Implantación y grabación de Electrorretinograma Wireless y del potencial evocado visual en ratas conscientes

El objetivo general de este procedimiento es medir las señales ERG y VEP conscientes después de la implantación quirúrgica de sondas de telemetría inalámbricas. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en la región del campo de la neurociencia, como cómo se comportan las neuronas sin la limitación de la anestesia general tanto en condiciones saludables como en estado de enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que permite el registro simultáneo de la electrofisiología de la retina y de la corteza visual en animales conscientes.

Para comenzar este procedimiento, prepare los electrodos bajo un microscopio. Para ello, desenrolle un electrodo de acero inoxidable de doble hebra con dos alicates de punta fina. Recorte una de las hebras de acero inoxidable a aproximadamente un centímetro de la punta, dejando una sola hebra más larga y recta para dar forma al electrodo anular.

A continuación, dobla la única hebra de acero inoxidable hacia sí misma y gírala para formar un anillo liso en la punta del electrodo. A continuación, dé forma a un electrodo activo ERG girando la base del bucle para formar un círculo con un diámetro de punto dos a cinco milímetros. Para los dos electrodos ERG inactivos y un electrodo inactivo VEP, el diámetro del bucle debe apuntar a ocho milímetros.

En este ejemplo, prepare un ERG activo y tres electrodos inactivos. Después de eso, enganche el electrodo activo VEP circular alrededor de un tornillo de acero inoxidable para que el electrodo descanse contra la cabeza del tornillo. A continuación, enganche los tres electrodos inactivos alrededor de un segundo tornillo de acero inoxidable.

El electrodo de tierra irá directamente a la cavidad peritoneal y no es necesario hacer un bucle en la punta. Después de afeitar y desinfectar el sitio quirúrgico de un animal anestesiado, haga una incisión de 10 milímetros en la cabeza a lo largo de la línea media entre las orejas con un bisturí quirúrgico. Luego, haz una incisión de cinco milímetros en el abdomen a través de la capa de la piel, a lo largo de la línea media debajo del esternón.

A continuación, tunelizar una cánula de cinco milímetros de diámetro por vía subcutánea, desde la incisión del abdomen hasta la incisión de la cabeza. Pase los alambres de los electrodos del tansmitter a través de la cánula desde el abdomen hasta la cabeza. Deje el electrodo de referencia con la base del transmisor.

A continuación, cubra todas las puntas de los electrodos con una gasa aséptica. A continuación, asegura la cabeza de la rata a una plataforma estereotáxica. Extienda la incisión de la frente a 30 milímetros con unas tijeras quirúrgicas.

Luego, exponga un área quirúrgica retrayendo la piel con dos suturas. Raspe el periostio que recubre el cráneo para exponer las suturas de bregma, lambda y línea media. Posteriormente, perfore dos orificios a través del cráneo en las coordenadas estereotáxicas VEP activa y ERG, VEP inactiva.

Fije los electrodos activos e inactivos con tornillos de acero inoxidable al cráneo a aproximadamente un milímetro de profundidad. Para implantar los electrodos activos ERG, utilice una sutura para retraer temporalmente el párpado superior. A continuación, inserte una cánula de calibre 16 a 21 por vía subcutánea desde detrás del ojo a través del fórnix conjuntival superior hasta la frente.

A continuación, retire la aguja guía. A continuación, pase el electrodo activo a través de un catéter de plástico desde la frente hacia el ojo. Luego, retire el catéter de plástico.

Use una sutura temporal, que se enrosca a través del bucle del electrodo para evitar que el electrodo se retraiga hacia el túnel. Después de eso, haga una incisión puntual de cinco milímetros en la conjuntiva superior un milímetro detrás del limbo. Use la disección roma para exponer la esclerótica subyacente.

A continuación, implante una sutura inmediatamente detrás del limbo con la mitad del grosor escleral y tenga cuidado de no perforar el globo ocular. A continuación, retire la sutura temporal del electrodo activo ERG. Ancle el electrodo activo ERG a la sutura de medio espesor escleral atando tres nudos consecutivos y asegúrese de que la punta del electrodo esté situada cerca del limbo para una buena relación señal-ruido.

Si es necesario, retire el cable del electrodo sobrante para que el electrodo activo no incida en la córnea. A continuación, cierre el colgajo conjuntival utilizando una o dos suturas interrumpidas para cubrir completamente el electrodo ERG. Después, retira la sutura retráctil del párpado.

Repita el procedimiento para el ojo contralateral. Ahora, aplique gel de cianoacrilato sobre el cráneo para asegurar todos los tornillos de acero inoxidable y los cables de los electrodos. Asegúrese de que los electrodos activos ERG no estén apretados antes de asegurarlos para permitir los movimientos oculares.

A continuación, cierre la incisión con suturas interrumpidas. Luego, gire el roedor para exponer el área abdominal. Extienda la incisión dérmica abdominal a 40 milímetros a lo largo de la línea alba con unas tijeras quirúrgicas.

Después de eso, haga una incisión de 35 milímetros a través de la pared muscular interna, para exponer la cavidad abdominal interna. Con dos suturas, fije el cuerpo transmisor a la pared abdominal interna del animal a la derecha y evite el contacto con el hígado. Doble el electrodo de tierra asegurándolo en un bucle con dos suturas y colóquelo, flotando libremente, en la cavidad abdominal junto con los otros cables del electrodo.

Posteriormente, cierre el peritoneo mediante una sutura continua. A continuación, cierre la incisión cutánea con suturas interrumpidas. Para el registro de señales adaptadas a la oscuridad, los animales se adaptan a la oscuridad durante 12 horas y todos los procedimientos se realizan en una habitación oscura con la ayuda de una luz roja tenue.

A título ilustrativo, las grabaciones se llevarán a cabo en condiciones normales de iluminación de la habitación. Antes de grabar, aplique anestesia tópica y gotas dilatadoras en la córnea de la rata. A continuación, guíe al animal consciente hacia un sujetador transparente hecho a medida.

Coloca la rata frente al cuenco de Ganzfeld con los ojos alineados con la abertura del cuenco. Encienda el transmisor permanente pasando un imán a menos de cinco centímetros de él. Verifique que el transmisor esté encendido verificando la luz de estado LED en la base del receptor.

Cierre la jaula de Faraday que alberga la almohadilla receptora para mejorar la relación señal/ruido. Luego, recoja señales en un rango de energías luminosas. Esta figura muestra las formas de onda ERG en ratas conscientes en el séptimo día después de la cirugía.

Las respuestas ERG se registraron en el rango de energía del estímulo con la respuesta al destello tenue en la parte inferior y el destello más brillante en la parte superior. El día 28 después de la cirugía, estas formas de onda permanecieron similares a las del día siete. Durante cuatro semanas, no hubo un efecto significativo en el tiempo para la amplitud y la sensibilidad de los fotorreceptores.

Amplitud y sensibilidad de la célula bipolar de la varilla. Amplitud de la célula bipolar del cono. Y el tiempo implícito.

De manera similar, las formas de onda VEP parecen ser comparables siete y 28 días después de la cirugía. Con parámetros de amplitud y temporización que no muestran un efecto significativo en el tiempo. Estos resultados indicaron una sólida estabilidad de la señal ERG y VEP.

Una vez dominado, el componente quirúrgico de la técnica se completará en una hora y media o dos horas. El componente de grabación consciente, si se realiza correctamente, puede completarse en 45 minutos. Siguiendo este procedimiento, también se pueden realizar otros métodos como la manipulación farmacológica o de la enfermedad.

Esto responderá a preguntas adicionales en el descubrimiento de fármacos, así como a experimentos longitudinales. Además, este procedimiento también se puede realizar en otros animales si es necesario. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo implantar quirúrgicamente y posteriormente medir señales de telemetría ERG y VEP conscientes.