del contenido de azúcar utilizando el Analizador de FRET NOTA: Los detalles de la construcción analizador de FRET se describe en nuestros trabajos anteriores 7. <ol><li> Preparar una solución de detección de 0,8% de PBS que contenía 0,2M de las proteínas de los sensores. </li><li> Encienda el analizador de FRET. Presione el botón &quot;UP&quot; durante 2 segundos para calibrar la temperatura óptima. Ajuste la temperatura a 53 ° C usando los botones &quot;UP&quot; y &quot;DOWN&quot; y presione el botón &quot;SET&quot;. </li><li> Para la calibración, pulse y mantenga pulsado el botón &quot;DOWN&quot;, &quot;arriba&quot; y simultáneamente durante 2 seg. Confirmar que el panel de pantallas LED &quot;CALIB&quot; y presione el botón &quot;SET&quot;. </li><li> Coloque un 12,5 × 12,5 × 45 que contiene solamente tampón PBS en un soporte de la cubeta del analizador y presione el botón &quot;SET&quot; mm (longitud x anchura x altura) recipiente de paralelepípedo rectangular (cubeta). </li><li> Vuelva a colocar la cubeta con una solución que contiene sólo la detección (ver 2.1) y sin azúcar (maltosa / sacarosa) y pulse el botón &quot;SET&quot; para calibrar la línea de base. </li><li> Vuelva a colocar la cubeta con una solución que contiene el azúcar de detección con 10 mM y pulse la tecla &quot;SET&quot;botón. </li><li> Para determinar el contenido de azúcar de una muestra de la bebida, se puso 1 ml de la muestra de bebida en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 16.000 xg durante 1 min. NOTA: la medición de fluorescencia basada en sensores FRET tiene la ventaja de no requerir un tratamiento previo especial de la muestra debido a que sólo 1% (v / v) de la muestra se incluye en el volumen total. Sin embargo, se recomienda eliminar cualquier material que pueda afectar a la medición de fluorescencia (por ejemplo, células, partículas insolubles, lípidos, grasas o cualquier material con autofluorescencia). Además, si un ácido fuerte, base fuerte, agente de limpieza (detergente), o un agente emulsionante (emulsionante) está presente en una alta concentración y puede afectar a las propiedades del sensor biológico FRET, se debe eliminar el uso de un disolvente orgánico o una neutralizador. Por ejemplo, cuando la grasa láctea y emulsionantes se eliminan de aperitivos congeladas, las muestras se centrifugaron en un tubo de microcentrífuga a 16.000 xg durante 30 min, y el líquido between el sedimento del fondo y la capa superior de grasa láctea se extrae. A continuación se añade una cantidad igual de hexano, seguido de centrifugación a 15.000 × g durante 30 min para eliminar los lípidos. </li><li> Eliminar el sobrenadante con una jeringuilla de 1 ml y filtrar a través de un filtro de jeringa (tamaño de poro 0,2 micras). </li><li> Colocar 0,1 ml de muestra filtrada bebida en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 0,9 ml de PBS y agitar suavemente. NOTA: Es fundamental para diluir la muestra de bebidas correctamente. En este caso, la dilución 1.000 veces se llevó a cabo de manera que la concentración de azúcar caería dentro del rango dinámico del dispositivo. Recomendamos la estimación de la concentración de azúcar de destino de antemano, haciendo referencia al contenido de azúcar en la etiqueta de la bebida. </li><li> Añadir 5 l de la muestra de bebida diluido (1%, v / v) a una cubeta que contiene 0,495 ml de la solución de detección. </li><li> Colocar la cubeta en un soporte de la cubeta del analizador de FRET y precalentar la solución de la muestra a 53 ° C. </li><li> Presione el botón &quot;SET&quot; para medir el contenido de azúcar. Nota Es posible evaluar la medición de FRET usando un lector de placas multietiqueta o un espectrofotómetro de fluorescencia equipado con un dispositivo Peltier para control de temperatura mediante la lectura de la relación a 488/535 nm 7,8. Para la detección de sacarosa, siga los pasos de 1.1 a 2.12 un sensor CSY-LH 2. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo permite la cuantificación rápida y eficiente del contenido de azúcar en las muestras de bebidas, utilizando un analizador de FRET a medida 7 a una temperatura óptima para sensores FRET. El analizador se ha diseñado con un LED ultravioleta de bajo costo banda de 405 nm recientemente desarrollado como fuente de luz y dos fotodetectores con un fotodiodo de silicio. Este dispositivo es más rentable que otros fluorómetros comparables. El dispositivo mostró alta sensibilidad de detección, especialmen...

Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) se ha utilizado ampliamente como un sensor biométrico para detectar moléculas pequeñas tales como azúcares, iones de calcio, y los aminoácidos 1-4. biosensores FRET contienen proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes cian (CFP), y proteínas fluorescentes amarillas (YFPs), que están condensados ​​a ambos extremos de proteínas de unión periplásmicas (PBP). Los azúcares se unen a las PBP ubicadas en el medio del sensor FRET, causando cambios estructurales en el sensor que posteriormente altera la orientación y distancia de transición de dipolo de las dos proteínas fluorescentes en cada extremo de la PBP. Este cambio permite el análisis cuantitativo de contenido de azúcar mediante la medición de la relación de las longitudes de onda de emisión de EYFP (530 nm) y ECFP (480 nm). Debido a la alta sensibilidad, la especificidad, la capacidad de monitorización en tiempo real, y rápido tiempo de respuesta de los biosensores FRET, estos sensores son ampliamente utilizados en aplicaciones medioambientales, industriales, médicas y 5. Por otra parte, ratiommedición etric utilizando biosensores FRET tiene importantes beneficios prácticos, ya que puede ser usado para medir componentes en muestras biológicas complejas en las que la concentración de sensor no se puede controlar fácilmente y la fluorescencia de fondo está siempre presente. A pesar de estas ventajas de los sensores basados ​​en FRET para la visualización cuantitativa, los pequeños cambios estructurales con dominio incompleto de movimiento de transferencia de las proteínas fluorescentes producen una intensidad de señal inherentemente débil. Esta señal débil limita la aplicación de sensores basados en FRET para el análisis in vitro o in vivo en 6. En consecuencia, la mayoría FRET biosensores requieren el uso de equipos costosos y altamente sensible. Anteriormente, hemos desarrollado un analizador de FRET barato y portátil con capacidades similares a las de los analizadores de fluorescencia existentes 7. En este dispositivo, de bajo costo, de 405 nm banda ultravioleta diodo emisor de luz (LED) se utilizó como fuente de luz para provocar la excitación de THseñal de fluorescencia e, en sustitución de una lámpara o láser caro. El sistema de detección del analizador se centra de manera eficiente la señal de fluorescencia de disipación en dos fotodetectores con un fotodiodo de silicio. En un estudio más reciente, se demostró que la optimización de la detección de la temperatura a 50 - 55 ° C podría ampliar significativamente la señal de FRET radiométrica 8. Esta mejora de la señal-temperatura específica, junto con el analizador de FRET a medida, permite el uso de sensores FRET en aplicaciones de diagnóstico más generales con la rápida y alta sensibilidad. En este protocolo, hemos demostrado la aplicabilidad general del analizador de FRET en condiciones óptimas de temperatura FRET mediante la cuantificación del contenido de azúcar de las bebidas disponibles en el mercado. Este protocolo proporciona los detalles de la operación del dispositivo FRET, así como una breve descripción de sensor y preparación de la muestra. Anticipamos que este informe promueva la aplicación potencial de la portátilanalizador en entornos de laboratorio a pequeña escala y proporcionar una base para el desarrollo de un dispositivo de diagnóstico de bajo costo en el lugar con biosensores basados ​​en FRET.

<table><tbody><tr><td>LB</td><td>BD</td><td>#244620</td><td></td></tr><tr><td>isopropilo &beta;-D-tiogalactósido (IPTG)</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Tri-HCl</td><td>Bioneer</td><td>C-9006-1</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioneer</td><td>C-9007</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Junsei</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4</td></tr><tr><td>SOC</td><td></td><td></td><td>2% triptona, 0,5% extracto de levadura, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Recurso de glucosa</td></tr><tr><td>Q</td><td>Amersham Biosciences</td><td>17-1177-01</td><td>6 &veces; Columna de cromatografía de intercambio aniónico de 30 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>HisTrap HP1</td><td>Amersham Biosciences</td><td>29-0510-21</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo</td><td>Sigma</td><td>Z802875</td><td></td></tr><tr><td>AK&Auml; KTAFPLC</td><td>Amersham Biosciences</td><td>18-1900-26</td><td>una cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC)</td></tr><tr><td>Cary Eclipse</td><td>VarianInc</td><td></td><td>un espectrofotómetro de fluorescencia</td></tr><tr><td>VICTOR&nbsp; &nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td>un lector de placas multietiqueta</td></tr><tr><td>E. coli JM109 (DE3)</td><td>Promega</td><td></td><td>Celdas electrocompetentes</td></tr><tr><td>A (Bebida)</td><td>Corea Yakult Co. (Corea)</td><td>Birak</td><td>Bebidas fermentadas</td></tr><tr><td>B (Bebida)</td><td>Lotte Foods (Corea)</td><td>Epro</td><td>Refresco</td></tr><tr><td>C (Bebida)</td><td>Lotte Foods (Corea)</td><td>Getoray</td><td>Bebida deportiva</td></tr></tbody></table>

altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de fret

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Las recientes mejoras en la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sensores han permitido su uso para detectar varias moléculas pequeñas, incluyendo iones y aminoácidos. Sin embargo, la intensidad de señal débil innata de sensores FRET es un reto importante que impide su aplicación en diversos campos y hace que el uso de los caros, de alta gama fluorómetros necesario. Anteriormente, hemos construido un analizador de FRET de alto rendimiento rentable que puede medir específicamente la relación de dos bandas de longitud de onda de emisión (530 y 480 nm) para lograr una alta sensibilidad de detección. Más recientemente, se descubrió que los sensores FRET con las proteínas de unión periplásmicas bacterianas detectar ligandos con una sensibilidad máxima en el rango de temperatura crítica de 50 - 55 ° C. Este informe describe un protocolo para evaluar el contenido de azúcar en muestras de bebidas disponibles en el mercado utilizando nuestro analizador de FRET portátil con un sensor FRET-temperatura específica. Nuestros resultados mostraron que el precalentamiento adicionalproceso del sensor FRET aumenta significativamente la señal de relación de FRET, para permitir la medición más precisa de contenido de azúcar. El analizador y el sensor FRET medida se han aplicado con éxito para cuantificar el contenido de azúcar en tres tipos de bebidas comerciales. Anticipamos que mejora aún más la reducción del tamaño y el rendimiento de los equipos va a facilitar el uso de analizadores portátiles en entornos en los equipos de gama alta no está disponible.

Para llevar a cabo el análisis cuantitativo de contenido de azúcar utilizando el analizador de FRET, es necesario construir una curva ajustada la estimación de la concentración de azúcar blanco a partir de la relación de FRET observada. Sea r definir la relación de la intensidad de emisión de CFP en 480 nm y la intensidad de emisión de YFP genera en 530 nm (Ec. 1). <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54144/541...

Este protocolo describe la cuantificación rápida y altamente sensible de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) datos de sensor utilizando un analizador de FRET portátil a medida. El dispositivo se utilizó para detectar la maltosa dentro de un rango de temperatura crítico que maximiza la sensibilidad de detección, lo que permite la evaluación práctica y eficiente de contenido de azúcar.

Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar la aplicabilidad general del analizador FRET en condiciones óptimas mediante la cuantificación del contenido de azúcar en bebidas disponibles comercialmente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de detección y monitoreo de moléculas pequeñas, como el azúcar. La principal ventaja de esta técnica es que puede monitorear eficientemente una señal fresca en respuesta a moléculas pequeñas sin necesidad de fluorímetros costosos y de alta gama.El procedimiento será demostrado por el Dr. Han de nuestro laboratorio. Primero, prepare el plásmido del biosensor fluorescente cian y amarillo específico para maltosa o sacarosa. Luego, inocule cinco mililitros de caldo Luria con una colonia individual de E. Coli DE3 e incube el cultivo a 37 grados Celsius en un incubador con agitación durante 16 horas.A continuación, coloque un mililitro del cultivo en un matraz que contenga 100 mililitros de LB. Incube el matraz a 37 grados Celsius en un incubador con agitación hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros sea aproximadamente 0,5. Centrifugue el cultivo durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Resuspenda rápidamente

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Gota de plataformas basadas en microfluidos son candidatos prometedores para la experimentación de alto rendimiento, ya que son capaces de generar picolitros, la auto-compartimentado barcos bajo costo en las tasas de kHz. Mediante la integración con rápido, sensible y de alta resolución espectroscópica métodos de fluorescencia, la gran cantidad de información generada dentro de estos sistemas se puede extraer de manera eficiente, aprovechar y utilizar.

Métodos de detección de fluorescencia para las plataformas de las gotas de microfluidos

Demostramos FRET entre polidiacetileno conjugado polímero (PDA) y el fluoróforo unido a la superficie de liposomas de PDA para la detección de biomoléculas. Liposomas PDA también contenía moléculas receptoras en sus superficies para las biomoléculas para ser utilizados como sondas. Ligando-receptor interacciones conducen a cambios en la eficiencia de FRET entre el fluoróforo y el PDA que es la base del mecanismo de detección.

Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía es una poderosa técnica para monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas utilizando biosensores diversos como los periodistas. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes a partir de componentes disponibles en el mercado y cómo usarlo para FRET experimentos.

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

La transferencia de célula a célula de agregados de proteínas, o semillas proteopáticas, puede ser la base de la progresión de la patología en las enfermedades neurodegenerativas. Aquí, se describe un nuevo ensayo de citometría de flujo FRET que permite la detección específica y sensible de la actividad de siembra a partir de muestras recombinantes o biológicas.

Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

La detección de fluorescencia multicolor en microfluídica de gotas suele implicar sistemas de detección basados en microscopio de epifluorescencia voluminosos y complejos. Aquí describimos un esquema de detección multicolor compacto y modular que utiliza una matriz de fibras ópticas para codificar temporalmente los datos multicolor recopilados por un solo fotodetector.

Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas

Un sensor fototérmico de dispersión de luz angular (PT-AS) permite el ensayo de hemoglobina rápido y sin químicos de muestras de sangre a escala de nanolitros. Aquí se proporcionan detalles de la configuración de PT-AS y un protocolo de medición para la concentración de hemoglobina en sangre. También se presentan resultados representativos de muestras de sangre anémicas.

Un ensayo de hemoglobina rápida y libre de químicos con fototérmica angular de dispersión de luz

Se presenta un alto contenido de código abierto instrumento de análisis (HCA) que utiliza imágenes de vida de fluorescencia automatizado (Flim) para ensayar las interacciones proteína utilizando Förster transferencia de energía resonante (FRET) lecturas basadas. La adquisición de datos para este instrumento openFLIM-HCA es controlado por el software escrito en μManager y se lleva a cabo el análisis de datos en FLIMfit.

Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

Los protocolos de ensayo basados en células de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo se describen para la cuantificación simple, específica, sensible y robusta del transductor de señal fosforilada endógena y el activador de la transcripción (STAT) 1/3/4/5/6 proteínas en lisados celulares en un formato de 384 pocillos.

Ensayos de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo para la medición de proteínas STAT fosforiladas endógenas en células humanas

Este artículo presenta un método para el análisis espaciotemporal de sondas móviles basadas en la transferencia de energía de resonancia de Förster (smFRET) de una sola molécula utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio. El kit de herramientas de software recientemente desarrollado permite la determinación de trazas de tiempo smFRET de sondas en movimiento, incluida la eficiencia FRET correcta y las posiciones moleculares, como funciones del tiempo.

Análisis espaciotemporal bidimensional automatizado de sondas MÓVILES FRET de una sola molécula

Este protocolo describe un método único para detectar la unión entre compuestos y moléculas de proteínas, que ofrece las ventajas de una pérdida mínima de muestras de proteínas y una alta precisión de los datos.

Detección de la interacción proteína-umbeliferona CD40 mediante fluorescencia diferencial de barrido

Este trabajo ha discutido el protocolo para diseñar y desarrollar un dispositivo E-Eye-Enable POCT para detectar Fe, Cr, As y F en muestras ambientales, muestras biológicas y alimentos y bebidas. Se han analizado casi 2000 muestras y los resultados concuerdan con la técnica estándar de oro.

Técnica avanzada de detección E-Eye guiada por TD-DFT para la cuantificación in situ de Fe, Cr, F y As en muestras ambientales, biológicas y alimentarias

Aprende a cuantificar azúcares en bebidas usando un analizador portátil FRET con biosensores fluorescentes. Este método ofrece alta sensibilidad para monitorear maltosa sin fluorómetros costosos.

Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

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