Name: La detección de la corteza Fragmentos Durante la germinación de esporas bacterianas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprende a detectar fragmentos de corteza y azúcares reductores durante la germinación de esporas bacterianas usando Clostridium difficile. Este ensayo colorimétrico permite cuantificar la liberación de corteza en microbiología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

El proyecto descrito es apoyado por el premio número 5R01AI116895 del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas o los Institutos Nacionales de Salud.

1. Las muestras de generación <ol><li> El calor activa C. difficile esporas a 65 ° C durante 30 minutos y almacenar en hielo. Nota: C. esporas difficile pueden ser producidos y purificados como se ha descrito previamente 7,9,10. </li><li> Preparar la solución de germinación a X + 1 ml donde X es el número de muestras que deben tomarse durante el ensayo. Nota: La solución de la germinación es específico de las especies de bacterias de esporas que se estudian. Para el ensayo de C. difficile germinación de esporas, se utilizó una solución de Tris 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glicina 100 mM y 10 mM de ácido taurocólico en agua desionizada. </li><li> Antes de comenzar el ensayo, extraer una muestra de la solución de germinación 1,0 ml sin esporas para servir como un espacio en blanco para la detección fragmento de corteza. </li><li> Añadir esporas a un OD 600 de ~ 3,0 a la solución de la germinación y el vórtice rápidamente. Nota: Para nuestros estudios de germinación en B. subtilis, se utilizó la misma OD 600 esporas como para C. difficile. Nota: Esta cantidad de esporas funcionó bien para la liberación fragmento de la corteza durante el seguimiento C. germinación de las esporas difficile. La cantidad de esporas utilizada en este ensayo se debe determinar experimentalmente para cada bacteria o cepa. </li><li> Extraer una muestra 1,2 ml inmediatamente después de la adición de las esporas y se centrifuga a temperatura ambiente durante 1 min a 14.000 x g. Este es el punto de tiempo cero. </li><li> Transferir 1,0 ml del sobrenadante de la muestra centrifugada a un tubo nuevo para el análisis de fragmento de corteza posterior. Nota: En caso de DPA deben ser supervisados, retirar una muestra de 100 l separada para la detección de DPA en la solución utilizando un ensayo basado en fluorescencia terbio 9,18,19. </li><li> Congelar la muestra recogida a -80 ° C. </li><li> Repita los pasos 1.4 y 1.5, a intervalos regulares hasta que todos los puntos de tiempo completadas. Nota: Debido al tiempo requerido para la centrifugación y el muestreo, menos puntos de tiempo THun 2 min aparte no fuera posible durante nuestro procedimiento, por lo que nuestros intervalos de muestreo fueron una vez cada 2 min durante 14 min. </li><li> Como control positivo para la reducción de la detección de azúcar y la cuantificación, incluyen las siguientes cantidades de N acetilglucosamina (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500, y 5000. Preparar estas muestras al mismo tiempo que las muestras de la corteza y de gestión junto con las muestras de la corteza de manera que la curva estándar es relevante para los datos generados por la germinación de esporas. </li><li> Después se recogen todas las muestras puntuales tiempo, liofilizar las muestras. Nota: Nos liofilizado nuestras muestras en tubos de 2 ml con tapón de rosca. </li></ol> 2. Medición de la corteza Fragmentos <ol><li> Resuspender muestras liofilizadas en 120 l de HCl 3 N suplementado con 1% de fenol y 0,5% β-mercaptoetanol. </li><li> La transferencia de las muestras resuspendidas a 2 ml tubos con tapa de rosca. Nota: Para la reproducibilidad, garantizan toda la muestra liofilizada se suspende de nuevo y se transfiere. </li> &lt;li&gt; Incubar las muestras en un baño de agua de recirculación a 95 ° C durante 4 horas. </li><li> Después de la incubación, colocar las muestras en hielo hasta que se hayan enfriado. </li><li> Neutralizar las muestras con 120 l de NaOH 3 M. </li><li> Añadir 80 l de una solución saturada de bicarbonato sódico y 80 l de una solución de anhídrido acético al 5% a cada muestra y vórtice. </li><li> Se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> La transferencia de las muestras al baño de agua a 95 ° durante exactamente 3 minutos. Nota: Este paso es el tiempo más largos tiempos sensibles y pueden afectar el desarrollo señal descendente. </li><li> Extraer muestras del baño de agua y enfriar en hielo. </li><li> Añadir 400 l de 6,54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O a cada tubo y vórtice. </li><li> Se incuban las muestras en un baño de agua de recirculación a 95 ° C durante exactamente 7 min. Nota: Este paso es el tiempo más largos tiempos sensibles y pueden afectar el desarrollo señal descendente. </li><li> retirarlas muestras y colocar en hielo durante 5 min. </li></ol> 3. Reactivo de color <ol><li> Mientras que las muestras están en hielo (paso 2,12), preparar el reactivo de color. Disolver 0,320 g de p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; el reactivo de Ehrlich) en 1,9 ml de ácido acético glacial. Nota: El reactivo es el tiempo, la temperatura y la sensible a la luz y no debe hacerse por adelantado. </li><li> Después de la DMAB se disuelve completamente, añadir 100 l de HCl y agitar 10 N. </li><li> Añadir 5 ml de ácido acético glacial y vórtice. </li></ol> 4. Reacción colorimétrica <ol><li> Transferir 100 l de cada muestra de corteza se enfrió a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir 700 l de la solución de color recién preparada a cada muestra. </li><li> Inmediatamente transferir las muestras a un baño de agua a 37 ° e incubar durante exactamente 20 minutos. </li><li> Transferir 200 l de cada muestra a una placa de 96 pocillos clara. </li><li> Cuantificar las muestras a 585 nm en un platolector. Las muestras deben comenzar en un color amarillo y una reacción positiva se desplazarán a púrpura. La corteza más presente, más profundo es el color púrpura. </li></ol>

<ol><li>Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clostridium+sporulation+programs%3A+diversity+and+preservation+of+endospore+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).</li>
<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).</li>
<li>Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+formation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Spore formation in Bacillus subtilis.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).</li>
<li>Fimlaid, K. A., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+mechanisms+regulate+sporulation+sigma+factor+activity+in+the+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes.</a> Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).</li>
<li>Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peptidoglycan+structure+of+Bacillus+subtilis+endospores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores.</a> J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).</li>
<li>Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+168+endospore+peptidoglycan+and+its+role+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation.</a> J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+and+glycine+as+cogerminants+for+Clostridium+difficile+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores.</a> J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+spore+biology%3A+sporulation%2C+germination%2C+and+spore+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins.</a> Trends Microbiol. 22 (7), (2014).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+cortex+hydrolysis+precedes+DPA+release+during+Clostridium+difficile+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination.</a> J Bacteriol. 197 (14), (2015).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+recognition+by+the+Clostridium+difficile+Germinant+Receptor%2C+CspC%2C+is+important+for+establishing+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection.</a> PLoS Pathog. 9, e1003356(2013).</li>
<li>Moir, A., Smith, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+bacterial+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Genetics of bacterial spore germination.</a> Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).</li>
<li>Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Raman+tweezers+and+quantitative+differential+interference+contrast+microscopy+for+measurement+of+dynamics+and+heterogeneity+during+the+germination+of+individual+bacterial+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores.</a> Journal of biomedical optics. 15, 056010(2010).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+that+degrade+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymes that degrade bacterial cell walls.</a> Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).</li>
<li>Park, J. T., Johnson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+submicrodetermination+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A submicrodetermination of glucose.</a> J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).</li>
<li>Thompson, J. S., Shockman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+the+Park+and+Johnson+reducing+sugar+determination+suitable+for+the+assay+of+insoluble+materials%3A+its+application+to+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls.</a> Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SleC+is+essential+for+cortex+peptidoglycan+hydrolysis+during+germination+of+spores+of+the+pathogenic+bacterium+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens.</a> J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cortex-lytic+enzyme+SleC+from+non-food-borne+Clostridium+perfringens+on+the+germination+properties+of+SleC-lacking+spores+of+a+food+poisoning+isolate%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate.</a> Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).</li>
<li>Hindle, A. A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipicolinic+acid+%28DPA%29+assay+revisited+and+appraised+for+spore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection.</a> The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).</li>
<li>Kort, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+heat+resistance+of+bacterial+spores+from+food+product+isolates+by+fluorescence+monitoring+of+dipicolinic+acid+release%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).</li>
<li>Elson, L. A., Morgan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+glucosamine+and+chondrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine.</a> The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).</li>
<li>Ramirez, N., Abel-Santos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+germination+of+Clostridium+sordellii+spores+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro.</a> J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).</li>
<li>Akoachere, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+an+in+vivo+inhibitor+of+Bacillus+anthracis+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination.</a> J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).</li>
<li>Duncan, C. L., Strong, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+medium+for+sporulation+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens.</a> Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).</li>
<li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li>
<li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li>
<li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+anthracis+SleL+%28YaaH%29+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li>
<li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Tras la estimulación, las esporas se someten el proceso de germinación pierden sus propiedades de resistencia sin la necesidad de la síntesis macromolecular. Cuando se activa la germinación de esporas, el núcleo de esporas de prensa DPA, a cambio de agua 2. Debido al alto contenido de DPA de la espora latente, el núcleo de esporas está bajo presión osmótica intenso y el peptidoglicano especializada, corteza, ayuda a prevenir el núcleo de la hinchazón actuando, presumiblemente, como una barrera a la expansión ...

Las endosporas son metabólicamente inactivos formas de bacterias que permiten a las bacterias persisten en ambientes desfavorables. En muchas bacterias formadoras de esporas, la formación de esporas es inducida por la privación de nutrientes, pero este proceso puede ser controlado por los cambios en pH, la exposición a oxígeno o otros factores de estrés 1. Si bien en su forma de esporas metabólicamente inactivos, las bacterias se resisten a la radiación UV, desecación, temperaturas más altas, y la congelación de 2. La mayor parte del conocimiento sobre el proceso de esporulación proviene de estudios en el organismo modelo, Bacillus subtilis. El proceso de esporulación comienza con la replicación del ADN y la formación de un 3,4 filamento axial. Un tabique asimétrico luego se divide la célula en dos compartimientos de tamaño desigual. El compartimiento más grande, la célula madre, envuelve el compartimento más pequeño, el preespora. Tanto la célula madre y preespora coordinar la expresión de genes para madurar la espora y la célula madre, finalmente, lisa, de soltar el Dormant de esporas en el medio ambiente que rodea 1. La estructura y composición de esporas se conserva en muchas especies bacterianas. El núcleo de esporas tiene un contenido de agua inferior a la célula vegetativa y es rica en ácido dipicolínico (DPA) 1,2. Durante la formación de esporas, DPA se bombea en el núcleo de esporas a cambio de agua. Que rodea el núcleo es una membrana de esporas interior donde, en la mayoría de las bacterias formadoras de esporas, los receptores que reconocen las pequeñas moléculas que estimulan la germinación de semillas en germinación (2) se encuentran. Situado a las afueras de la membrana interior de la espora es una capa de peptidoglicano de la pared celular. Una capa de peptidoglicano especializada (corteza) rodea el peptidoglicano de la pared celular y se compone de muchos de los mismos componentes que el peptidoglicano de la pared celular [alternando N-acetilglucosamina (NAG) y ácido N-acetilmurámico (NAM)]. Sin embargo, aproximadamente 50% de los residuos NAM en la corteza se han convertido a murámico-δ-lactama 5,6 </sarriba&gt;. Durante la germinación de esporas, estos residuos murámico-δ-lactámicos son reconocidos por las esporas de la corteza enzimas líticas (SCLEs), permitiendo así que la corteza a degradarse (un proceso esencial para completar la germinación), pero no la pared celular. Que rodea la corteza es una membrana externa y varias capas de proteínas de la cubierta 2. Controlar el proceso de germinación es de importancia crítica para las bacterias formadoras de esporas. La germinación se inicia cuando los receptores germinantes interactúan con sus respectivos semillas en germinación 2. En muchas bacterias formadoras de esporas, estas semillas en germinación son aminoácidos, azúcares, nucleótidos, iones o combinaciones de los mismos 2. C. difficile germinación de las esporas es iniciado por combinaciones de ciertos ácidos biliares, [por ejemplo, ácido taurocólico (TA)] y aminoácidos (por ejemplo, glicina) 7-10. Aunque hay diferencias entre el C. vía la germinación difficile y las vías estudiadas en otra forma esporasbacterias, tales como B. subtilis, común a todos es el requisito absoluto para degradar la corteza de esporas para permitir que una célula vegetativa a crecer a partir de la espora germinada 2,8. La degradación de la corteza se puede lograr por el SCLEs CwlJ / SleB (como se encuentra en B. subtilis) o SLEC (como se encuentra en muchos Clostridia). hidrólisis de la corteza reduce la restricción en la pared celular y la espora. Esto permite una rehidratación completa del núcleo, un paso necesario en la reactivación de muchas de las proteínas necesarias para el metabolismo celular 2. Cuando las esporas germinan, los cambios de esporas inactivas de un estado de fase-brillante a un estado de fase-oscuro y este proceso se pueden medir por un cambio en la densidad óptica (DO) a 600 11 nm. Un informe anterior sugiere que gran parte de este cambio en OD es debido a la liberación de la DPA de la espora 12. Durante nuestra reciente estudio, hemos tratado de comparar el tiempo de C. difficile germinación de esporas y seguimiento de laliberación de la DPA y la corteza fragmentos 9. Para este estudio era fundamental para controlar la liberación de fragmentos de la corteza, ya que comenzó a ser liberado por la germinación de las esporas. El ensayo colorimétrico se utiliza aquí se basa en un método para la detección de azúcares reductores con extremos desarrollaron Ghuysen et al. 13. Debido a que otros han descrito protocolos para la detección de azúcares reductores 14 o han modificado los protocolos 15, la literatura sobre este tema puede ser confuso. Aquí, un método paso a paso que detalle para la detección colorimétrica de azúcares reductores liberados de la germinación de C. esporas difficile. Aunque este estudio utiliza C. esporas difficile, los azúcares reductores liberados durante la germinación de esporas de otras bacterias formadoras de esporas son capaces de ser detectadas con este protocolo 9,16,17.

<table><tbody><tr><td>Tubo de rosca de 2,0 ml</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipeta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipeta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1.250 &#956; l puntas de pipeta</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &#956; ll puntas de pipeta</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-D-glucosamina</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido acético</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato de potasio tetrahidratado</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(dimetilamino)benzaldehído</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>fenol saturado</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Dispositivos</td><td></td><td></td>moleculares</tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua circulante calefactado Modelo</td><td>científico VWR 1136</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 placas de cultivo de tejidos transparentes de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Tubos de cultivo</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloques</td><td></td><td></td><td></td>de calor</tr><tr><td>Máquina</td> <td>de vórtice</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la detección de la corteza fragmentos durante la germinación de esporas bacterianas

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

El proceso de germinación de las endosporas en Clostridium difficile, y otros Clostridia, se está encontrando cada vez más diferente de la bacteria modelo formadora de esporas, Bacillus subtilis. La germinación es desencadenada por germinantes de moléculas pequeñas y ocurre sin la necesidad de síntesis macromolecular. Aunque existen diferencias entre los mecanismos de germinación de las esporas en las especies de Bacillus y Clostridium, un requisito común es la hidrólisis de la corteza similar al peptidoglicano que permite que el núcleo de las esporas se hinche y se rehidrate. Después de la rehidratación, puede comenzar el metabolismo y esto, eventualmente, conduce al crecimiento de una célula vegetativa. La detección de fragmentos de corteza hidrolizada durante la germinación de las esporas puede ser difícil y las modificaciones a los ensayos descritos anteriormente pueden ser confusas o difíciles de reproducir. Por lo tanto, basándonos en nuestro reciente informe utilizando este ensayo, detallamos un protocolo paso a paso para la detección colorimétrica de fragmentos de corteza durante la germinación de esporas bacterianas.

La Tabla 1 muestra los resultados típicos que usan las normas de NAG. Los datos se utilizan para generar una curva estándar. Tabla 2 muestra los resultados típicos de un ensayo de germinación en tampón de germinación suplementado con glicina 100 mM y TA 10 mM (condiciones de germinación de promoción) o glicina 100 mM sólo (condiciones no de germinación). En ausencia de TA, C. esporas difficile no germinan y hay poco cambio en la presenc...

En este artículo, describimos un ensayo colorimétrico para detectar la presencia de azúcares reductores durante la germinación de esporas bacterianas.

La detección de la corteza Fragmentos Durante la germinación de esporas bacterianas

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

El objetivo general de este protocolo paso a paso es cuantificar la abundancia de fragmentos del cortex o de azúcares reductores durante la germinación de esporas bacterianas. Este método detallará los pasos necesarios para detectar la presencia de fragmentos del cortex o de azúcares reductores durante la germinación de esporas. La principal ventaja de esta técnica es que la mayoría de los laboratorios cuentan con los reactivos y el equipo necesarios para completar el protocolo con éxito.Comience este procedimiento colocando un tubo de esporas de Clostridium difficile en un bloque térmico e incube a 65 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la incubación, coloque el tubo en hielo. La solución de germinación es específica para la especie de espora bacteriana que se está estudiando.Para evaluar la germinación de esporas de C.difficile, utilizamos una solución de Tris 10 milimolar a pH 7,5 con 150 milimolar de cloruro de sodio, 100 milimolar de glicina y 10 milimolar de ácido taurocólico en agua desionizada. Prepare un mililitro de solución de germinación por muestra más un mililitro adicional. Antes de comenzar el ensayo, transfiera un mililitro de la solución de germinación a

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Francis, M. B., et al. Detección de fragmentos de corteza durante la germinación de esporas bacterianas. J. Vis. Exp. (2016).Este video demuestra un método colorimétrico para detectar la degradación de la corteza durante la germinación de esporas bacterianas midiendo la liberación de azúcares reductores a lo largo del tiempo. Utilizando estándares de N-acetilglucosamina y muestras de puntos de tiempo, el ensayo cuantifica la concentración de azúcar a través de una reacción cromogénica...

Detección colorimétrica de la degradación de la corteza durante la germinación de esporas bacterianas

Fuente: Wen, J., Pasman, et. al., Visualización de germinosomas y la membrana interna en esporas de Bacillus subtilis . (2019)Este video demuestra el uso de microscopía de iluminación estructurada para adquirir imágenes de fluorescencia tridimensionales que revelan la organización de las proteínas de germinación dentro de la espora bacteriana.

Visualización de proteínas de germinación en la membrana interna de esporas bacterianas

Se describe un método para el seguimiento de la ruptura del endomembrane provocada por las bacterias...

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos.

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

Se desarrolló un método para identificar endosporas bacterianas de comunidades microbianas complejas para realizar estudios moleculares o de cultivo personalizados de este grupo de bacterias.

El aislamiento físico de endosporas de muestras ambientales por Targeted lisis de las células vegetativas

Este protocolo ilustra los pasos consecutivos importantes requeridos para evaluar la importancia del monitoreo de parámetros de vitalidad y procesos de reparación del ADN en la reactivación de las esporas de Bacillus subtilis después del tratamiento con plasma de baja presión por seguimiento proteínas a través del tiempo-resolved de la microscopia confocal y microscopía electrónica de barrido de reparación del ADN marcado con fluorescencia.

Investigar los efectos perjudiciales de baja presión Plasma esterilización sobre la supervivencia de vivir el Bacillus subtilis esporas usando el celular microscopia

Aquí presentamos protocolos para noveles investigadores para iniciar phenotyping del farmacológicamente importante Género bacteriano Streptomyces.

Evaluación visual y microscópica de mutantes desarrollo de Streptomyces

Smut hongos causan muchas enfermedades agrícolas devastadoras. Se dispersan como teliosporas latentes que germinan en respuesta a señales ambientales. Describiremos dos métodos para investigar cambios moleculares durante la germinación: aumento de la respiración para detectar la activación metabólica de medición y evaluación cambiar acontecimientos moleculares aislando teliosporas en etapas morfológicas distintas.

Germinación de esta investigadora mediante el análisis de Microrespiration y microdisección

Grupo de proteínas de receptor germinant en 'germinosomes' en la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis . Se describe un protocolo utilizando proteínas de super resolución microscopia y fluorescente reportera para visualizar germinosomes. El protocolo también identifica dominios de membrana interna de la espora que preferentemente se tiñen con el colorante de membrana FM4-64.

Visualización de Germinosomes y la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis

La infección de Caenorhabditis elegans por el parásito microsporidio Nematocida parisii permite a los gusanos producir descendencia que es altamente resistente al mismo patógeno. Este es un ejemplo de inmunidad hereditaria, un fenómeno epigenético poco conocido. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de gusano genéticamente tratable.

Estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de Caenorhabditis elegans de infección por microsporidios

Este protocolo se centra en el uso de citometría de flujo y perlas de recuento para cuantificar las esporas bacterianas marcadas con bromuro de etidio. El método también es eficiente para analizar el acoplamiento covalente de proteínas en la superficie de esporas intactas.

Mejora de la enumeración de esporas de Bacillus subtilis y el análisis de etiquetas en citometría de flujo

Aprende a detectar fragmentos de corteza y azúcares reductores durante la germinación de esporas bacterianas usando Clostridium difficile. Este ensayo colorimétrico permite cuantificar la liberación de corteza en microbiología.

La detección de la corteza Fragmentos Durante la germinación de esporas bacterianas

Explorar más videos