Name: La mucina en gel de agarosa de electroforesis: Western Blotting para glicoproteínas de alta peso molecular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende a separar y detectar mucinas de alto peso molecular mediante electroforesis en gel de agarosa y Western blotting. Este protocolo permite cuantificar mucinas y evaluar su estado polimérico en muestras biológicas.

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Los autores desean agradecer al Dr. John Sheehan y a la Dra. Lubna Abdullah por su orientación y tutoría que fueron fundamentales para completar este trabajo. Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (P01HL108808, UH2HL123645) y la Fundación Terapéutica de la Fibrosis Quística, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey cuenta con el apoyo de una beca de investigación temprana de NHMRC.

1. Preparar Los tampones de mucina Gel Western Blotting <ol><li> Preparar 1 litro de 50x tampón TAE (Tris-acetato-EDTA). <ol><li> En 700 ml de agua destilada (dH 2 O) añadir 242 g de base Tris (0,4 M), 57,1 g de ácido acético glacial (peso de líquido) (0,2 M) y 14,61 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (50 mM). </li><li> Ajustar el pH a 8,0 y completar el volumen hasta 1 litro con dH 2 O. </li></ol></li><li> Preparar 10 ml de tampón de carga 10x. <ol><li> Preparar 5 ml de tampón 1x TAE. Para ello, añadir 5 ml de glicerol (50%), 25 mg de azul de bromofenol (0,25%), y 100 mg de dodecilsulfato de sodio (SDS) (1%). </li></ol></li><li> Preparar 2 litros de tampón 20x de sodio citrato de solución salina (SSC). <ol><li> En 1,5 litros de H2O destilada, agregar 350,6 g de NaCl (3 M) y 176,4 g de citrato trisódico (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0,3 M). Ajustar el pH a 7,0 y se alcance un volumen de 2 litros con dH2O </li></ol></li><li> Preparar 1 litro de tampón 1x TAE-0,1% de SDS. <ol><li> Añadir 20 ml de 50x TAE a 980 ml ​​de dH2O Añadir 1 g de SDS para hacer una solución 0,1% de SDS-TAE. </li></ol></li></ol> 2. TAE-SDS en gel de agarosa Preparación <ol><li> (. Es decir, 150 ml) Verter volumen suficiente de 1x TAE-0,1 tampón SDS% en un matraz Erlenmeyer de microondas para hacer un 5 - gel 7 mm de espesor. Añadir 0,8% (1,2 g) de polvo de agarosa. </li><li> matraz de microondas en intervalos de 30 seg con agitación intermitente hasta que se disuelve por completo de agarosa (generalmente 1 - 3 minutos). Use toallas de mano caliente durante este proceso. Tenga cuidado de la ebullición mientras se agita. </li><li> Deje que la solución de agarosa se enfríe durante 5 - 10 minutos a. Nota: La solución de agarosa estará listo para ser vertido al fondo del frasco se puede dejar en la palma de la mano durante 5 segundos. </li><li> Preparar bandeja de fundición de electroforesis (10 x 15 cm) mediante el sellado de los bordes con cinta adhesiva y colocando así peine en posición. </li><li> Verter lentamente solución de agarosa en tque la fundición de la bandeja para evitar la formación de burbujas. Eliminar las burbujas utilizando una punta de pipeta. Espere a que el gel se enfríe y solidifique por completo. Una vez solidificado, retire el peine lentamente para evitar el colapso de los pocillos mediante aspiración y retire la cinta de los bordes de la bandeja. </li><li> Colocar en gel de agarosa en el cuadro de gel y llenar la unidad de electroforesis con tampón TAE 1x SDS-0,1% hasta que el gel esté completamente cubierto. </li></ol> 3. carga de la muestra y separación de electroforesis Nota: En nuestro laboratorio, que comúnmente utilizamos muestras tanto del ratón y el ser humano, incluyendo el lavado broncoalveolar (BALF; ambas especies), lavados celulares a partir de células epiteliales bronquiales humanas (HBE), y muestras de saliva y esputo humanos. Las muestras pueden ser desnaturalizadas en 6 M urea a la recogida o almacenados por períodos cortos de tiempo (6 horas) mediante la adición de cóctel inhibidor de proteinasa. <ol><li> Preparar muestras para la carga mediante la adición de 10% de colorante de carga a cada muestra (es decir., 30 l de muestra y 3l de tinte). Homogeneizar las muestras de la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Brevemente centrifugar los tubos a 5.000 rpm para recoger las gotas. </li><li> Con cuidado, cargar un volumen igual de muestras en los pocillos. <ol><li> consejos pre-húmedas y / o utilizar pipetas de desplazamiento positivo para facilitar la carga de muestras altamente viscosas. Lentamente aspirado de 80 - 90% de solución de muestra de colorante (es decir, 27 a 30 l) para evitar burbujas de pipeteo. </li><li> Lentamente carga en el fondo de los pocillos y se mueven progresivamente la punta de la pipeta hacia arriba. Para las muestras que permanecen unidas a la punta de la pipeta, dispensar en un ángulo de 45 ° y alargar recta por encima del bien o suavemente usar el lado del pozo para romper el mucosidad viscosa. No sobrecargue los pozos. </li></ol></li><li> Conectar los electrodos de la caja del gel de electroforesis el generador de energía. Asegúrese de que los electrodos están conectados correctamente (es decir., Cable rojo conectado a la salida positiva del generador) para permitir cargados negativamente mucinas para correr hacia lo positivo<html> electrodo. </li><li> Correr el gel a 80 voltios durante 90 min para un solo gel peine, o 60 a 75 min para un gel doble peine para evitar el solapamiento entre las dos filas. </li><li> APAGUE el generador de energía y desconectar los electrodos de la fuente de alimentación. </li><li> Retire cuidadosamente el gel de la caja de gel con una mano en cada lado de la bandeja de moldeo para asegurar que el gel permanece en su lugar. </li></ol> 4. Reducir en gel de agarosa para una transferencia eficaz de mucina <ol><li> Con cuidado, coloque la parte plana de gel en un recipiente de vidrio. Enjuague el gel con H2O destilada para eliminar los restos de tampón TAE-SDS. </li><li> Preparar 1 litro de tampón SSC 4x añadiendo 200 ml de 20x SSC en 800 ml de dH 2 O. Hacer 200 ml de ditiotreitol 10 mM (DTT) solución 4x SSC mediante la adición de 309 mg de la TDT fresco en 200 ml de tampón de 4x SSC. </li><li> Remojar el gel con tampón de TDT-4x SSC y la cubierta. Agite suavemente durante 20 min (10 rotaciones por minuto). Enjuague gel con TDT libre tampón SSC 4x. </li></ol>&quot;&gt; 5. Vacío conjunto secante y la transferencia de la muestra a una membrana de nitrocelulosa <ol><li> Preparar secante de vacío para la transferencia. <ol><li> Corte con cuidado la membrana de nitrocelulosa en dimensiones ligeramente más ancho que el gel (es decir., 10 x 15 cm). </li><li> Estera porosa húmeda con dH2O y colocarlo suave del lado del plano en el papel secante. </li><li> membrana de nitrocelulosa mojada con tampón SSC 4x TDT libre y colocarlo en el centro de la malla porosa. </li><li> Cubrir la estera porosa con la junta de goma, dejando la abertura de la junta precisamente alineada con la membrana de nitrocelulosa. Si la placa porosa es aún visible, ajuste cuidadosamente la membrana para asegurar queda ningún hueco entre la junta y la membrana. </li></ol></li><li> colocar cuidadosamente el gel de agarosa en la parte superior de la membrana. Asegúrese de gel se forma un sello hermético con la junta y los pocillos del gel se colocan sobre la membrana para la transferencia. <ol><li> Evitar la formación de burbujas entre la membrana y el gel. Para minimizar elformación de burbujas, chorros unas gotas de 4x SSC tampón sobre la membrana y el gel se deslizan de arriba a abajo para eliminar cualquier burbuja formadas. Evite mover el gel sobre la membrana como proteínas comenzarán a borrar inmediatamente. </li></ol></li><li> Con cuidado, cubrir el gel con tampón SSC 4x. </li><li> Iniciar la transferencia de mucina por succión. <ol><li> Girar secante de vacío y presión EN fijado en 40 - 50 mbar. Añadir unas gotas de tampón SSC 4x en el gel cada 5 - 10 minutos a para evitar que el gel se seque. transferencia de una duración de 90 min. Opcional: Al finalizar, marcar los pozos con un lápiz para la orientación. </li></ol></li><li> Deseche el gel y recuperar la membrana de nitrocelulosa utilizando pinzas de plástico en el borde de la membrana. </li></ol> 6. El bloqueo de la membrana y de detección <ol><li> Enjuague la membrana inmediatamente con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS). No deje que la membrana se seque. </li><li> Sumergir la membrana en 50 ml de 3% de leche-PBS solución amortiguadora de bloqueo y colocar en una rocker a temperatura ambiente durante 1 hr. Después de la incubación, desechar el tampón de bloqueo. </li><li> Sumergir la membrana en solución de anticuerpo primario leche-PBS 1%. Incubar la membrana en la solución de anticuerpo primario durante la noche en un agitador a 4 ° C. Después de la incubación, desechar la solución de anticuerpo primario. Diluir los anticuerpos primarios a una proporción de 1: 2000 de solución de anticuerpo a tampón de bloqueo. Nota: Para las muestras procedentes de ratones, usamos UNC 222 de conejo anti-MUC5B y de cabra anti-proteína fluorescente verde (GFP). Para las muestras procedentes de seres humanos, utilizamos anticuerpos primarios anti-H300 MUC5B y 45M1 anti-MUC5AC. </li><li> membrana Lavar 3 veces con PBS durante 10 min en un agitador. </li><li> Sumergir la membrana en solución de anticuerpo secundario leche-PBS 1%. Diluir los anticuerpos secundarios a una proporción 1: 7500 de solución de anticuerpo a tampón de bloqueo y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr en un agitador (por ejemplo, 700 anti-conejo y anti-cabra 680.). Proteger de la luz mediante la incubación de un compañero no transparententainer. Descartar la solución de anticuerpo secundario después de 1 hora. </li><li> membrana Lavar 3 veces con PBS durante 5 min. Enjuague la membrana con H2O destilada para eliminar la sal. </li><li> Leer la membrana en un sistema de fluorescencia de infrarrojos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol>

<ol><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyperconcentration+and+increased+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure.</a> J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li>
<li>Preciado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+Is+the+predominant+mucin+glycoprotein+in+chronic+otitis+media+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid.</a> Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+in+cervicovaginal+mucus+traps+HSV+and+prevents+vaginal+herpes+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).</li>
<li>Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+the+mucosal+barrier+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucins in the mucosal barrier to infection.</a> Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).</li>
<li>Thornton, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucus+glycoproteins+from+%27normal%27+human+tracheobronchial+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion.</a> Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).</li>
<li>Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpacking+a+gel-forming+mucin%3A+a+view+of+MUC5B+organization+after+granular+release%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).</li>
<li>Kesimer, M., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+analysis+of+mucin+core+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric analysis of mucin core proteins.</a> Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).</li>
<li>van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+enzyme+approach+for+the+characterization+of+glycan+modifications+on+the+C-terminus+of+the+intestinal+MUC2mucin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).</li>
<li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).</li>
<li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).</li>
<li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characterization+of+the+MUC5AC+mucin%3A+a+highly+oligomeric+glycoprotein+whether+isolated+from+cell+culture+or+in+vivo+from+respiratory+mucous+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions.</a> Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).</li>
<li>Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+glycoforms+of+the+MUC5B+mucin+in+human+respiratory+mucus.+Evidence+for+a+cysteine-rich+sequence+repeated+within+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule.</a> J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).</li>
<li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+molecular+intermediates+in+the+assembly+pathway+of+the+MUC5AC+mucin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin.</a> J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).</li>
<li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+mouse+model+demonstrates+the+protective+role+of+Muc5ac+in+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).</li>
<li>Livraghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+and+lung+pathology+due+to+mucosal+surface+dehydration+in+%7Bbeta%7D-epithelial+Na%2B+channel-overexpressing+mice%3A+role+of+TNF-%7Balpha%7D+and+IL-4R%7Balpha%7D+signaling%2C+influence+of+neonatal+development%2C+and+limited+efficacy+of+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment.</a> J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).</li>
<li>Martino, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER+stress+transducer+IRE1beta+is+required+for+airway+epithelial+mucin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).</li>
<li>Nguyen, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+beta-blockers+attenuates+inflammation+and+mucin+content+in+a+murine+asthma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).</li>
<li>Papakonstantinou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations+are+associated+with+pro-inflammatory+degradation+of+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid.</a> Chest. , (2015).</li>
<li>Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+mucin+secretion+from+human+bronchial+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de revelar.

El protocolo de transferencia de Western de mucina se describe en este vídeo combina técnicas convencionales utilizados en biología molecular para separar y transferir grandes macromoléculas, tales como ADN, con las técnicas habituales para la detección de proteínas, es decir., Inmunotransferencia. La misma técnica se podría aplicar para estudiar la biología de los glicosaminoglicanos complejos, tales como la descomposición de ácido hialurónico de alto peso molecular 18. Aunque esta técnica podría se...

Las mucinas se producen normalmente por las superficies de la mucosa que recubren las cavidades expuestas al ambiente externo (por ejemplo., Respiratorio, tracto digestivo, reproductivos, superficie ocular), así como los órganos internos (por ejemplo, páncreas, vesícula biliar, glándulas mamarias). La presencia de estas glicoproteínas mantiene la hidratación de la superficie y forma una barrera física contra los patógenos. Aunque la producción de mucina es esencial para la mucosa de la salud, hiperconcentración de mucina y / o propiedades del moco aberrantes puede conducir a la obstrucción de los conductos, la colonización bacteriana y la inflamación crónica, que puede causar daño irreversible del tejido. Una cascada de acontecimientos similares se observan en varias enfermedades, por ejemplo., Fibrosis quística 1, 2 otitis media crónica y la infección cervicovaginal 3. Por lo tanto, es importante entender el papel de las mucinas en la salud y la enfermedad y establecer protocolos de rutina para la identificación de proteínas. Hasta la fecha, Se han identificado 19 genes mucinas y codifican cadenas de polipéptidos grandes que van desde 1200 (por ejemplo., MUC1) a 22.000 (por ejemplo, MUC16) aminoácidos. La familia de genes de mucina se puede dividir en dos subtipos: las mucinas asociadas a la membrana, que participan en la señalización celular y la superficie de blindaje, y las mucinas formadoras de gel, responsable de las propiedades viscoelásticas de los geles de moco. mucinas asociadas a la membrana son en su mayoría monomérica y se adhieren a las superficies de las células a través de un dominio que atraviesa la membrana hidrófoba. Por el contrario, las mucinas formadoras de gel poseen varios -como y dominios ricos en cisteína factor de von Willebrand (vWF) que son esenciales para la formación de redes poliméricas dinámicos. Grandes glicanos están unidos a residuos de serina y treonina distribuidos por todo el apomucina. Estos oligosacáridos O-ligados densos pueden contribuir hasta 80% del peso molecular 4. enlaces disulfuro intra- e inter-moleculares que conectan monómeros de mucina asegurar la integridad de la Networ gel de mucinak. Como resultado de la glicosilación pesada y multimerización, mucinas están entre las moléculas más grandes en el mundo animal y no pueden ser analizados por electroforesis en gel estándar utilizando gel de poliacrilamida SDS-PAGE convencional y escaleras de proteínas estándar. Estos métodos se resuelven / proteínas separadas con pesos moleculares inferiores a 250 kDa, mientras que los monómeros de mucina pueden alcanzar hasta 2 MDa en el caso de MUC16. Sin embargo, las escaleras de proteínas de alto peso molecular se pueden utilizar para estudiar pequeñas monómeros de mucina (es decir., MUC1). Una variedad de técnicas se pueden aplicar para estudiar el tamaño de mucina, la conformación y la interacción. Tradicionalmente, la caracterización bioquímica de las mucinas se logra mediante la mucina aislamiento mediante centrifugación isopícnica en gradiente de densidad en un tampón de desnaturalización, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño y la inmunodetección (por ejemplo., Transferencia slot) 5. y / o dispersión de luz multiángulo dinámico proporciona información sobre el estado oligomérico de muestras de mucina ricos &lt;sup&gt; 1. Además, la centrifugación de la velocidad zonal junto con la inmunodetección y microscopía electrónica de transmisión se utiliza comúnmente para determinar la conformación macromolecular de mucinas 6. La espectrometría de masas también se utiliza para cuantificar las mucinas, detectar la escisión proteolítica y analizar oligosacárido composición 1,7,8. Tales técnicas son costosas, consume tiempo y a menudo requieren grandes volúmenes y / o altas concentraciones de muestra. La metodología descrita en el presente documento, es decir., Mucina separación por electroforesis, es reproducible, de bajo coste y se puede utilizar en estudios de alto rendimiento para proporcionar la cuantificación relativa y mucina investigar montaje polímero. Sin embargo, este ensayo requiere de alta afinidad y de alta especificidad de mucina anticuerpos que pueden no estar disponibles para mucinas raras (por ejemplo., MUC19) o ciertas especies (por ejemplo., Cerdo, hurón). Western Blot La agarosa es adecuado para resolver una amplia variedad de muestras de mucina ricos con concentraciónlas que van desde 50 mg / ml (por ejemplo., lavados de células) a 5 mg / ml (por ejemplo., esputo). Este ensayo fue introducido en la década de 1990 y sólo se realizó en pocos laboratorios especializados 9,10. Inicialmente, esta técnica ayudó a identificar subpoblaciones de monómeros de mucina en las secreciones respiratorias humanas 11,12 y confirmó el proceso de oligomerización en las células caliciformes, que consiste en la formación de dímeros en el retículo endoplasmático, seguido de multimerización dímero en el aparato de Golgi 13. Más recientemente, la generación de anticuerpos policlonales contra mucinas murinos facilitó los estudios en modelos animales pequeños (por ejemplo., Mucina, modelos de ratones desafiados con OVA βENaC, deficientes) y abrió un nuevo campo de investigación para los estudios preclínicos probar compuestos farmacológicos destinados a eliminar la mucosidad de los pulmones 14-17. Como resultado de un creciente interés en la biología de mucina y la generación de nuevo, los anticuerpos de mucina más específicos, que describen traducción de estasn la metodología para separar las mucinas por electroforesis en gel de agarosa, transferencia de vacío a nitrocelulosa y la detección fluorescente en el infrarrojo de dos colores.

<table><tbody><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T6060-1kg</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Sigma</td><td>ARK2183-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td>Sigma EDS-100g</td><td>100g</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Bromofenol Azul</td><td>Sigma</td><td>114391-5g</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SDS (Dodecil Sulfato de Sodio)</td><td>Sigma</td><td>L6026-50g</td><td>50 g</td></tr><tr><td>20x SSC (Citrato Salino Sódico) Tampón</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>1 L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Citrato Trisódico (Na3C6H5O7)</td><td>Sigma</td><td>W302600-1kg</td><td>1 kg 10</td></tr><tr><td>mM DTT (ditiotreitol)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Leche en polvo</td><td>Saco</td><td></td><td>Leche en polvo desnatada instantánea</td></tr><tr><td>Dulbecco Solución salina tamponada con fosfato (D-PBS)</td><td>Gibco lifetechnologies</td><td>14200-025</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario de cabra anti-GFP (muestras de ratón)</td><td>Anticuerpos y ensayos de Rockland</td><td>600-101-215</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>UNC 222 Anticuerpo primario de conejo anti-Muc5b (muestras de ratón)</td><td>UNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H300 Anti-MUC5B Anticuerpos primarios (muestras humanas)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20119</td><td>200 &#956; g</td></tr><tr><td>45M1 Anticuerpos primarios anti-MUC5AC (muestras humanas)</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td>100 &#956; g</td></tr><tr><td>Burro Anti-conejo 800CW Tinte</td><td>IR LI-COR Biosciences</td><td>926-32213</td><td>0.5 mg</td></tr><tr><td>Burro Anti-ratón 680LT Tinte IR</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68022</td><td>0.5 mg</td></tr><tr><td>Electroforesis Caja de Gel y Bandeja de Fundición Búho</td><td>Sistemas</td> de Separación <td></td><td></td></tr><tr><td>Caja de Alimentación</td><td>Biorad</td><td>Modelo 200/20</td><td></td></tr><tr><td>Papel de transferencia de membrana</td><td>Amersham&nbsp;</td><td>10600016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de papel y nitrocelulosa Whatman&nbsp;</td><td>GE&nbsp;</td><td>10 439 196</td><td></td></tr><tr><td>Boekel/Appligene Secante al vacío 230 v</td><td>Expotech USA</td><td>230600-2</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Sistema de fluorescencia infrarroja</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la mucina en gel de agarosa de electroforesis: western blotting para glicoproteínas de alta peso molecular

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Las mucinas, las proteínas fuertemente glicosiladas que recubren las superficies mucosas, se han desarrollado como un componente clave en la defensa innata mediante la protección del epitelio contra los patógenos invasores. La función principal de estas macromoléculas es el de facilitar la captura de partículas y la limpieza, mientras que la promoción de la lubricación de la mucosa. Durante la síntesis de proteínas, las mucinas se someten intensa O-glicosilación y la multimerización, que aumentan dramáticamente la masa y el tamaño de estas moléculas. Estas modificaciones post-traduccionales son esenciales para las propiedades viscoelásticas de moco. Como resultado de la naturaleza compleja bioquímicas y biofísicas de estas moléculas, trabajando con mucinas ofrece muchos retos que no se pueden superar por métodos de análisis de proteínas convencionales. Por ejemplo, su alto peso molecular impide la migración electroforética a través de geles de poliacrilamida regulares y su naturaleza pegajosa provoca la adhesión a un tubo experimental. Sin embargo, la investigación del papel de las mucinas en la salud(Por ejemplo., El mantenimiento de la integridad de la mucosa) y la enfermedad (por ejemplo., Hiperconcentración, mucoestasis, cáncer) ha ganado recientemente el interés y las mucinas se están investigando como una diana terapéutica. Una mejor comprensión de la producción y función de macromoléculas de mucina puede conducir a enfoques farmacéuticos nuevos, por ejemplo, inhibidores de mucina exocitosis de gránulos y / o agentes mucolíticos. Por lo tanto, los protocolos coherentes y fiables para investigar la biología de mucina son fundamentales para el progreso científico. Aquí, se describen los métodos convencionales para separar macromoléculas de mucina por electroforesis utilizando un gel de agarosa, la transferencia de la proteína en la membrana de nitrocelulosa, y detectar la señal con anticuerpos de mucina específica, así como lector de gel fluorescente en el infrarrojo. Estas técnicas son ampliamente aplicables para determinar mucina cuantificación, la multimerización y para poner a prueba los efectos de compuestos farmacológicos sobre mucinas.

Mostramos los resultados representativos de la expresión de mucina siguientes electroforesis en gel de agarosa en BALF de los pulmones de los ratones (Figura 1). En este ejemplo, se utilizó el gel de agarosa para mostrar la regulación positiva de la producción de mucina después del tratamiento de IL-13 de el modelo de ratón Tg-Muc5ac. La transferencia Western muestra una representación visual de la expresión de mucina, que puede ser utilizado para un análisis cuantitativ...

Las mucinas son glicoconjugados de alto peso molecular, con un tamaño que oscila entre 0,2 y 200 megadalton (MDa). Debido a su tamaño, las mucinas no penetran en los geles de poliacrilamida convencionales y requieren poros más grandes para su separación. Proporcionamos un protocolo detallado para la electroforesis en gel de mucina agarosa para evaluar la cuantificación relativa y estudiar el ensamblaje de polímeros.

La mucina en gel de agarosa de electroforesis: Western Blotting para glicoproteínas de alta peso molecular


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

El objetivo general de esta técnica de inmunotransferencia para glucoproteínas de alto peso molecular consiste en separar electroforéticamente las mucinas contenidas en muestras ricas en moco. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de las mucinas, como investigar el estado polimérico y las concentraciones relativas de mucinas específicas obtenidas de diversas superficies mucosas. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de establecer, tiene un costo relativamente bajo y requiere un equipo de laboratorio mínimo.Este procedimiento será demostrado por Sophia Samir, especialista en investigación de mi laboratorio. Comience el experimento preparando el gel. Vierta 150 mililitros de tampón TAE 1x con SDS al 0,1 % en un matraz Erlenmeyer apto para microondas para hacer un gel de seis milímetros de espesor y agregue 1,2 gramos de polvo de agarosa.Caliente el matraz en el microondas durante intervalos de 30 segundos con agitación intermedia hasta que el agarosa se disuelva completamente. Deje enfriar la solución de agarosa durante hasta 10 minutos. A continuación, coloque una bandeja de moldeo para electroforesis de 10 por 15 centímetros

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este artículo técnico describe un estándar occidental-blot procedimiento que utiliza la electroforesis disponibles en el mercado NuPAGE Mini-Gel sistema de Invitrogen.

Western Blot utilizando el Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

SDD-AGE es una técnica útil para la detección y caracterización de polímeros como el amiloide en las células. Aquí se demuestra una adaptación que hace que esta técnica susceptible de aplicaciones a gran escala.

La detección de la agregación amiloide de Semi-desnaturalización electroforesis en gel de agarosa-detergente

En este video, se describe la caracterización de los complejos multiproteicos (PSM) por el azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (BN-PAGE). En una primera dimensión, se dializan lisados ​​celulares están separados por BN-PAGE para identificar PSM individual. En una segunda dimensión SDS-PAGE, PSM de interés se subdividen para analizar sus componentes por inmunotransferencia.

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En este video, demostramos un método de electroforesis en gel bidimensional que separa proteínas individuales de una mezcla compleja de proteínas obtenidas de tejidos tumorales de adenoma hipofisario humano no funcional (NFPA). Las proteínas se separan en función de su carga eléctrica en la primera dimensión y se separan aún más en función de los pesos moleculares en la segunda dimensión.

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Este artículo describe un protocolo simple y rápido para evaluar el estado oligomérico de la proteína GTPasa MxA similar a la dinamina a partir de lisados de células humanas utilizando una combinación de PAGE no desnaturalizante con análisis de Western blot.

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Aquí utilizamos electroforesis en agarosa semi desnaturalización bidimensional para confirmar la presencia de fibras de amiloide como de tamaño heterogéneo y excluir la posibilidad de que la heterogeneidad de tamaño es debido a la disociación de las fibras amiloides en el gel proceso en ejecución.

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El patrón de glicosilación de un anticuerpo determina su rendimiento clínico, por lo que persisten los esfuerzos industriales y académicos para controlar la glicosilación. Dado que las campañas típicas de glicoingeniería requieren mucho tiempo y mano de obra, la generación de un protocolo rápido para caracterizar el impacto de los genes de glicosilación utilizando silenciamiento transitorio resultaría útil.

Glicoingeniería rápida de anticuerpos en células de ovario de hámster chino

Este protocolo describe varios métodos que pueden ayudar en el estudio de la biología de ATG9A, incluida la inmunofluorescencia seguida del análisis de imágenes, las consideraciones de sobreexpresión transitoria y la investigación del estado de glicosilación de ATG9A mediante Western blot.

Obtención de imágenes de ATG9A, una proteína de membrana de expansión múltiple

Aprende a separar y detectar mucinas de alto peso molecular mediante electroforesis en gel de agarosa y Western blotting. Este protocolo permite cuantificar mucinas y evaluar su estado polimérico en muestras biológicas.

La mucina en gel de agarosa de electroforesis: Western Blotting para glicoproteínas de alta peso molecular

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