Name: Intracerebroventricular y por inyección intravascular de partículas víricas y fluorescentes microperlas en el cerebro neonatal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Aprende a realizar inyecciones intracerebroventriculares e intravasculares de partículas víricas y microperlas fluorescentes en cerebro neonatal de ratón. Este método permite observar la distribución viral durante la fase aguda de infección en el sistema nervioso central.

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Los autores agradecen al Sr. Masaaki Kaneta, la Sra. Hiromi Suzuki y la Sra. Mitsue Kawashima (Departamento de Patología Regenerativa e Infecciosa, Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu) por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia, Subvención KAKENHI Número 23590445.

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Hamamatsu de la Escuela de Medicina. 1. Preparación de MCMV (cepa Smith) y recombinante M32 mejorada-proteína verde fluorescente (EGFP) -MCMV <ol><li> Generar recombinante M32-EGFP-MCMV acuerdo con el método de la siguiente manera (1/2 a 1/9) y como se ha descrito previamente 8. </li><li> Utilice virus recombinantes derivados de la cepa Smith de MCMV de tipo salvaje (número de acceso: U68299). Insertar EGFP (4.361 pares de bases; pb) entre 37089 y 41450 pb (M32 - M31 locus) en el genoma por recombinación homóloga MCMV. </li><li> Amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa del MCMV M32 (41.450 - 39.286 pb, dada secuencia de acompañamiento y M31 (37.089 - 39.246 pb, derecho que flanquean los loci de genes de secuencia usando los siguientes cebadores: M32, 5&#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(cebador directo), 5 &#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(Cebador inverso); M31, 5&#39;-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3&#39; (cebador directo), 5&#39;-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 &#39;(cebador inverso). </li><li> Insertar el locus M32 en el vector EGFP-expresión utilizando sitios de restricción NheI y BamHI. Inserte el locus M31 al M32-EGFP -recombinant plásmido utilizando los sitios AflII y XbaI. Escindir el M32 - EGFP - secuencia de M31 con NheI y AflII de la M32 - EGFP - plásmido de recombinación de M31 y se disuelve en H 2 O. </li><li> Transfectar la construcción escinde en los núcleos de MCMV (Smith cepa) infectados con células NIH3T3 24 horas después de la infección (hpi) usando un sistema de electroporación para inducir la recombinación homóloga. </li><li> A los 3 días después de la infección, de co-cultivo de las células con fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs no infectada) en una proporción de 1 / 1.000 en seis pocillos y la pantalla para focos EGFP-expresión de las células infectadas. </li><li> Harvest los sobrenadantes que contienen el virus de los pozos que contienen los focos fluorescentes verdes y diluir diez veces. Para la purificación, elija pozos individuales que muestran focos fluorescentes verdes. </li><li> Cuando todos los focos resultante de la expresión de EGFP pantalla infección limitativo de la dilución, la preparación de virus es puro, lo que indica que ningún virus de tipo salvaje se mantiene. Cuantificar el virus por el método de placa de ensayo como se ha descrito previamente 17. </li><li> El tratamiento de MCMV en cabinas de seguridad biológica certificadas a nivel de bioseguridad 2 con guantes y mascarilla. </li><li> Passage MCMV (Smith cepa) y MCMV recombinante en MEFs preparados a partir de 12 días de edad, los embriones de ratón ICR como se ha descrito previamente 17. </li><li> Retire las células de los sobrenadantes de cultivos de MEF infectadas mediante centrifugación a 3.000 xg durante 20 min a 16 ° C. </li><li> Ultracentrífuga los sobrenadantes durante 40 minutos a 70.000 x g. Volver a suspender las pastillas que contienen viriones en 1 ml de solución salina tamponada con Tris y transferir a un s lineal preformadogradiente orbitol (25% - 70%). Ultracentrífuga de nuevo a 70.000 x g durante 60 min 18. </li><li> Cosecha de la banda que contiene el virión con una jeringa. Se precipitan los viriones cosechados por una etapa de ultracentrifugación adicional a 70.000 xg durante 40 min. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se almacena a -80 ° C hasta que los experimentos de infección. </li><li> Cuantificar el título del virus por el método de placa de ensayo como se ha descrito previamente 19. </li><li> Visualizar la expresión EGFP de las partículas recombinantes MCMV (excitación a 489 nm, emisión a 508 nm) por microscopía de fluorescencia (Figura 1A) y la estructura de las partículas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) 8 (Figura 1B). </li></ol> 2. Preparación de las microperlas fluorescentes Rojo Nilo <ol><li> Compra carboxilo fluorescente Nilo microperlas rojos y colocar 500 l de microperlas en tubos de acuerdo con el diámetro (0.04- 0,06 m, aproximadamente 3,63 × 10 12 partículas; 0,1-0,3 micras, aproximadamente 5,75 × 10 10 partículas; y 1.7 a 2.2 micras, aproximadamente 6,85 × 10 7 partículas). </li><li> Tratar perlas con 500 l de NaOH 0,1 M durante aproximadamente 1 día para eliminar las endotoxinas y resuspender las perlas en agua estéril a temperatura ambiente. </li><li> Adsorber los granos de O / N con suero de ratón al 10% obtenido a partir de ratones C57BL / 6 a TA antes de su uso. </li><li> Para separar los agregados, vórtice las cuentas y someter a ultrasonidos antes de usar. </li></ol> 3. La inyección de ICV MCMV y fluorescentes microperlas en ratones recién nacidos <ol><li> Mantener ratones ICR embarazadas normales en una instalación de temperatura controlada bajo un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad. Los recién nacidos son designados como P 0.5 en el día de nacimiento. </li><li> Esterilizar una jeringa de 10 l y una aguja de 27 G con alcohol 70%. </li><li> Cargar la solución de inyección (5 l) que contiene MCMV o micro fluorescenteperlas en la aguja tirando con cuidado el émbolo de la jeringa. </li><li> Restringir ratón neonatal (P 0,5), poniendo el ratón sobre hielo durante 3 - 4 min. Una vez que el animal está bajo anestesia, utilice el método de respuesta toe-pinch para determinar la profundidad de la anestesia. </li><li> Marcar el sitio de la inyección con una pluma de laboratorio no tóxico en un lugar aproximadamente 0,7 a 1,0 mm lateral a la sutura sagital y 0,7 a 1,0 mm caudal desde el bregma neonatal (Figura 2A). </li><li> Insertar la aguja 2 mm de profundidad, perpendicular a la superficie del cráneo en el sitio de inyección marcada. Para referencia, marcar 2 mm de la punta de la aguja con un fabricante no tóxico. </li><li> Inyectar lentamente 5 l de MCMV (aproximadamente 5 × 10 5 PFU) en el ventrículo lateral sin abrir el cuero cabelludo (Figura 2B). </li><li> En otro grupo de ratones, inyectar una solución que contiene 5 l microperlas fluorescentes (0,1-0,3 micras, aproximadamente 5,75 x 10 8 partículas) porel mismo método. </li><li> extraer la aguja lentamente 10 - 20 seg después de suspender el movimiento del émbolo para evitar el reflujo. </li><li> Para recuperar, mantener a los ratones durante 5 - 10 minutos a en un recipiente caliente hasta que el movimiento y la capacidad de respuesta en general se restauran. </li><li> Cosechar los cerebros como se describe en la sección 5 en una serie de puntos de tiempo (3, 12, 24, 48 y 72 h) después de la inyección. </li></ol> 4. IV Inyección de MCMV o fluorescentes microperlas en ratones recién nacidos <ol><li> Restringir ratón neonatal (P 0,5), poniendo el ratón sobre hielo durante 3 - 4 min. </li><li> Usar una jeringa de 1 ml con una aguja de 35 G para llevar a cabo la inyección intravenosa de MCMV en P 0,5 neonatos. </li><li> Use un transiluminador (buscador de la vena) para visualizar la vena temporal superficial (facial). Antes de la inyección, asegurar el neonato al transiluminador usando cinta quirúrgica (Figura 2C). </li><li> Si bien usar lentes de aumento (1,5 veces), infundir lentamente 50 l de MCMV (aproximadamente 5,45 ×; 10 9 partículas) o microperlas fluorescentes (0,04 - 0,06 m, aproximadamente 3,63 × 10 11 partículas; 0,1 - 0,3 micras, aproximadamente 5,75 × 10 9 partículas; y 1,7 - 2,2 micras, aproximadamente 6,85 x 10 6 partículas) en la vena temporal superficial (Figura 2D). </li><li> Después de retirar la aguja, utilice una gasa que contiene 70% de alcohol para aplicar presión en el punto de inyección hasta que cesa la hemorragia. </li><li> Dar al recién nacido aproximadamente 5 minutos en un recipiente caliente para recuperarse antes de devolverlo a la jaula. </li><li> Cosechar los cerebros como se describe en la sección 5 en una serie de puntos de tiempo (3, 12, 24 y 72 horas) después de la inyección. </li></ol> 5. Preparación del cerebro muestra de tejido para las secciones de parafina <ol><li> Coloque los neonatos inyectados en un pequeño plato de plástico en hielo picado. </li><li> Una vez que el animal está bajo anestesia, utilice el método de respuesta toe-pinch para determinar la profundidad de anesthesI a. </li><li> Hacer una corte centrales o dos finales horizontales finales a través de la caja torácica para abrir la cavidad torácica. </li><li> Hacer un corte en el atrio con unas tijeras afiladas. Infundir solución al 4% de paraformaldehído (PFA) en la aurícula. Detener la perfusión cuando se observan movimientos espontáneos (danza PFA) y el color aligerado del hígado. No Exsanguinate. </li><li> Diseccionar el recién nacido (como se describió anteriormente 20) retirando primero el cabezal con un par de tijeras. </li><li> Se practica una incisión en la línea media a lo largo del tegumento desde el cuello hasta la nariz para exponer el cráneo. </li><li> Coloque la punta de un par de tijeras de iris en el foramen magnum, por un lado, deslizando con cuidado a lo largo de la superficie interna del cráneo. </li><li> Hacer un corte que se extiende hasta el borde distal de la superficie del cráneo posterior, y hacer un corte idéntico en el lado contralateral. Despejar el cráneo alrededor del cerebelo. </li><li> Con cuidado, pelar el cráneo en un lado para evitar daños en el cerebro. Repita esteprocedimiento en el otro lado del cerebro. </li><li> Usando una espátula, cortar los bulbos olfatorios y conexiones nerviosas largo de la superficie ventral del cerebro. </li><li> separar suavemente el cerebro de la cabeza, el recorte de cualquier dura que todavía conectar el cerebro en el cráneo con unas tijeras, y retirar el cerebro. </li><li> Coloque el cerebro en un vial de fijador que contiene 4% PFA al menos 10 veces el volumen del cerebro durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Deshidratar el tejido a través de una serie de baños de etanol graduadas para desplazar el agua, y luego infiltrarse con cera de parafina, formando un bloque. Cortar el bloque de parafina con un microtomo en rodajas 4 m de espesor 21. </li><li> Desparafinar y rehidratar las diapositivas de los cerebros infectados 22. Proceder a la hibridación in situ de secciones incluidas en parafina. </li></ol> 6. Preparación de Tejido Cerebral de ejemplo para las secciones congeladas <ol><li> Retire el cerebro siguiendo los pasos descritos en 5.1 a 5.11. </li><li> Para observar las microperlas fluorescentes y M32-EGFP-MCMV, coloque el cerebro resecado en criomoldes de fondo plano. Añadir medio de inclusión para cubrir completamente la muestra de cerebro. Snap congelar los criomoldes en hexano n pre-enfriada (-80 ° C), utilizando pinzas para sujetar el borde de las criomoldes antes de instalarla en el mandril. </li><li> Para el corte, coloque el bloque de tejido congelado en el mandril criostato enfriado previamente. Transferir el tejido congelado con el mandril en una cámara de criostato y bajar la temperatura a entre -10 y -20 ° C, y cortar las rodajas de aproximadamente 8-10 m de espesor 23. </li><li> Fijar las secciones con cytofixative (mezcla de alcohol isopropílico y polietilenglicol) mediante pulverización. Deje secar al aire las secciones durante 30 minutos a temperatura ambiente inmediatamente después de la pulverización, y almacenar a - 80 ºC hasta su uso posterior. </li><li> Equilibrar las secciones de nuevo a temperatura ambiente y lavar tres veces con PBS. </li><li> Manchar las secciones con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con Griffonia simplicifolia isolectina B4 en una concentración de 1: 100 durante 10 minutos en PBS a temperatura ambiente (Figura 5) o con anticuerpo CD31 conjugado con PE a una concentración de 1: 100 durante 30 minutos en PBS a temperatura ambiente (Figura 6). </li><li> Se lavan las secciones con PBS tres veces. </li><li> Después del lavado, tinción de las secciones con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar los núcleos celulares. Montar las secciones de reactivo anti-fade y DAPI imagen (excitación a 345 nm, emisión a 455 nm), EGFP (excitación a 489 nm, emisión a 508 nm), y el rojo Nilo (excitación a 553 nm, emisión a 637 nm) con un microscopio de fluorescencia (Figuras 3, 5, 6). </li></ol> 7. La hibridación fluorescente in situ (FISH) para las secciones incluidas en parafina <ol><li> Preparar el FISH sonda marcada directamente con fluoróforo para el ADN de hibridación in situ por traslado de cortes utilizando un cromosoma artificial bacteriano que contiene el conjunto MCMV ADN Genome (pSM3fr) 19. La concentración de la sonda de FISH es 0,1 g / l. </li><li> Desparafinar y rehidratar las diapositivas de los cerebros infectados 22. </li><li> Tratar las secciones de tejido con RNasa (100 mg / ml en PBS) para detectar el ADN viral. </li><li> Realizar la recuperación de antígenos con un NP40 0,05%, 0,01 M de tampón de citrato (pH 6,0) a 95-98 ° C durante 20 min. Enfriar los desliza hacia abajo a TA durante 20 min. </li><li> En una cubeta de tinción Coplin vidrio, lavar los portaobjetos en agua pura tres veces durante 2 minutos cada vez. Realizar un paso de recuperación de antígeno adicional con una pepsina 0.06%, 0.01 solución de HCl N durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Se lavan los portas tres veces en agua pura durante 2 minutos cada vez en una cubeta de tinción Coplin vidrio. </li><li> Deshidratar las secciones de tejido de nuevo mediante la transferencia de las diapositivas de 70% de etanol, a 85% de etanol y, a continuación, a 100% de etanol. </li><li> Para preparar 10 ml de tampón de hibridación, la mezcla de 1,25 ml en sales de hibridación in situ (3 M NaCl, 100 mM Tris-HCl PH 8,0, 100 mM de fosfato de sodio pH 6,8, EDTA 50 mM) con 5 ml de formamida desionizada, 2,5 ml 50% de sulfato de dextrano, 250 l 50x solución de Denhardt, 125 l 100 mg / ml tRNA, y 875 l H 2 O. </li><li> Diluir la sonda de ADN marcado directamente con fluoróforos que reconocen todo el genoma MCMV al azar en el tampón de hibridación. El volumen final debe ser de 10 l (tampón de hibridación 7 l, 1 l de sonda (0,1 mg / l), y 2 l de agua destilada). </li><li> Añadir la mezcla de sondas (10 l) a cada diapositiva y cubrir con un cubreobjetos (15 x 15 mm). Sellar el cubreobjetos con cemento de goma. Desnaturalizar la mezcla de sonda durante 5 minutos a 85 ° C, y completar la etapa de hibridación O / N a 42 ° C. </li><li> Se lavan los portas con un 0,3% de NP40, SSC 0,4x a 73ºC durante 2 minutos; con 0,1% de NP40, 0,4 x SSC a 73 ° C durante 1 min; y con 2x SSC dos veces. </li><li> Contratinción los núcleos con DAPI (10 ng / ml) y cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos. </li><li> Montarlas secciones de reactivo anti-fade y DAPI imagen (excitación a 345 nm, emisión a 455 nm) y EGFP (excitación a 489 nm, emisión a 508 nm) con un microscopio de fluorescencia (Figura 4). </li></ol>

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<li>Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+and+intravenous+deliveries+are+not+comparable+in+terms+of+drug+efficacy+and+cell+distribution+in+neonatal+mice+with+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia.</a> Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. (91), e51863(2014).</li>
<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28ICV%29+and+intravenous+%28IV%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En modelos animales, ICV, intraperitoneal, placenta directa, e infecciones IV se han utilizado para estudiar la patogénesis de la encefalitis viral. Nos centramos en los modelos de ICV e inyección IV de ratones recién nacidos por la simplicidad de los procedimientos y el beneficio de la inyección directa de partículas en la región de destino. Aunque la infección intraperitoneal es un método fácil, partículas virales propagan por vía sistémica a través de un proceso indirecto 5,24. infección placentaria direct...

Cuando se estudia la encefalitis viral, la distribución inicial de las partículas virales es muy importante para comprender la patogénesis de la enfermedad y para identificar dianas virales en el cerebro. La mayoría de los virus varían en tamaño de 20 a 300 nm, aunque la pandoravirus es de más de 700 nm de tamaño 1. La distribución de las partículas virales en la fase aguda de la infección puede depender del tamaño de las partículas, la distribución de los receptores celulares, o la afinidad de los receptores celulares en busca de virus. En modelos animales, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, placentarios directa, y por vía intravenosa (IV) infecciones se han utilizado para estudiar la patogénesis de la encefalitis viral. ICV inoculación con virus se utiliza a menudo para establecer infecciones del sistema nervioso central (SNC) en ratones. Los estudios que utilizan esta técnica informan infección generalizada, particularmente de las células en las zonas periventriculares y en las regiones del cerebro en contacto directo con el líquido cefalorraquídeo (CSF), similar a los efectos de ventriculoencefalitis viral. El pequeño tamaño de virus adeno-asociado (AAV) partículas (20 - 25 nm de diámetro) facilita su difusión por todo el cerebro en las infecciones ICV 2-4. Intraperitoneales 5, 6 placentarios directa, y las inyecciones IV 7 representan administración sistémica hematógena. La penetración de partículas virales a través de la barrera hematoencefálica (BBB) ​​permite a llegar a la parénquima del cerebro neonatal, que representa nódulos microgliales difusas 8,9. El citomegalovirus (CMV) es un virus común que pertenece a la familia de los virus herpes. En los Estados Unidos, el 50% - 80% de las personas han tenido la infección por CMV por los 40 años las infecciones por CMV rara vez son perjudiciales, pero pueden causar enfermedades en pacientes inmunocomprometidos y los fetos. De todos los partos, 0,2% - 2% nacen con CMV 10, dando lugar a síntomas graves, como microcefalia, calcificación periventricular, hipoplasia cerebelosa, microftalmía, y la atrofia del nervio óptico 11,12. Por otra parte, el retraso mental, pérdida de la audición neurosensorial, defectos visuales, convulsiones y la epilepsia se presentan en aproximadamente el 10% de los lactantes infectadas por CMV no fatalmente 13,14. disfunción del SNC es el síntoma característico más común del CMV anomalía congénita. Más niños están desactivadas de forma permanente cada año por CMV congénito que por el síndrome de Down, síndrome de alcoholismo fetal, o espina bífida 15. No hay vacunas contra el CMV disponibles en la actualidad, pidiendo una necesidad de una vacuna segura y eficaz. El estudio de la interacción de las partículas de CMV con sus receptores en la fase más temprana de la infección es importante para entender el efecto de la vacunación. Ventriculoencefalitis y nódulos microgliales difusas son las dos principales características patológicas de la encefalitis por CMV 16. Ha sido incierto cómo las partículas de CMV (150 - 300 nm) se extienden a través del cerebro en la fase aguda de la infección de unand cómo la distribución de los receptores celulares y su afinidad por los virus contribuyen a la propagación viral. Kawasaki et al. Han evaluado ICV y IV infecciones desde la perspectiva de la distribución de partículas y sus receptores (β1 integrina) en la fase más temprana de la infección. Hemos encontrado que la difusión de partículas de CMV y la expresión de la integrina β1 se correlaciona bien en la fase más temprana de la infección en tanto ICV e infecciones IV 8. infección ICV es un modelo de ventriculoencefalitis e infección IV es un modelo de nódulos microgliales difusas. El estudio de la dinámica de las partículas virales o fluorescentes daría información útil sobre el efecto del tamaño de partícula, las interacciones virales con receptores celulares, y el mecanismo de penetración de la BHE en el cerebro. El siguiente protocolo se podría utilizar para investigar cualquier infección viral y el vector viral en el SNC.

<table><tbody><tr><td>Tris; tris(hidroximetil)- aminometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6791</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1758</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vector&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1876</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Rojo Nilo 0.04 - 0.06</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-00556-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Rojo Nilo 0.1 - 0.3</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-0256-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Rojo Nilo 1.7 - 2.2</td><td>Spherotech, inc.&nbsp;</td><td>FP-2056-2</td><td></td></tr><tr><td>10% suero de ratón</td><td>DAKO&nbsp;</td><td>X0910</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 ratón</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratón ICR</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de microlitro modificadas (serie 7000)</td>Aguja de calibre 35 de <td>la compañía</td><td></td><td></td>Hamilton</tr><tr><td></td><td>Saito Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wee Sight Transilluminator</td><td>Phillips Healthcare</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet(R) P-40</td><td>Nacalai</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>tampón de citrato (pH 6) x 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pepsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>dojindo</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>TCI</td><td>F0045</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867-5G</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt's Solución (50x)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Levadura ARNt (10 mg/ml)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>SSC 20x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus glass</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>12-55-18</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeep II</td><td>Nippon Shoji Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Griffonia simplicifolia isolectina B4</td><td>Vector laboratories, Inc.</td><td>L1104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD31 (PECAM-1) PE</td><td>ebioscience</td><td>12-0311</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&nbsp; </td><td>Oro ThermoFishcer sceintific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>BIOREVO</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000E</td><td></td></tr></tbody></table>

intracerebroventricular y por inyección intravascular de partículas víricas y fluorescentes microperlas en el cerebro neonatal

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

En el estudio de la patogénesis de la encefalitis viral, el método de infección es crítica. La primera de las dos principales vías de infección en el cerebro es la vía hematógena, que implica la infección de las células endoteliales y pericitos del cerebro. La segunda es la vía intracerebroventricular (ICV). Una vez dentro del sistema nervioso central (CNS), los virus pueden propagarse al espacio subaracnoideo, meninges, y el plexo coroideo a través del líquido cefalorraquídeo. En modelos experimentales, las etapas más tempranas de la distribución viral SNC no están bien caracterizadas, y no está claro si están infectadas inicialmente sólo ciertas células. Aquí, hemos analizado la distribución de partículas de citomegalovirus (CMV) durante la fase aguda de la infección, llamada viremia primaria, después de la inyección ICV o intravascular (IV) en el cerebro del ratón neonatal. En el modelo de inyección ICV, se inyectaron 5 l de CMV murino (MCMV) o microperlas fluorescentes en el ventrículo lateral en el midpoint entre el oído y el ojo usando una jeringa de 10 l con una aguja de 27 G. En el modelo de la inyección IV, se usó una jeringa de 1 ml con una aguja de 35 G. Un transiluminador se utiliza para visualizar la vena superficial temporal (facial) del ratón neonatal. Infundido 50 l de MCMV o microperlas fluorescentes en la vena temporal superficial. Los cerebros se recogieron a diferentes puntos de tiempo después de la inyección. Genomas MCMV se detectaron utilizando el método de hibridación in situ. microperlas fluorescentes o proteína fluorescente verde que expresan partículas MCMV recombinantes se observaron por microscopía fluorescente. Estas técnicas se pueden aplicar a muchos otros patógenos para investigar la patogénesis de la encefalitis.

En estudios sobre la patogénesis de la encefalitis viral, el método de infección es importante. La ruta hematógena representa una infección aguda de las células endoteliales y pericitos del cerebro, mientras que la ruta ICV representa una infección aguda a través de la difusión de CSF a través del espacio subaracnoideo, alcanzando a las meninges y el plexo coroideo. Para el análisis de la primera distribución de partículas en la encefalitis aguda, hibridación in situ pa...

Aquí, describimos un método simple de inyección intracerebroventricular e intravascular de partículas virales o microperlas fluorescentes en el cerebro de ratón neonatal. El patrón de localización del virus y las nanopartículas podría detectarse mediante evaluación microscópica o mediante hibridación in situ.

Intracerebroventricular y por inyección intravascular de partículas víricas y fluorescentes microperlas en el cerebro neonatal

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

El objetivo general de este procedimiento es observar la distribución de partículas virales durante la fase aguda de la infección en el sistema nervioso central. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurovirología, como por ejemplo cómo se distribuyen las partículas virales en el sistema nervioso central inmaduro durante la fase aguda de la infección.La principal ventaja de esta técnica es que la distribución inicial de partículas virales puede observarse directamente con un microscopio utilizando dos métodos sencillos, como la inyección intercerebroventricular y la inyección intravascular. Comience por esterilizar una jeringa de 10 microlitros y una aguja de calibre 27 con alcohol al 70 %.Luego, cargue cinco microlitros de la solución inyectable de citomegalovirus murino o microesferas fluorescentes en la aguja, tirando cuidadosamente del émbolo de la jeringa. Después de anestesiar y inmovilizar un ratón neonato PO.5 colocándolo sobre hielo durante tres a cuatro minutos, utilice el método de respuesta al pellizco del dedo del pie para determinar la profundidad de la anestesia. Marque el sitio de inyección en el ratón anestesiado con un bolígrafo de laboratorio no tóxico en una ubicación aproximadamente a 0,7-1,0 mm lateral a la sutura sagital y a 0,7-1,0 mm de distancia del bregma neonatal.Este diagrama muestra el sitio con más detalle. Como referencia, marque 2 mm desde la punta de la aguja con un marcador no tóxico. A continuación, inserte la aguja 2 mm de profundidad, perpendicularmente a la superficie del cráneo, en el sitio de inyección marcado.Luego, inyecte lentamente 5 microlitros de citomegalovirus murino en el ventrículo lateral sin abrir el cuero cabelludo. En otro grupo de ratones, inyecte una solución de 5 microlitros que contiene microesferas fluorescentes mediante el mismo método. Después de la inyección, deje la aguja en su lugar durante 10 a 20 segundos para evitar el flujo de retroceso.Luego retire lentamente la aguja. Permita que los animales inyectados se recuperen durante 5 a 10 minutos en un recipiente cálido hasta que se restablezca el movimiento y la respuesta general. Para la inyección intravenosa, sujete al neonato anestesiado al transiluminador utilizando cinta quirúrgica y visualice luego la vena temporal superficial.A continuación, utilizando lentes de aumento de 1,5x, use una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 35 para infundir lentamente 50 microlitros de virus de citomegalovirus murino en la vena temporal superficial. Repita nuevamente el procedimiento con microesferas fluorescentes del tamaño adecuado en el grupo control. Tras retirar la aguja, use gasa impregnada con alcohol al 70 % para aplicar presión sobre el sitio de inyección hasta que cese la hemorragia.Deje al recién nacido aproximadamente cinco minutos en un recipiente tibio para que se recupere antes de devolverlo a la jaula. Dos horas después de la inyección intracerebroventricular en la fase aguda de infección, las partículas verdes recombinantes de M32 EGFP MCMV se observan principalmente en la zona marginal, como indican las flechas, y en la región ampliada. En este momento, las partículas de M32 EGFP MCMV también se observan en el plexo coroideo y en la zona subventricular.El genoma del MCMV se detecta por primera vez en la zona subventricular a las tres horas posteriores a la inyección intraventricular. Mediante hibridación fluorescente y C2, el genoma del MCV es visible como puntos verdes e indicado por flechas en esta región ampliada. A las tres horas posteriores a la inyección intravenosa, las partículas de MCMV visibles como puntos verdes e indicadas por flechas se encuentran dentro y fuera del área vascular del parénquima, como demuestra esta imagen con mayor aumento.En este momento, las partículas de MCMV aún son visibles en el plexo coroideo y en la zona subventricular. Mediante hibridación fluorescente y C2, el genoma de MCMV se detecta en el área vascular y en las meninges a las 12 horas posteriores a la inyección intravenosa. Como indican las flechas.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco minutos si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo observar la distribución de partículas virales durante la fase aguda de la infección en el sistema nervioso central. No olvide que trabajar con un virus puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de mascarillas y guantes, mientras se realiza este procedimiento.

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Investigación

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El control de la expansión de células madre somáticas es un factor importante que impide su estudio y uso en terapia. Aquí se describe un sistema para controlar temporalmente madre neural expansión células durante el desarrollo y la edad adulta, que se puede utilizar para aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro de ratón.

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Este video muestra el proceso de inyección intracerebroventricular para estudiar la distribución del citomegalovirus murino (MCMV) en el cerebro de ratón neonatal. El MCMV, diseñado para expresar una proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) para mayor visibilidad, se inyecta en el ventrículo lateral del cerebro de un cachorro de ratón. El virus inyectado circula a través del líquido cefalorraquídeo, infectando las células de la región periventricular, incluida la zona marginal, el plexo...

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El citomegalovirus (HCMV) La infección humana de los recién nacidos representa una causa importante de retraso mental, pero los eventos moleculares que conducen a la patogénesis inducida por virus son aún poco conocidos. Para investigar la dinámica de la infección en el cerebro, adaptamos todo...

El uso de<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes para controlar la progresión de la infección por citomegalovirus Experimental del ratón en neonatos

Aquí demostramos una técnica para la transducción neuronal generalizada mediante inyección intraventricular de virus adenoasociados en el cerebro de ratón neonatal.  Este método proporciona una manera rápida y fácil de lograr la expresión de por vida de los transgenes administrados viralmente.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

Los modelos animales de enfermedad pediátrica pueden experimentar aparición temprana y progresión de la enfermedad agresiva. Clínicamente entrega terapia pertinente a jóvenes modelos de ratón puede ser técnicamente difícil. Este protocolo describe un método de inyección intravenosa no invasivo para ratones recién nacidos dentro de los dos primeros días después del parto de la vida.

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Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto

Este protocolo tiene como objetivo demostrar una vía de administración venosa reproducible que pueda ser utilizada en ratas y ratones durante todo el período neonatal. Este procedimiento es importante para los estudios preclínicos en roedores que desean reflejar la administración de fármacos en las unidades de cuidados neonatales, principalmente mediante la administración intravenosa.

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Inyección intratecal de ratón recién nacido para la edición del genoma y la administración de fármacos

Se describe una nueva técnica para la administración generalizada de virus adenoasociados que utiliza la infusión de virus subaracnoideos. Este método no solo asegura la transducción generalizada de las neuronas neocorticales de ratón en las capas superficiales, sino que también da lugar a la expresión selectiva del transgén en las neuronas piramidales de la capa cinco, incluso cuando se utiliza un promotor no selectivo.

Transducción generalizada de neuronas neocorticales de ratón mediante inyección subaracnoidea de AAV2

Aprende a realizar inyecciones intracerebroventriculares e intravasculares de partículas víricas y microperlas fluorescentes en cerebro neonatal de ratón. Este método permite observar la distribución viral durante la fase aguda de infección en el sistema nervioso central.

Intracerebroventricular y por inyección intravascular de partículas víricas y fluorescentes microperlas en el cerebro neonatal

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