Mejora Técnica Swiss-laminación para la preparación del tejido intestinal para inmunohistoquímica y análisis de inmunofluorescencia

El objetivo general de esta técnica es procesar de manera eficiente secciones largas de tejido intestinal de ratón para una tinción histológica uniforme a lo largo de su longitud. Para obtener las secciones intestinales puede haber variaciones en la tinción a lo largo de toda la longitud del intestino. Intenté utilizar la técnica estándar de balanceo suizo, pero descubrí que produce tejido intestinal que es muy rígido y no es fácil de abrir.

Con un poco de experimentación, se me ocurrió un método de fijación rápida que utiliza productos químicos menos tóxicos y que permite un rodado suizo mucho mejor del tejido intestinal. El fijador modificado se puede utilizar para fijar rápidamente otros tejidos gruesos. En preparación, eutanasiar al animal de prueba de acuerdo con el protocolo de texto y preparar el entorno quirúrgico.

Para comenzar, use pinzas de disección y tijeras para hacer una incisión lateral en el centro del abdomen aproximadamente uno o dos centímetros por debajo de la caja torácica, dependiendo del tamaño del ratón. A continuación, separa y corta suavemente la piel para exponer los músculos abdominales. A continuación, agarre y tire hacia arriba de los músculos sin sujetar ni tirar de los intestinos.

Luego, haga con cuidado una incisión inicial en los músculos abdominales y córtelos con cuidado para exponer los intestinos. Ahora identifique el colon y trácelo hasta su extremo distal donde se une al recto. Luego, con unas tijeras, seccione el colon lo más cerca posible de la abertura anal.

A continuación, encuentre dónde se une el estómago con el intestino delgado y, con unas tijeras, corte los intestinos aproximadamente a un centímetro del estómago. Ahora transfiera toda la longitud del intestino delgado libre y el colon a una placa de Petri limpia que contenga PBS. A continuación, asegure el extremo distal del colon y desenrede suavemente toda la longitud del colon, eliminando los tejidos mesentéricos adheridos.

A continuación, identifique el ciego y seccione el intestino donde el ciego se une al colon, aislando así el colon. Del mismo modo, desenredar el resto del intestino delgado de los tejidos conectivos y grasos mesentéricos adjuntos. A continuación, secciona el intestino delgado donde se une al ciego.

A continuación, se puede retirar el ciego y desecharlo. Ahora llene una jeringa de 10 mililitros con el fijador de Bouin modificado y coloque una aguja de sonda nasogástrica. Inserte la aguja aproximadamente medio centímetro en la abertura anterior de un segmento intestinal.

Mientras asegura firmemente la aguja de sonda nasogástrica dentro del segmento, enjuague lentamente el contenido del tejido con fijador. Tenga cuidado, ya que demasiada presión reventará el segmento. Si el intestino delgado parece demasiado largo para manejarlo, es posible que desee cortarlo primero en tres segmentos iguales y enjuagar cada segmento por separado.

La fijación hará que el color del segmento intestinal se vuelva opaco. A continuación, con unas tijeras, corte el segmento longitudinalmente a lo largo de la línea mesentérica y luego enjuague brevemente el segmento en un plato de PBS mientras lo mantiene abierto con pinzas. Ahora corte el intestino delgado en tres segmentos iguales, proximal, medio y distal, que corresponden aproximadamente al duodeno, el yeyuno y el íleon.

Macroscópicamente, no hay características distintivas en cada sección. Asegúrese de hacer una marca para identificar el extremo proximal desde el distal en cada segmento. A continuación, coloque un segmento con el lado lumenal hacia arriba sobre la tapa de una placa de Petri.

En el segmento de colon, identifique el lado lumenal por las crestas que atraviesan su ancho en el extremo proximal. Las regiones media y distal tienen algunas variegaciones que discurren longitudinalmente. En el intestino delgado, identifique el lado lumenal por la superficie más rugosa que marca las vellosidades.

El examen microscópico muestra que las vellosidades son más largas en las regiones proximales de cada segmento, mientras que las criptas colónicas son más cortas en las regiones proximales y son más altas en la sección media. Proceda con el enrollado suizo de los dos puntos. Con el colon abierto y el lado lumenal hacia arriba, tire de él con pinzas desde su extremo proximal hacia el borde de la placa de Petri.

Manteniendo el lado lumenal hacia arriba, sostenga el extremo proximal con las pinzas y enrolle el borde del extremo proximal alrededor de un palillo de dientes y apriete firmemente el borde envuelto contra el palillo. Luego, enrolle suave y lentamente el colon alrededor del palillo de dientes para formar un rollo suizo. Una vez que se haya enrollado toda la longitud del colon, use otro par de pinzas para deslizar cuidadosamente el rollo en un casete de procesamiento de pañuelos.

Luego, transfiera el casete a formol tamponado al 10 por ciento y déjelo incubar durante la noche a temperatura ambiente. Para enrollar un segmento de intestino delgado, abrirlo con el lado lumenal hacia arriba y tirar de él con pinzas desde su extremo proximal hacia el borde de un plato. Luego use la misma técnica que se muestra con los dos puntos para hacer el rollo suizo y fijarlo en formol.

Utilizando los métodos descritos, la tinción de HND para el intestino grueso de un ratón negro C57 6 reveló todas las porciones del colon para una evaluación histológica completa. A continuación, la preparación se utilizó para ratones que expresaban EGFP impulsado por el promotor LGR5 que es activo solo en las criptas intestinales periféricas. Este transgén EGFP solo tiene entre un 5 y un 10 por ciento de penetrancia, pero se pueden encontrar fácilmente regiones de interés.

Utilizando los mismos ratones con expresión de EGFP LGR5, se tiñeron KLF5 y KI67. Se estudiaron los primeros ratones control con expresión normal de LGR5. Las células positivas de EGFP están marcadas con flechas azules y las células negativas de EGFP están marcadas con flechas blancas.

Luego, los mismos transgenes se expresaron en un ratón knockout KLF5. La co-tinción de KLF5 y KI67 está ausente en las células madre EGFP positivas, pero permanece presente en las criptas negativas de EGFP. Claramente, la calidad de la preparación para la tinción con fuerza de flúor múltiple es muy buena.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unos 15 minutos por ratón si se recoge tanto el intestino delgado como el colon. No olvide que trabajar con el fijador de Bouin puede ser extremadamente peligroso para los ojos. Siempre se deben tomar precauciones, como la protección ocular adecuada, al realizar este procedimiento.

Gracias por mirar y mirar bien con tus experimentos.