La detección de la corteza Fragmentos Durante la germinación de esporas bacterianas
25 de junio de 2016
En este artículo, describimos un ensayo colorimétrico para detectar la presencia de azúcares reductores durante la germinación de esporas bacterianas.
El objetivo general de este protocolo paso a paso es cuantificar la abundancia de fragmentos de corteza o azúcares reductores durante la germinación de las esporas bacterianas. Este método detallará los pasos necesarios para detectar la presencia de fragmentos de corteza o azúcares reductores durante la germinación de las esporas. La principal ventaja de esta técnica es que la mayoría de los laboratorios cuentan con los reactivos y el equipo necesarios para completar con éxito el protocolo.
Comience este procedimiento colocando un tubo de esporas de Clostridium difficile en un bloque calefactor e incubándolo a 65 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, coloque el tubo en hielo. La solución de germinación es específica para la especie de espora bacteriana que se está estudiando.
Para analizar la germinación de esporas de C. difficile, utilizamos una solución de Tris 10 milimolar a pH 7,5 con 150 milimolar de cloruro de sodio, 100 milimolar de glicina y 10 milimolares de ácido taurocólico en agua desionizada. Prepare un mililitro de solución de germinación por muestra más un mililitro adicional. Antes de comenzar el ensayo, transfiera un mililitro de la solución de germinación a un tubo de microcentrífuga y déjelo a un lado.
Esto servirá como un espacio en blanco para la detección de fragmentos de corteza. A continuación, a la solución de germinación, agregue esporas a un OD600 de aproximadamente 3.0 y brevemente vórtice. Esta cantidad de esporas funciona bien para moderar la liberación de fragmentos de corteza durante la germinación de las esporas de C. difficile.
Inmediatamente después de agregar las esporas, retire una muestra de 1,2 mililitros a un nuevo tubo de microcentrífuga y colóquela en la centrífuga. Luego centrifugar a temperatura ambiente durante un minuto a 14, 000 veces G. Este es el punto de tiempo cero. Después del centrifugado, transfiera un mililitro del sobrenadante a un tubo nuevo de rosca de dos mililitros y congélelo a menos 80 grados centígrados.
Repita el proceso de tomar alícuotas, centrifugar y congelar a intervalos regulares hasta que se haya recolectado la muestra para cada punto de tiempo. Debido al tiempo requerido para la centrifugación y el muestreo, no es posible establecer puntos de tiempo de menos de dos minutos durante este procedimiento, por lo que estas muestras se toman una vez cada dos minutos durante 14 minutos. Mientras prepara las muestras de corteza, en caso de que sea necesario controlar el ácido dipicolínico, retire una muestra separada de 100 microlitros y dispense en un tubo de microcentrífuga con hielo.
También prepare muestras para generar una curva estándar con las siguientes cantidades de N-acetilglucosamina. Cero, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 y 5.000 nanomoles en solución de germinación. Después de que se haya recolectado una muestra para cada punto de tiempo, retire las muestras del congelador y liofíliclas junto con las muestras en blanco y las muestras de curva estándar.
A continuación, almacene todas las muestras a 80 grados centígrados negativos hasta su uso. El día del ensayo, resuspender las muestras liofilizadas, incluidas las muestras de control y de curva estándar, en 120 microlitros de ácido clorhídrico con fenol y beta-mercaptoetanol. A continuación, transfiera todas las muestras resuspendidas a tubos nuevos de rosca de dos mililitros.
Luego incubarlos en un baño de agua de recirculación a 95 grados centígrados durante cuatro horas. Después de la incubación, coloque las muestras en hielo hasta que se enfríen. Luego agregue 120 microlitros de hidróxido de sodio de tres molares para neutralizarlos.
A continuación, agregue 80 microlitros de una solución de bicarbonato de sodio saturado y 80 microlitros de una solución de anhídrido acético al 5% a cada muestra y vértice. A continuación, incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, transfiera las muestras al baño de agua a 95 grados centígrados durante exactamente tres minutos.
Tenga en cuenta que este paso es sensible al tiempo y los tiempos más largos pueden afectar el desarrollo de la señal aguas abajo. Retire las muestras del baño de agua y enfríelas con hielo. Agregue 400 microlitros de tetraborato de potasio al 6,54% tetrahidrato a cada tubo y vórtice.
Incubar las muestras en un baño de agua de recirculación a 95 grados centígrados durante exactamente siete minutos. Este paso también es sensible al tiempo. Retire las muestras y colóquelas en hielo durante cinco minutos.
Mientras las muestras están en hielo, prepare el reactivo de color. Disuelve 0,320 gramos de DMAB en 1,9 mililitros de ácido acético glacial. Tenga en cuenta que este reactivo es sensible al tiempo, la temperatura y la luz y no debe fabricarse con anticipación.
Después de que el DMAB se disuelva por completo, agregue 100 microlitros de ácido clorhídrico normal y agite la muestra. A continuación, añade cinco mililitros de ácido acético glacial y vuelve a vórtice. Para la reacción colorimétrica, transfiera 100 microlitros de cada corteza enfriada o muestra de control a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Agregue 700 microlitros de la solución de color recién preparada a cada muestra. Transfiera inmediatamente las muestras a un baño de agua a 37 grados centígrados e incube las muestras durante exactamente 20 minutos. Después de la incubación, transfiera 200 microlitros de cada muestra a una placa transparente de 96 pocillos.
Las muestras deben ser de color amarillo para empezar, pero cambiarán a púrpura si hay azúcar reductora, que indica la presencia de corteza. Aquí, muchas de las muestras no muestran un color púrpura visible. Sin embargo, las muestras de 250, 500 y 5.000 nanomoles parecen visualmente diferentes del nanomol cero de control negativo.
Usando un lector de placas, determine la absorbancia a 585 nanómetros. Cuando se mide en un diámetro exterior de 585 nanómetros, la señal generada a partir de las muestras estándar se ajusta mejor a una regresión lineal. Esta tabla muestra los resultados típicos utilizando los estándares de N-acetilglucosamina.
Estos datos se utilizaron para generar la curva estándar que se muestra aquí. Se realizó un ensayo de germinación en condiciones promotoras de la germinación con tampón de germinación suplementado con 100 milimolares de glicina y 10 milimolares de ácido taurocólico. En condiciones no germinativas, 100 milimolares de glicina solamente.
En ausencia de ácido taurocólico, las esporas de C. difficile no germinan y hay pocos cambios en la presencia de fragmentos de corteza en la solución. Sin embargo, en presencia de ácido taurocólico y glicina, las esporas de C. difficile germinan y liberan fragmentos de corteza en la solución. Esto se absorbe como un aumento en el OD585 con el tiempo de las muestras reaccionadas.
La cantidad de fragmentos de corteza liberados durante este ensayo se calculó utilizando una curva estándar. Como se puede ver aquí en este ensayo, la mayor parte de la corteza se hidrolizó o se liberó 15 minutos después de la exposición germinativa. Esto sugiere que la mayoría de las esporas han germinado en este período de tiempo.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar fragmentos de corteza o azúcares reductores en una solución de germinación durante la germinación de esporas bacterianas. Al intentar este procedimiento, es importante prestar mucha atención a los tiempos de reacción para que el ensayo se desarrolle correctamente.
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Descripción general
Este artículo describe un ensayo colorimétrico diseñado para detectar azúcares reductores durante la germinación de esporas bacterianas. El protocolo describe los pasos necesarios para cuantificar la presencia de fragmentos del cortex o azúcares reductores, que son cruciales para comprender la germinación de esporas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Bioquímica
- Biología celular
Antecedentes
- Las esporas bacterianas experimentan germinación, un proceso crítico para su ciclo vital.
- Los azúcares reductores desempeñan un papel importante durante este proceso.
- Comprender la dinámica de la germinación de esporas puede contribuir a la investigación microbiológica.
- Se pueden utilizar reactivos de laboratorio estándar para este ensayo.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para detectar azúcares reductores durante la germinación de esporas.
- Cuantificar la abundancia de fragmentos de cortex asociados con la germinación.
- Facilitar la investigación en biología de esporas bacterianas.
Métodos Utilizados
- Incubación de esporas de Clostridium difficile a 65 grados Celsius durante 30 minutos.
- Enfriamiento de las muestras en hielo tras la incubación.
- Uso de una solución de germinación específica para la especie bacteriana.
- Detección colorimétrica de azúcares reductores.
Resultados principales
- El ensayo detecta con éxito azúcares reductores durante la germinación de esporas.
- Se logró la cuantificación de fragmentos del cortex.
- El método es accesible para la mayoría de los laboratorios.
- Los resultados contribuyen al entendimiento de la dinámica de las esporas bacterianas.
Conclusiones
- Este ensayo colorimétrico es eficaz para estudiar la germinación de esporas.
- Proporciona información sobre los procesos metabólicos durante la germinación.
- El protocolo puede adaptarse para diversas especies bacterianas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección de la hidrólisis del fragmento de cortex proporciona una medida cuantitativa de la cinética de germinación de esporas, permitiendo descartar mecanismos en estrategias antimicrobianas dirigidas a Clostridioides difficile. Este ensayo apoya la validación del blanco al vincular la activación del receptor germinativo con la remodelación posterior del peptidoglicano, un proceso conservado relacionado con la virulencia. La lectura colorimétrica ofrece un método escalable y accesible en cuanto a reactivos para la selección inicial de inhibidores de la germinación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Mide la liberación de fragmentos del cortex como un indicador directo de la activación de esporas inducida por germinantes, lo que permite investigar la función de los receptores de germinación.
- Valor operativo: Utiliza reactivos de laboratorio estándar (por ejemplo, HCl, fenol, DMAB) y equipos comunes (centrífuga, baño de agua, lector de placas) para garantizar una amplia accesibilidad.
- Confiabilidad predictiva: Cuantifica la cinética de hidrólisis para priorizar compuestos que bloqueen la hidrólisis del cortex, un paso crítico en la patogénesis de C. difficile.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera una curva patrón utilizando N-acetilglucosamina para convertir la absorbancia a 585 nm en nanomoles de azúcares reductores, lo que permite la cuantificación absoluta.
- Valor operativo: Incluye controles en blanco y muestreos en puntos de tiempo para distinguir la señal dependiente de la germinación de la hidrólisis de fondo.
- Escalabilidad: El protocolo procesa múltiples puntos de tiempo y condiciones en paralelo, facilitando el cribado de mediana escala de bibliotecas de germinantes o candidatos inhibidores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Sistema relevante para la enfermedad: Se centra en las esporas de C. difficile, una amenaza clínica persistente en la que la germinación precede a la producción de toxinas y a las recaídas.
- Continuidad traslacional: La detección de fragmentos del córtex conecta la activación de la espora (germinación) con el crecimiento vegetativo, aportando información sobre las etapas en las que los antimicrobianos podrían intervenir.
- Reducción mecanicista de riesgos: Confirma que se requiere ácido taurocólico más glicina para lograr una hidrólisis significativa del córtex, validando la dependencia del ensayo respecto al germinante para obtener la lectura.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
Este ensayo se sitúa entre la selección de germinantes y los ensayos fenotípicos de desarrollo posterior, proporcionando un punto de control bioquímico para la compromisión de las esporas a la germinación antes de la activación metabólica o la producción de toxinas.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa si germinantes o inhibidores específicos modulan la hidrólisis del cortex, aclarando efectos específicos de la vía en la activación del esporo.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos y resueltos en el tiempo sobre la liberación de azúcares reductores, permitiendo ordenar por eficacia la germinación en bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Genera lecturas de absorbancia a 585 nm tras la derivatización con DMAB, que se correlaciona linealmente con la concentración de azúcares reductores mediante una curva patrón.
- Investigación Traducional: Relaciona la eficiencia de germinación con fenotipos posteriores como el crecimiento posterior, apoyando decisiones de avance o descarte de candidatos antiinfecciosos.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a otras especies de Clostridia o Bacillus mediante la modificación de la solución de germinación, promoviendo la estandarización entre proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una perspectiva mecanicista sobre la germinación de esporas al cuantificar un evento bioquímico clave (la hidrólisis del cortex) que precede a la reactivación metabólica.
- Valor operativo: Evita la necesidad de kits o instrumentos especializados; se basa en bloques térmicos, centrífugas y lectores de placas que son estándar en los laboratorios de microbiología.
- Valor estratégico: Permite una evaluación rápida de inhibidores de la germinación, reduciendo la inversión en dianas que probablemente no bloqueen la reactivación de esporas in vivo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas antiinfecciosos al confirmar la interacción con la diana en la etapa de germinación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de esporas anaeróbicas y en procedimientos seguros de liofilización.
- Depende del acceso a un baño de agua con recirculación, una centrífuga y un lector de placas capaz de medir absorbancia a 585 nm.
- Necesita la normalización de los lotes de esporas (normalización de OD600) y de la composición de la solución de germinación entre diferentes usuarios.
- Los pasos sensibles al tiempo (por ejemplo, acetilación, incubación con borato, desarrollo del color) deben controlarse rigurosamente para garantizar la reproducibilidad del ensayo.
- Se limita a la detección de azúcares reductores; no distingue entre fragmentos específicos del cortex y otros azúcares reductores sin una validación ortogonal.
